分化抑制因子3在胚胎植入中的作用

目的：检测分化抑制因子３（inhibitors of differentiation 3,Id3）基因在小鼠早期妊娠模型和人工诱导蜕膜化模型中子宫内膜中的表达规律;探究Id3基因在小鼠子宫内膜基质细胞蜕膜化过程的作用。方法：应用Western blot及qRT-PCR检测Id3在早期妊娠和人工诱导蜕膜化模型小鼠子宫中的表达;利用分离的原代小鼠子宫内膜基质细胞体外诱导蜕膜化、过表达Id3基因,分析Id3对基质细胞蜕膜化的影响。结果：Id3在小鼠早期妊娠模型中高表达于子宫内膜容受期形成阶段（孕第4天）（P蛋白质=0.001,PmRNA=0.001）,胚胎着床后基质细胞发生分化的蜕膜化子宫中表达较低（PD5蛋白质=0.026,PD5mRNA=0.038）;体内人工诱导蜕膜化小鼠子宫内膜Id3的表达明显低于未发生蜕膜化的对照子宫（P蛋白质=0.005,PmRNA=0.000）;体外人工诱导蜕膜化可抑制Id3基因的表达（P蛋白质=0.000,PmRNA=0.001）;过表达Id3可以明显降低体外子宫内膜基质细胞蜕膜化过程;Stat3信号参与调控Id3的表达调控子宫内膜基质细胞蜕膜化过程。结论：Id3参与小鼠胚胎植入并调控子宫内膜基质细胞蜕膜化过程。     

组氨酸三聚体核苷结合蛋白1(Hint1)在胚胎植入中的作用

目的：检测组氨酸三聚体核苷结合蛋白1（histidine triad nucleotide binding protein 1,Hint1）基因在小鼠早期妊娠过程中子宫内膜中的表达规律;探究Hint1基因在小鼠子宫内膜基质细胞蜕膜化过程的作用。方法：应用免疫组化、原位杂交、Western blot和RT-qPCR检测Hint1在早期妊娠、假孕和人工诱导蜕膜化模型小鼠子宫中的表达;siRNA敲低原代分离的小鼠子宫内膜基质细胞Hint1的表达。LC-MS分析Hint1对基质细胞蜕膜化过程中脂质组学的影响。结果：在妊娠的第1至第8天Hint1表达逐渐升高,且在胚胎植入部位的表达明显高于非植入点;体内人工诱导蜕膜化小鼠子宫内膜Hint1的表达明显高于未发生蜕膜化的对照子宫;利用siRNA干扰小鼠子宫内膜基质细胞中Hint1的表达可显著影响其蜕膜化过程及脂质代谢。结论：Hint1在基质细胞蜕膜化过程中表达升高,并可能与蜕膜化过程中基质细胞的脂质代谢相关。     

混合谱系激酶结构域样蛋白在小鼠妊娠早期子宫及蜕膜中的表达及调控

目的 探讨混合谱系激酶结构域样蛋白（MLKL）在小鼠妊娠早期子宫及蜕膜组织中的表达规律。方法 构建小鼠早期妊娠模型、人工诱导子宫蜕膜化模型、雌二醇和（或）孕酮处理子宫模型;体外培养人子宫内膜基质细胞,应用雌二醇、醋酸甲羟孕酮和二丁酰环腺苷酸诱导其蜕膜化。通过实时荧光定量PCR、原位杂交和蛋白质印迹法分析小鼠早期妊娠子宫、蜕膜化子宫和激素处理子宫中MLKL mRNA和蛋白的表达规律,通过实时荧光定量PCR检测MLKL mRNA在体外诱导的人蜕膜化细胞中的表达。结果 （1）在小鼠早期妊娠子宫中,MLKL mRNA及蛋白在妊娠第1~4天的子宫腔上皮表达量较低且不规律,在妊娠第5天的子宫腔上皮及其周围的蜕膜细胞中表达,妊娠第6~8天主要集中在蜕膜组织中表达,着床后表达量逐日增高并在妊娠第7天达到最高峰,妊娠第8天表达稍有下降。（2）在人工诱导蜕膜化的小鼠子宫中,MLKL mRNA表达量很高,整个蜕膜区域均有表达,而在对照组小鼠子宫中则无明显表达。MLKL蛋白的表达与mRNA相一致。MLKL mRNA在体外诱导的人蜕膜化细胞中的表达量高于对照组,差异有统计学意义（P<0.05）。（3）在孕酮处理的小鼠子宫中MLKL mRNA及蛋白表达量增高,与对照组相比差异有统计学意义（P<0.05）。结论 MLKL受孕酮的调控参与哺乳动物胚胎着床和蜕膜化过程。     

组蛋白甲基化酶MLL1在小鼠围着床期子宫内膜的表达

目的:探讨组蛋白甲基化酶MLL1在小鼠围着床期子宫内膜的表达规律及对胚胎着床的作用。方法:收集妊娠小鼠(D0、D1、D4、D5、D6、D8)子宫内膜,分别采用RT-PCR和Western Blot检测小鼠内膜MLL1 mRNA和蛋白的表达情况,利用免疫组化检测MLL1蛋白的定位;宫角注射MLL1抑制剂进行干预。结果:①MLL1、HOXA10 mRNA的表达量在妊娠后随天数逐渐上升,且在D4达到高峰(P<0. 05),而后逐渐下降;②免疫印迹发现MLL1蛋白,与mRNA表达趋势相同,在小鼠妊娠后上调,D4表达最强(P<0. 05),而后下降;免疫组化发现在D0和D1、D4,MLL1蛋白主要表达于子宫内膜腔上皮和腺上皮;妊娠D5,MLL1主要表达于子宫基质细胞中,妊娠D6、D8主要表达于蜕膜化细胞中;③宫角注射MLL1抑制剂后,与空白组相比,抑制组胚胎着床数量明显减少,并且MLL1 mRNA和蛋白的表达水平低于溶剂组和空白对照组。结论:组蛋白甲基化酶MLL1可能参与了子宫内膜容受性的建立和胚胎植入的过程;还可能参与了胚胎植入后的子宫内膜蜕膜化反应。     

胰岛素样生长因子结合蛋白-4在围植入期小鼠子宫内膜的表达及意义

目的 检测胰岛素样生长因子结合蛋白-4(IGFBP-4)在围植入期小鼠子宫内膜的表达分布及其生物学作用.方法取未孕动情期、真孕及假孕3～6 d小鼠子宫做切片,采用免疫组化SP法检测IGFBP-4在小鼠子宫内膜的表达情况.结果 IGFBP-4在小鼠子宫内膜主要分布于腺上皮细胞、腔上皮细胞、基质细胞及蜕膜细胞.IGFBP-4在真孕组小鼠子宫内膜于孕3 d出现阳性表达;孕4～5 d中等强度表达;孕6 d表达最强,主要分布于整个蜕膜区细胞.未孕动情期小鼠子宫内膜IGFBP-4呈弱表达.假孕组小鼠子宫内膜IGFBP-4只在孕5～6 d有微弱表达.真孕组小鼠子宫内膜IGFBP-4表达明显强于同期假孕组.结论 IGFBP-4在围植入期小鼠子宫内膜持续表达,提示IGFBP-4可能在小鼠胚泡植入过程发挥重要生物学作用.     

Ghrelin 对妊娠小鼠子宫内膜蜕膜化的影响

目的：探讨Ghrelin对妊娠小鼠子宫内膜蜕膜化的影响。方法实验将子宫基质细胞分为3组,每组6孔：（1）对照组（只加培养基）;（2）Ghrelin组（细胞培养液中加入100 ng／mL重组Ghrelin细胞因子）;（3）Gh－relin抗体组（细胞培养液中加入30μg／mL Ghrelin抗体）。通过RT－PCR和免疫组织化学技术,观察Ghrelin及其受体在妊娠小鼠子宫内膜蜕膜化过程中的表达变化;通过子宫基质细胞的分离、培养及宫角注射技术,观察Ghre－lin在离体及在体状态下对妊娠小鼠子宫内膜蜕膜化的影响。结果（1）RT－PCR显示：随着妊娠期和蜕膜化的进展,Ghrelin mRNA表达水平明显升高,至妊娠第8天,其表达水平达到最高。（2）在妊娠第5天,GHS－R蛋白主要表达于腔上皮、腺上皮及胚胎植入位点的蜕膜。至妊娠第6天,其表达水平进一步升高,主要表达于胚胎周围的蜕膜。至妊娠第8天,蜕膜中GHS－R蛋白的表达水平渐进下降。（3）与对照组相比,Ghrelin组子宫基质细胞HoxA10蛋白的表达水平明显升高（P＜0．01）,而Ghrelin抗体组子宫基质细胞HoxA10蛋白的表达水平明显下降（P＜0．01）。（4）与对照组相比,重组Ghrelin对胚胎植入位点没有明显的影响（P＞0．05）,却明显增加的子宫重量（P＜0．05）;对于Ghrelin抗体组,能明显抑制胚胎植入位点,且妊娠子宫重量的明显下降（P＜0．01）。结论Ghrelin具有明显促进妊娠小鼠子宫内膜蜕膜化的作用。     

Rack1在大鼠子宫中的表达

目的：探讨有活性的激酶C受体（Rack1）与胚胎着床及蜕膜化的关系。方法:建立大鼠早期妊娠、假孕、延迟着床和人工诱导蜕膜化模型,收集各种模型的子宫材料,利用免疫组化方法检测Rack1在大鼠子宫中的表达。结果：Rack1在妊娠第6～9天的子宫蜕膜上呈强表达;假孕第6～9天和延迟着床的大鼠子宫腔上皮下基质中无明显的免疫信号,而延迟着床激活胚胎周围的腔上皮下基质中有强的免疫信号。蜕膜化子宫中整个蜕膜区呈强的免疫染色信号。结论：Rack1蛋白的表达与胚胎着床及蜕膜化过程密切相关。     

小鼠围植入期子宫内膜组织中白血病抑制因子蛋白及mRNA的表达

目的：观察小鼠围植入期子宫内膜组织中白血病抑制因子（LIF）表达的变化规律并探讨其与胚胎种植的关系。方法：取真孕、假孕第3、4、5、6天小鼠（n=10）子宫内膜组织,采用免疫组织化学、RT-PCR法分别检测LIF蛋白和mRNA的表达情况,并设未孕小鼠作对照组。结果：小鼠子宫内膜组织中LIF蛋白的表达主要定位在腔上皮和腺上皮。真孕组第3、4、5、6天子宫内膜组织中LIF蛋白和mRNA的表达水平均高于假孕组和对照组（P均〈0.05）,且表达水平在孕4d达高峰（P〈0.05）。结论：LIF表达的峰值与胚胎种植时间一致,可能是子宫内膜容受性的标志;LIF的表达不仅受母体激素的影响,也和胚胎的刺激有关。     

甲基化转移酶抑制剂BIX01294促进小鼠子宫基质细胞迁移、抑制基质细胞蜕膜化

目的 探讨甲基化转移酶抑制剂BIX01294(BIX)对小鼠子宫内膜基质细胞迁移和蜕膜化过程的作用和影响.方法 取妊娠第3.5天小鼠子宫分离培养得小鼠子宫内膜基质细胞,采用细胞划痕运动分析、体外诱导小鼠子宫内膜基质细胞蜕膜化模型及Real-time PCR方法分别从形态学和分子生物学角度观察BIX对小鼠子宫内膜基质细胞迁移及蜕膜化的影响.结果 在一定浓度范围内(BIX≤15μmol/L),小鼠子宫内膜基质细胞的迁移距离随着BIX浓度的升高而增加,与对照组相比,BIX 15μmol/L处理组基质细胞的迁移距离增加最明显,差异具有统计学意义,当BIX浓度提高到20μmol/L时,细胞迁移距离增加不明显,且此时开始出现细胞的死亡;与对照组相比,BIX处理24 h组小鼠子宫内膜基质细胞Ehmt2 mRNA表达显著下调(P<0.01);并且15μmol/L BIX能够抑制小鼠子宫内膜基质细胞蜕膜化反应.结论 一定浓度范围的BIX通过抑制Ehmt2 mRNA在基质细胞中的表达促进小鼠子宫内膜基质细胞的迁移,并且对小鼠子宫基质细胞的蜕膜化过程有抑制作用.     

Dicer基因在早孕小鼠子宫内膜中的表达

目的：检测Dicer基因在早孕小鼠子宫内膜组织中的表达规律,为阐明其在胚胎着床中的作用打下基础。方法：利用实时荧光定量PCR、免疫组化和Western blot分别检测未孕、假孕及孕d1~d7小鼠子宫内膜中Dicer基因mRNA和蛋白质的表达。结果：在小鼠着床窗期及着床后（d4～d7）,小鼠子宫内膜中Dicer基因mRNA和蛋白质表达均明显升高,d5达到高峰（PmRNA=0.000,P蛋白= 0.000）;且Dicer表达主要定位于子宫内膜基质细胞。结论：Dicer基因在早孕小鼠子宫内膜组织中的表达存在时间与空间差异,这种规律性表达所调控的细胞生长、增殖和分化可能是胚胎正常着床的分子机制之一。