兔骨髓源性神经干细胞分化为成熟神经元样细胞的特征研究

目的：探讨兔骨髓源性神经干细胞(bone marrow stromal cells，BMSCs)经体外培养及诱导分化成的神经元样细胞，能否合成分泌5-羟色胺神经生物活性物质成分。方法：分离兔BMSCs，应用神经干细胞培养液和分化诱导因子进行体外培养和诱导分化，免疫细胞化学鉴定；并应用高效液相色谱法(HPLC)检测其5-羟色胺生物活性物质的含量。细胞培养所涉及的细胞因子主要有脑源性神经营养因子(BDNF)和维A酸。结果：BMSCs培养12d可见大而圆细胞，免疫细胞化学鉴定Nestin抗原阳性；培养20d可见长突起神经元样细胞，神经核蛋白(NeuN)免疫细胞化学检查阳性，高效液相检测BMSCs、空白神经干细胞培养液及L-02肝细胞阴性对照组未测到5-羟色胺生物活性物质，经体外培养增殖14d的神经干细胞及培养液、体外诱导分化20d的神经元样细胞及培养液则可检测到5-羟色胺分别为：每1&;#215;10^7细胞中(1．7940&;#177;0．0095)，(4．010&;#177;0．1170)μg／L，差异有非常显著性意义(t=30．6323，P=0．001)。方差分析显示：随着骨髓基质细胞培养天数的增加，其所含的5-羟色胺浓度也渐增加，组间5-羟色胺含量差异有显著意义(P＜0．01)。结论：兔BMSCs能在体外增殖，并表达Nestin抗原；而且，在适宜条件下能分化成神经元样细胞，并表达成熟神经元特异性核蛋白，合成、分泌5-羟色胺神经递质。     

大鼠海马CA3区内神经元和星形胶质细胞的空间形态

背景：星形胶质细胞能够积极参与脑内的神经活动，与神经元之间存在双向的空间信息联系。目的：观察大鼠海马CA3区神经元锥体细胞及其周围星形胶质细胞的分布，重塑两之间的三维构象。设计：以实验动物为研究对象，随机对照的实验研究。单位：一所大学医院的神经外科、一所军医大学的神经科学研究所。材料：实验2001-10／2003-06在南方医科大学珠江医院神经外科和解放军第四军医大学全军神经科学研究所完成。出生30d的SD雄性大鼠由解放军第四军医大学实验动物中心提供。方法：采用脑片膜片钳全细胞记录、细胞内荧光黄染色、免疫荧光和激光共聚焦显微镜相结合的技术。主要观察指标：主要观察神经元的放电类型及其周围星形胶质细胞的空间分布。结果：根据放电形式的不同主要把海马锥体细胞分为两类：位相型和非位相型放电神经元。激光共聚焦显微镜下单层光学图像和三维立体重建显示许多星形胶质细胞紧密围绕在细胞内荧光黄染色锥体细胞周围并形成紧密接触。两类神经元与星形胶质细胞形成接触的部位存在区别。非位相型放电神经元的树突和胞体周围都有许多星形胶质细胞形成接触的部位，而位相型放电神经元则仅位于树突。结论：不同特性海马神经元周围星形胶质细胞的空间分布可能存在差异。     

自体骨髓源神经干细胞移植加矫形手术治疗脑性瘫痪上肢重度痉挛性畸形1例:2年随访

目的:观察应用矫形手术,自体骨髓源神经干细胞移植并正中神经部分切断方法治疗重型脑性瘫痪上肢痉挛患儿,探讨其在降低肌张力的同时,提高肌力和手指功能的修复作用。方法:选择广东省第二人民医院2002-02确诊为重型脑性瘫痪后遗右上肢肘、腕关节严重痉挛和屈曲挛缩畸形的患者1例。男,12岁,病程12年。采用韦氏儿童智力量表评定患儿智商为55分(90～109分为平常;80～89分为低于平常;70～79分为边界;<69分为智力缺陷),应用巴氏指数(共10项,每项10分,评分越高,日常生活自理能力越强)评估患儿残疾自理能力45分,左上肢可支撑协助爬行。右上肢肌张力Ⅲ级,肘关节屈曲挛缩45°,腕关节屈曲挛缩105°,右腕骨质轻度畸形,右手不能持匙和分指。双下肢肌张力Ⅲ级,髋、膝、距小腿(踝)关节均有屈曲挛缩。对此患儿的治疗方案监护人知情同意。采用矫形手术:①上肢矫形手术:行屈腕屈指肌起点下移和尺侧屈腕肌腱背移;②术后2个月行右上肢正中神经部分切断和自体骨髓源神经干细胞移植。自患儿右髂后上棘取骨髓12mL,用梯度密度离心法获取骨髓基质细胞,接种于含维甲酸和碱性成纤维细胞生长因子的神经干细胞培养基中,连续培养11d后移植。取右腋窝纵切口,显露正中神经后切开神经外膜,将正中神经在神经外膜内切断一半,缝合外膜将培养好的干细胞注入外膜内,周围用凝胶海绵包埋,滴2mL神经节苷脂于凝胶海绵上,逐层缝合切口。治疗后采用改良Ashworth评定标准评定肌张力(0级:无肌张力增加;Ⅰ级:肌张力轻度增加;Ⅱ级:肌张力较明显增加;Ⅲ级:肌张力严重增高;Ⅳ级:强直)。结果:①上肢矫形手术2个月后复查右上肢,屈肘屈腕挛缩好转,但屈肘屈腕肌痉挛状态无改善,右手指随意伸屈功能无好转。②由于屈肘屈腕挛缩有复发趋向,因此决定行右上肢正中神经部分切断和自体骨髓源神经干细胞移植。③移植术后1周、2周、1个月时检查右上肢屈肘、屈腕、屈指肌张力低于正常,右手腕屈曲和手指屈曲肌力下降到Ⅱ级,正中神经支配区域感觉迟钝。但肘关节屈曲挛缩和腕关节屈曲挛缩均消失,右手也不能持匙,不能分指,手指不能夹纸。3个月后右上肢屈肘、屈腕、屈指肌张力,以及右手腕的屈曲和抓握肌力开始恢复。18个月后右手腕和手指屈曲肌力达到Ⅳ级,可持匙进食,可夹纸,肌张力和感觉基本正常,患儿可扶单拐行走,右上肢屈肌痉挛状态未见复发,2年后复查右手腕指屈伸功能仍在改善中。结论:本例脑性瘫痪患者所致肘、腕关节严重痉挛和屈曲挛缩,行正中神经部分切断和自体骨髓源神经干细胞移植后,不但降低了屈肌痉挛的状态,而且改善了正中神经部分切断后腕手指屈曲无力和感觉异常。说明此方法不仅有利于周围神经横断缺损感觉运动功能的修复,而且对肌痉挛状态具有较好的作用。     

慢病毒介导增强型绿色荧光蛋白基因修饰人骨髓基质细胞

背景：原代细胞的转染效率低下一直是制约其发展的主要因素之一,慢病毒转染以其独特的优势成为各种干细胞基因修饰良好的转染方法。目的：验证慢病毒载体介导增强型绿色荧光蛋白基因修饰人骨髓基质细胞的可行性。方法：将携带增强型绿色荧光蛋白基因的慢病毒在含血清或无血清条件下按不同的MOI值分别转染人骨髓基质细胞,长期观察荧光蛋白表达情况。将经修饰的细胞通过立体定向移植入大鼠纹状体内,观察移植细胞的存活及目的基因的表达情况。结果与结论：基因转染48h后,可见人骨髓基质细胞成功表达绿色荧光蛋白,无血清条件下的转染效率高于含血清条件下的转染效率,转染成功的细胞在体外持续培养2个月以上未见明显的荧光消减。转染后的细胞可在大鼠纹状体存活并持续表达绿色荧光蛋白2个月以上。提示慢病毒是一种高效的转染人骨髓基质细胞的载体,慢病毒载体介导增强型绿色荧光蛋白基因转染可以作为人骨髓基质细胞的示踪标志用于体内移植研究。     

针对性心理护理对老年妇科

由于老年女性独特的心理和生理状况,加之患病和入院治疗给患者带来的生理上的不适和心理上的应激,影响了患者的生活质量.本研究结合我院针对性心理护理的58例老年妇科手术患者的护理经验,探讨如何做好老年妇科手术患者的心理护理工作.     

介入性超声穿刺硬化治疗卵巢囊肿的护理

近年来,随着阴道超声技术的发展,超声引导下介入治疗卵巢囊肿已受到越来越多学者的重视。我们采用超声引导下穿刺抽液无水乙醇硬化治疗卵巢囊肿116例,取得满意的临床效果,现将护理体会报告如下。     

慢病毒介导增强型绿色荧光蛋白基因修饰人骨髓基质细胞***☆

背景：原代细胞的转染效率低下一直是制约其发展的主要因素之一,慢病毒转染以其独特的优势成为各种干细胞基因修饰良好的转染方法。 目的：验证慢病毒载体介导增强型绿色荧光蛋白基因修饰人骨髓基质细胞的可行性。 方法：将携带增强型绿色荧光蛋白基因的慢病毒在含血清或无血清条件下按不同的MOI值分别转染人骨髓基质细胞,长期观察荧光蛋白表达情况。将经修饰的细胞通过立体定向移植入大鼠纹状体内,观察移植细胞的存活及目的基因的表达情况。 结果与结论：基因转染48 h后,可见人骨髓基质细胞成功表达绿色荧光蛋白,无血清条件下的转染效率高于含血清条件下的转染效率,转染成功的细胞在体外持续培养2个月以上未见明显的荧光消减。转染后的细胞可在大鼠纹状体存活并持续表达绿色荧光蛋白2个月以上。提示慢病毒是一种高效的转染人骨髓基质细胞的载体,慢病毒载体介导增强型绿色荧光蛋白基因转染可以作为人骨髓基质细胞的示踪标志用于体内移植研究。     

CatWalk步态分析系统分析大鼠大脑中动脉阻塞模型的行为学特征

目的 探讨以CatWalk步态分析系统对大鼠暂时性大脑中动脉阻塞(MCAO)模型进行行为学评价的可行性.方法 30只SD雄性大鼠按随机数字表法分为MCAO模型组和对照组,其中模型组以线栓法制作成暂时性MCAO模型.分别于模型制作后第1、3、7、14、28天应用传统的18分制mNSS评分以及CatWalk步态分析系统对2组大鼠进行行为学特征分析.结果 CatWalk结果 显示MCAO模型组大鼠的四肢压强、接触面积和运行速度均比对照组大鼠减小减慢;在协调性方面,模型组大鼠造模后第3天时同为后侧的左后肢→右后肢的时间较对照组明显缩短,且其同为左侧的左前肢→左后肢的时间亦较对照组明显缩短,这一变化在第28天时仍然存在;在造模后第3天模型组出现了在对照组中并未见到的Ra型(1.5％)和Rb型(2.3％)步序;但步调、站立时间、抬爪时间和规律指数等参数在2组间差别不明显.结论 CatWalk步态分析系统在压强、速度、接触面积、步态以及协调性等方面可反映脑缺血造成的损伤及其随时间变化的过程,可用于动物模型的多种行为学特征的综合分析.     

绿色荧光蛋白转基因小鼠骨髓基质细胞体外诱导分化为神经元样细胞

目的 研究绿色荧光蛋白转基因小鼠骨髓基质细胞(GFP-GM-BMSCs)在体外无血清培养基+神经细胞因子诱导条件下,向神经细胞分化的能力。方法 用贴壁法体外培养GFP-GM-BMSCs,取第3代GFP-GM-BMSCs,用含浓度均为20μg/L的表皮生长因子(EGF)和碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）的无血清培养基（neurobasal-A+2%B27）诱导分化。第5天用免疫细胞荧光方法检测巢蛋白(nestin)的表达,第10天用神经元烯醇化酶 (NSE)、神经胶质纤维酸性蛋白(GFAP)免疫细胞化学方法鉴定阳性细胞。结果 GFP-GM-BMSCs经无血清培养基+神经细胞因子诱导后,细胞胞体变圆,伸出细长突起, 有的突起连接成网,呈神经元样形态。诱导第5天,nestin阳性表达的细胞为40.24%+5.09%;第10天,NSE阳性、GFAP阳性的细胞分别为36.43%+5.27%和49.73%+6.28%。 结论 GFP-GM-BMSCs在体外含EGF、bFGF的无血清培养基中,能分化成神经元样细胞。     

炎性介质阻断剂对大鼠脑缺血再灌注损伤后神经功能缺损、细胞凋亡及半胱氨酸蛋白酶-3表达的影响

目的探讨炎性介质阻断剂AG490对大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤后神经功能缺损、细胞凋亡及半胱氨酸蛋白酶-3(caspase-3)表达的影响。方法雄性SD大鼠被随机分为假手术组、缺血再灌注组、生理盐水组、AG490组;采用大脑中动脉线栓法制作大鼠局灶性脑缺血再灌注模型;AG490组于脑缺血即刻及再灌注后12 h分别腹腔注射AG490 1 mg/kg。再灌注24 h后对各组大鼠进行神经功能缺损评分;利用原位缺口末端标记法(TUNEL法)检测神经细胞凋亡数;应用Western Blot法检测各组脑组织磷酸化酪氨酸蛋白激酶(P-JAK2)、磷酸化信号转导和转录激活因子(P-STAT3)、caspase-3表达。结果与缺血再灌注组及生理盐水组比较,AG490组大鼠神经功能缺损评分明显减低(均P<0.05);凋亡细胞数及P-JAK2、P-STAT3、caspase-3表达明显减少(均P<0.01)。结论AG490可阻断JAK2/STAT3细胞因子信号转导通路,有效抑制caspase-3表达,减轻缺血灌注损伤后神经细胞凋亡,改善神经功能缺损症状。