碱性成纤维细胞生长因子预诱导对骨髓基质干细胞向多巴胺能神经元分化的影响

目的探讨碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）预诱导对骨髓基质干细胞（MSCs）向多巴胺（DA）能神经元分化的影响。方法取雄性Wistar大鼠股骨和胫骨骨髓，进行MSCs的体外培养、传代扩增及纯化。bFGF预诱导24h后，依据加入的神经营养因子不同分为单唾液酸四己糖神经节苷脂（GMl）组、胶质源性神经营养因子（GDNF）组和GDNF＋GMl组，以及对照组。倒置显微镜下观察细胞形态变化，分别在预诱导第3d、7d进行神经元特异性烯醇化酶（NSE）、神经胶质酸性蛋白（GFAP）、酪氨酸羟化酶（TH）免疫细胞化学检测。计数NSE和TH阳性细胞数，并计算阳性细胞百分比。结果对照组见少量NSE阳性细胞。实验组于诱导第3d、7d见较多数量的NSE、TH阳性细胞，GFAP阴性。bFGF预诱导各组中GDNF＋GMl组NSE、TH阳性细胞率最高，GDNF组次之，GMl组最低，组间比较差异有统计学意义（均P〈0．01）。结论bF—GF预诱导不仅可明显促进GDNF、GMl诱导MSCs向神经元样细胞分化，表达神经元细胞标志物——NSE；还可促进MSCs向DA能神经元分化，表达DA能神经元标志物——TH。     

成年骨髓间质干细胞体外诱导分化成神经细胞研究

目的：探索成年骨髓间质干细胞（ABMMSC）诱导分化为神经细胞（神经元和神经胶质细胞）的可行性，为ABMMSC在神经科学领域内的应用提供 参考。方法：以成年犬ABMMSC为实验对象，利用碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）、表皮生长因子（FGF）、维甲酸（RA）、脑源性神经营养因子（BDNF）、胶质细胞系源性神经营养因子（GDNF）等作为增殖及分化诱导因子，采用两步法进行增殖培养，分化诱导；免疫细胞化学法进行细胞性质鉴定。结果：加入bFGF、EGF后增殖培养48h，换液、去除非粘附细胞，再增殖培养72h ,可见细胞分裂相（成纤维细胞样细胞）和簇样克隆形成（中小型细胞）。加入RA、BDNF、GDNF诱导3d，部分细胞有神经元特异性烯醇酶（NSE）、胶质纤维酸性蛋白（GFAP）成分表达；第10d可见有神经元、神经胶质形态样细胞形成。经细胞成分（NSE、GFAP）鉴定证实为神经元、神经胶质细胞。结论：ABMSC在体外培养条件下，经过bFGF、EGF、RA、BDNF、GDNF等因子的“程序性”作用，可以向神经元、神经胶质前体细胞及其终末细胞方向分化。     

GDNF诱导分化骨髓基质细胞对PD大鼠的治疗作用

目的探讨胶质细胞源性神经营养因子（GDNF）诱导分化骨髓基质细胞（BMSCs）脑内移植对帕金森病（PD）模型的治疗作用。方法体外培养、分离和纯化的BMSCs，用5-溴脱氧尿核苷（BrdU）标记和GDNF诱导分化。分别将经GDNF诱导分化（A组）和未经GDNF诱导分化（B组）的BMSCs移植到PD大鼠模型纹状体区。另设生理盐水对照组（C组）和PD模型对照组（D组）。于不同时间点检测大鼠旋转行为变化，运用免疫荧光组织化学方法分析比较各组纹状体内酪氨酸羟化酶（TH）阳性细胞数量。结果①旋转行为检测显示，C组和D组在所有时间点未见明显变化；在移植后7～30d，A组和B组分别与C组和D组比较，旋转行为明显减少（P〈0．05）；A组比B组旋转行为减少更为显著（P〈0．05）。②免疫荧光组织化学检测显示，A组与B组比较，GFAP和TH阳性细胞数量明显增多（P〈0．05）。但各组自身各时程比较数量变化无统计学意义（P〉0．05）。结论A组的BMSCs脑内移植有效地改善了PD大鼠模型的旋转行为，提高了移植后TH阳性细胞的数量。     

GDNF和NO对局灶性脑缺血大鼠皮质和尾壳核神经干细胞增殖和分化的影响

目的观察胶质细胞源性神经营养因子（GDNF）对局灶性脑缺血大鼠皮质和尾壳核神经干细胞（NSCs）增殖分化以及nNOS阳性神经元分布的影响，探讨GDNF和NO对内源性NSCs增殖分化影响的作用机制。方法制作右侧局灶性脑缺血模型，左侧脑室注射GDNF，5-溴脱氧尿嘧啶（BrdU）标记DNA合成期（S期）细胞，免疫组化观察正常组、假手术组、脑缺血组、生理盐水组和GDNF组大鼠局灶性脑缺血90min后再灌注时间分别为3d、7d、14d、21d、28d的BrdU／nNOS、BrdU／NeuN、BrdU／GFAP双标阳性细胞。结果GDNF组较脑缺血组和生理盐水组行为学恢复明显；脑缺血后皮质和尾壳核BrdU和nNOS阳性细胞增多，BrdU／nNOS（38．23％±6．87％）、Br—dU／NeuN（52．38％±13．29％）、BrdU／GFAP（13．51％±8．78％）双标细胞阳性率明显增加，与其它组比较均有显著性差异（P〈0．05）。结论局灶性脑缺血激活内源性NSCs，GDNF可调节NO释放，促进NSCs增殖、分化。     

骨髓源性神经干细胞诱导分化为多巴胺能神经元的实验研究

目的探索骨髓基质细胞(BMSCs)诱导分化为神经干细胞及多巴胺能神经元的分化条件和发生机制,比较不同血清浓度、不同白介素-1(IL-1α)及不同胶质细胞源神经营养因子(GDNF)浓度及不同组合浓度等诱导条件下BMSCs分化情况;为BMSCs在神经科学领域内的应用奠定基础。方法以成年SD大鼠BMSCs为实验对象,利用IL-1α、胶质细胞系来源GDNF等作为增殖及分化诱导因子,进行增殖培养、分化诱导;免疫细胞法进行细胞性质鉴定。结果加入GDNF、IL-1 α增殖培养诱导6 d,部分细胞有神经巢蛋白成分表达;三周测出 DA受体D2检测阳性,GDNF IL-1α组与 GDNF组及IL—1α组比较分化率更加显著(P<0．05)。结论 BMSCs在体外培养条件下,联合GDNF 和IL-1α诱导分化并配合使用高浓度血清(10％)可获得神经巢蛋白阳性的神经前体细胞及表达D2受体阳性的多巴胺能神经元;骨髓源性神经干细胞可以诱导分化为多巴胺能神经元。     

恒河猴骨髓基质细胞向成熟神经细胞分化的实验研究

目的研究恒河猴骨髓基质细胞(BMSCs)在体外向神经细胞诱导分化过程中神经递质分泌和神经细胞抗原表型表达情况。方法无菌条件下密度梯度法分离猴BMSCs,在体外应用神经干细胞培养液进行体外培养和诱导分化,分阶段用高效液相色谱法检测培养基中单胺类生物活性物质的含量,免疫细胞化学方法检测神经细胞抗原表型。结果高效液相检测神经干细胞培养基未测到单胺类生物活性物质,而经体外培养增殖10d、14d、30d的细胞培养基可检测到去甲肾上腺素 (NE)和多巴胺(DA)。Asp方差分析显示:随着BMSCs培养天数的增加,培养基中所含的NE和DA尤显著性差异(P>0．05)。同期细胞免疫组化检测出酪氨酸羟化酶(TH)、巢蛋白抗体(nestin)、β-微管蛋白 (β-tublin)、胶质原性纤维酸性蛋白抗体(GFALP)和神经元特异烯醇化酶(NSE)抗原表达。结论恒河猴BMSCs能在体外增殖,在适宜条件下能分化成神经元样细胞,并合成、分泌NE和DA;部分细胞表达神经干细胞、成熟神经元、胶质细胞和DA能神经元的抗原表型,提示在一定条件下,诱导分化的 BMSCs经过神经干细胞阶段可向成熟神经组织细胞分化。     

抗坏血酸联合胶质细胞源性神经营养因子诱导神经干细胞向多巴胺能神经元分化的研究

目的 研究抗坏血酸(AA)和胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)对神经干细胞向多巴胺能神经元分化的影响.方法 从新生24h内的sD大鼠脑组织分离和培养神经干细胞,进行神经干细胞鉴定.第二代神经干细胞诱导培养基中分别给予AA或(和)GDNF,10d后终止诱导,进行DA能神经元特异性标记物酪氨酸羟化酶(TH)和多巴胺转运蛋白的免疫细胞化学检测和TH基因的RT-PCR检测.结果 各诱导组均检测到TH mRNA的表达;与对照组比较,AA及GDNF均能增加NSC向TH阳性细胞分化的比率(P<0.05);与单独运用100μmol/LAA或10ng/mlGDNF组比较,联合诱导组可明显提高NSCs向TH阳性细胞分化的比率(P<0.05).结论 AA和GDNF均能促进NSCs向DA能神经元分化,两者联合诱导后分化作用得到进一步加强.     

GDNF和GM1体外联合诱导骨髓基质干细胞向多巴胺能神经元分化的实验研究

目的应用GDNF和GM1体外联合诱导MSCs转化为多巴胺能(DA)神经元。探索体外诱导MSCs定向分化为DA能神经元的最佳条件。方法取雄性Wistar大鼠股骨和胫骨骨髓,密度梯度离心法分离获取单个核细胞。进行MSCs的体外培养和传代扩增。采用贴壁培养法使MSCs得到纯化。依据加入的神经营养因子不同分为对照组及实验组(GM1组、GDNF组、GDNF GM1组)。诱导过程中在倒置显微镜下观察细胞形态变化,分别在诱导第3天、第7天进行NSE、GFAP、TH免疫细胞化学检测。计数NSE和TH阳性细胞数,并计算阳性细胞百分比。采用SPSS10.0软件进行统计学处理。结果对照组可见少量NSE阳性细胞。各实验组比较发现,GDNF GM1组NSE阳性细胞率最高,GDNF组次之,GM1组最低。单独应用GDNF和GM1不能诱导MSCs表达TH,联合应用GDNF和GM1可诱导MSCs表达TH。随着诱导时间的延长,TH阳性表达增加。结论GDNF能够单独诱导MSCs向神经元样细胞分化,GM1不能单独诱导MSCs分化为神经元样细胞,但与GDNF联合,不仅可明显促进MSCs向神经元样细胞分化,而且部分细胞能够表达TH。     

音速波状蛋白促进骨髓间充质干细胞向多巴胺能神经元分化

目的探讨音速波状蛋白（Shh）促进人骨髓间充质干细胞（MSCs）体外定向分化为多巴胺能神经元样细胞的作用。方法体外分离、扩增和鉴定人骨髓MSCs。采用不同诱导方案诱导MSCs向神经元和多巴胺能神经元样细胞定向转化后,进行抗神经巢蛋白（Nestin）、神经元特异烯醇化酶（NSE）、神经胶质纤维酸性蛋白（GFAP）、酪氨酸羟化酶（TH）和多巴胺转运体（DAT）等免疫细胞化学染色,并计算阳性细胞百分率。结果实验组诱导后MSCs能分化为具有典型神经元形态的细胞,可见NSE、Nestin、GFAP、TH和DAT等神经细胞标志表达;对照组MSCs细胞形态无明显变化,上述特异性标志物表达均为阴性。实验2组（诱导方案含Shh）与1组（诱导方案不含Shh）的NSE、Nestin、GFAP阳性细胞百分率的差异无统计学意义,但实验2组TH和DAT阳性细胞百分率明显高于实验1组,差异具有统计学意义（P〈0.05）。结论Shh可促进MSCs分化为多巴胺能神经元样细胞。     

骨髓基质细胞源性神经干细胞体外分化及电生理特性的研究

目的探索骨髓基质细胞(BMSCs)诱导分化为神经干细胞(NSCs),比较血清、维甲酸(RA)、胶质细胞源神经营养因子(GDNF)、脑源性神经营养因子(BDNF)及2-巯基乙醇(2-ME)等不同浓度诱导条件下BMSCs分化情况,以及分化细胞的电生理特性。方法以恒河猴骨髓中分离出的BMSCs为实验对象,利用神经干细胞培养基和RA、GDNF、BDNF、2-ME等生长因子在不同血清浓度下进行培养增殖和诱导分化。Nestin、CD133抗体免疫细胞化学染色鉴定NSCs,NSE、β-tublin鉴定神经元、GFAP鉴定神经胶质细胞。膜片钳检测细胞的电生理特性。结果低浓度血清(2.5%)+RA(0.3mg/L)+GDNF(20μg/L)诱导分化效果较好,且分化的神经元样细胞较未分化细胞的膜特性[静息膜电位(RMP)、膜电容(Cm)、串联电阻值(Rs)]有了显著改变(P﹤0.01)。部分形态成熟的神经元样细胞表现出TTX敏感的快速激活、快速失活的电压依赖性的Na+通道,而未分化细胞却未记录到内向电流;两类细胞均可记录到外向的K+电流,但神经元样细胞的电流峰值强度要显著高于未分化细胞,并且包括两种电流成分:瞬时外向K+电流和延迟整流型的K+电流。结论RA+GDNF及配合使用低浓度血清能够有效诱导骨髓源神经干细胞向成熟神经系细胞分化,且分化的神经元样细胞具有快速激活、快速失活的电压依赖性Na+通道,类似神经细胞的电生理特性。     

骨髓间充质干细胞向多巴胺能神经元的诱导分化

背景：近年来研究发现,神经营养因子在骨髓间充质干细胞的分化中发挥重要作用。目前脑组织中具有再生能力的神经干细胞在体外是否具有直接诱导骨髓间充质干细胞分化为多巴胺能神经元的作用还未见报道。 目的：观察大鼠间充质干细胞在胶质细胞源性神经营养因子与神经干细胞共培养两种诱导条件下体外分化成多巴胺能神经元的能力。 方法：分离培养SD大鼠骨髓间充质干细胞,取第3代细胞分2组培养,一组细胞应用胶质细胞源性神经营养因子单独诱导,另一组细胞与已培养成球的神经干细胞共培养进行诱导,共培养之前行Brdu标记。诱导3 d后以免疫组织化学法检测各组贴壁细胞神经元特异性标志物神经原纤维和多巴胺能神经元特异性标志物酪氨酸羟化酶的表达,观察间充质干细胞的分化情况。 结果与结论：胶质细胞源性神经营养因子单独诱导组间充质干细胞在诱导24 h后胞体回缩呈锥形,突起延长且数量增多,有神经元样形态,且细胞间相互连接成网络状,3 d后部分细胞表达神经原纤维,其中少部分同时表达酪氨酸羟化酶。与神经干细胞共培养组神经干细胞球很快解离,迅速贴壁,共培养的贴壁细胞大量增殖且多呈神经元样,胞体细长多突起,相互间连接成网,多数贴壁细胞分别单独表达神经原纤维和酪氨酸羟化酶,少数细胞可见Brdu/神经原纤维,Brdu/胶质纤维酸性蛋白,Brdu/酪氨酸羟化酶双标阳性。提示间充质干细胞在胶质细胞源性神经营养因子、神经干细胞存在的情况下可定向转化为神经元,并有向多巴胺能神经元分化的可能。在该实验条件下胶质细胞源性神经营养因子效果好于神经干细胞。     

Therapeutic effects of differentiated bone marrow stromal cell transplantation on rat models of Parkinson's disease

This study was to explore curative effect of bone marrow stromal cells (BMSCs) differentiated into nestin-positive cells transplantation on rat Parkinson's disease (PD) model. The PD rats were selected and allocated randomly into three groups. BMSCs with differentiation, BMSCs without differentiation and physiological saline were injected into right striatum of PD rat. The rotation test and immunofluorescence double staining were done. Frequency of rotation was significantly less in differentiated or non-differentiated BMSCs groups than that in normal saline group. Brdu/GFAP- and Brdu/NSE-positive cells appeared except BrdU/TH-positive cells. BMSCs differentiated had better effect than that of BMSCs without differentiated and physiological saline group.     

丹参诱导大鼠骨髓间充质干细胞分化为神经元样细胞中的钙离子检测

目的 检测大鼠骨髓间充质干细胞经丹参注射液诱导分化的神经元样细胞内钙离子浓度,以期为骨髓间充质干细胞应用于神经系统疾病的治疗提供理论依据.方法 从成年大鼠骨髓中获取骨髓间充质干细胞,体外扩增培养,经碱性成纤维生长因子预诱导后施加10mL/L丹参注射液于骨髓间充质干细胞培养液中.运用免疫荧光检测神经元特异性核蛋白(NeuN)在诱导后细胞与经新生大鼠海马获取的体外培养海马神经元中的表达.激光共聚焦技术检测诱导后的细胞内钙离子浓度.并与原代培养海马神经元内的钙离子浓度进行比较.结果 大鼠骨髓间充质干细胞经碱性成纤维生长因子和丹参注射液处理后,可表达NeuN,并具有神经元样的表型.诱导分化的神经元样细胞内钙离子浓度为984.75±79.51,原代培养海马神经元内钙离子浓度为769.42±60.93,两者比较差异无统计学意义(P>0.05).结论 丹参注射液诱导骨髓间充质干细胞分化的神经元样细胞具有神经元的某些特征.     

骨髓基质干细胞向神经元样细胞分化前后BMP4基因差异表达的初步研究

目的初步探讨骨髓基质干细胞（BMSC）向神经元样细胞分化前后骨形态发生蛋白4（BMP4）基因的表达变化情况。方法体外培养大鼠BMSC,用碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）和表皮生长因子（EGF）对其进行诱导,分别于诱导前和诱导后第7天行基因芯片检测BMP4基因表达水平,并采用实时定量PCR进行验证。结果在BMSC向神经元样细胞诱导分化后的芯片表达谱中,BMP4基因的表达明显上调,且实时定量PCR亦证实此结果。结论在BMSC向神经元样细胞的分化过程中,BMP4基因可能发挥着重要的作用。     

Cell death and long-term maintenance of neuron-like state after differentiation of rat bone marrow stromal cells: a comparison of protocols

Recent literature suggests that bone marrow stromal cells (BMSCs) may be differentiated into neuron-like and/or glia-like cells, implying that differentiated BMSCs may have potential use in cell replacement therapy for central nervous system disorders. However, many questions remain concerning the nature of BMSCs differentiated to express CNS antigens. For example, how long after differentiation do cells express CNS markers, and do differentiation procedures alter cell viability? This study compared neuronal differentiation methods in sister cell preparations, evaluating cell death and maintenance of the CNS antigen positivity after the Deng or Woodbury methods. Rat BMSCs were harvested, passaged, differentiated, placed in growth or maintenance media, and processed for cell viability or immunocytochemistry for NeuN and GFAP post-differentiation. We report that the Woodbury differentiation protocol produced maximally 51% neuron-like cells, yet also produced significant cell death. The Deng differentiation method produced 13% neuron-like cells and without marked cell death. No significant increases in GFAP immunoreactivity (IR) were seen after differentiation by either protocol. Following both protocols, removal of cells from the maintenance media significantly decreased expression of NeuN. Thus, differentiation procedures may be substantially affected BMSC potential, and maintenance of immunoreactivity to neuronal antigens was dependent on specific, nonphysiological environmental conditions.     

成年大鼠骨髓基质干细胞诱导分化为神经元样细胞不同方法比较的研究

目的 研究成年大鼠骨髓基质干细胞(BMSCs)诱导分化为神经元样细胞不同的方法，寻找它向神经细胞分化的最佳条件。方法 取纯度较高的BMSCs，通过不同的神经营养因子诱导法和抗氧化剂诱导法，进行抗巢蛋白(nestin)、神经元特异烯醇化酶(NSE)、神经胶质纤维酸性蛋白(GFAP)、酪氨酸羟化酶(TH)免疫细胞化学染色，观察相应的阳性细胞数。结果 诱导第3天A组(EGF：表皮生长因子，bFGF：碱性成纤维细胞生长因子，RA：全反式维甲酸)，B组(GDNF：胶质细胞系源性神经营养因子，BDNF：脑源性神经营养因子)，C组(EGF，bFGF，GDNF，BDNF和RA)的Nestin阳性细胞数较多，其中以C组最多，而D组(抗氧化剂)Nestin阳性细胞数少于前三组。A，B，C组的NSE，GFAP染色阳性细胞数较D组少，但D组有部分细胞发生死亡。诱导第7天A，B，C组的NSE，GFAP阳性细胞数较第3天时明显增多，C组最多，B组其次，Nestin阳性细胞数比例较第3天时明显减少。而D组的NSE，GFAP阳性细胞数少于其第3天时；C组诱导成神经细胞比例较高，阴性对照组和空白对照组极少或无阳性细胞。此外，神经营养因子诱导法生成神经样细胞的比例都多于胶质样细胞。结论 抗氧化剂诱导法分化诱导快，而神经营养因子诱导法分化诱导效率高，诱导后细胞生长状态明显好于前者，各种神经营养因子联合作用影响BMSCs的增殖和分化。     

海马神经元条件培养液体外诱导大鼠骨髓间质干细胞向神经元样细胞和神经胶质样 细胞的分化：与含b-FGF培养基和无血清培养基的比较*☆

背景：目前关于骨髓间质干细胞能否向神经元方向分化的报道不多,且争论多集中在分化后的神经元是否仅具有神经元形态而不具有神经元功能。 目的：探讨海马神经元条件培养液诱导大鼠骨髓间质干细胞向神经元样细胞和神经胶质样细胞分化的可能性。 方法：将第5代大鼠骨髓间质干细胞分为4组：条件培养基组加入海马神经元和胶质细胞的培养液;b-FGF组加入含b-FGF的DMEM培养基;无血清培养组加入含Neurobasal和B27的无血清培养基;阴性对照组加入含胎牛血清的DMEM。各组诱导12,24 h后,应用免疫细胞化学染色行神经元特异性烯醇化酶、微管相关蛋白2、胶质纤维酸性蛋白的鉴定,Western-blot法检测细胞神经元特异性烯醇化酶、微管相关蛋白2和胶质纤维酸性蛋白的表达。 结果与结论：诱导12,24 h后,条件培养基组、b-FGF组、无血清培养组骨髓间质充干细胞微管相关蛋白2、胶质纤维酸性蛋白、神经元特异性烯醇化酶均呈阳性表达,阴性对照组未见表达。与阴性对照组比较,诱导后24 h,条件培养基组、b-FGF组、无血清培养组微管相关蛋白2表达均明显增强(P < 0.05),且条件培养基组增强幅度显著高于另两组(P < 0.05);条件培养基组、b-FGF组、无血清培养组神经元特异性烯醇化酶及胶质纤维酸性蛋白表达无明显差异。结果证实海马神经元条件培养液可体外诱导大鼠骨髓间质干细胞分化为神经元样细胞和神经胶质样细胞,与含b-FGF的培养基和无血清培养基相比,海马神经元条件培养基诱导的神经元和神经胶质细胞阳性率最高。