不同来源成体神经干细胞促进大鼠脊髓损伤功能修复的比较研究

目的 评价大脑、骨髓和脂肪组织3种不同来源的神经干细胞对大鼠脊髓挫伤的治疗效果.方法 选取来源于同一大鼠成体中大脑、骨髓和脂肪的3个部位的组织,分离、诱导分化为不同来源的神经干细胞;应用自由落体损伤模型装置造成大鼠脊髓挫伤.将不同来源的神经干细胞分别移植入大鼠脊髓损伤部位,通过BBB评分比较修复脊髓损伤功能的效果,应用免疫荧光染色检测不同移植细胞在损伤脊髓中的存活、分布、迁移的情况.另设假手术对照组和生理盐水对照组.结果 与假手术对照组和生理盐水对照组比较,3个细胞处理组BBB评分在2～8周开始增加,9周以后更加明显,差异开始有统计学意义(P<0.05).在移植后1周和4周,细胞移植组中脑源性神经干细胞(SVZ-NSs)组Brdu/nestin+>神经元存活的数目明显高于其他2组.但差异没有统计学意义(P>0.05);到了第8周,3组均仅有少量Brdu/nestin+>细胞存活,相互之间比较差异无统计学意义(P>0.05).结论 植入来源于大脑、骨髓和脂肪组织的神经干细胞都可以在一定程度上提高脊髓损伤后运动功能恢复,但SVZ-NSs组的脊髓损伤大鼠运动功能恢复要比脂肪来源的神经干细胞(AD-NSs)组及骨髓来源的神经干细胞(BM-NSs)组更好.AD-NSs由于来源广泛和强有力的增殖能力,相比其他来源的神经干细胞,可能是更好的选择.     

高温对血脑屏障内皮细胞紧密连接的影响

目的探讨高温对血脑屏障内皮细胞间紧密连接的影响及其分子机制。方法利用内皮细胞与胶质细胞共培养建立体外血脑屏障模型。采用Millicell-ERS系统检测血脑屏障模型的跨内皮阻抗(transendothelial resistance, TER)。对内皮细胞间紧密连接采用银染的方法研究其结构的完整性。运用半定量RT-PCR的方法分析高温作用后血脑屏障内皮细胞紧密连接蛋白zonula occluden 1(ZO-1)的表达变化。结果43 ℃作用2 h后,体外血脑屏障模型TER均值由(321.30±58.59)Ω·cm2下降至(65.67±6.02)Ω·cm2。同时,内皮细胞紧密连接的银染显示,内皮细胞紧密连接完整性明显破坏。RT-PCR分析结果显示,高温条件下体外血脑屏障模型中内皮细胞ZO-1的表达水平明显降低。结论高温可以明显破坏血脑屏障内皮细胞间紧密连接的完整性,高温条件下内皮细胞ZO-1表达水平的降低是血脑屏障热损伤的重要分子机制。     

大鼠骨髓源性神经干细胞移植治疗颞叶癫痫实验研究

目的 探讨骨髓源性神经干细胞移植至KA大鼠海马后与宿主细胞的整合及其对损伤宿主的修复作用,从而为干细胞移植治疗颞叶癫痫提供理论依据.方法 首先分离大鼠骨髓基质细胞,并在特定的条件下培养使其诱导分化为神经干细胞,且使用Feridex对干细胞进行标记.然后建立大鼠颞叶癫痫模型,将Feridex标记的神经干细胞自体移植至KA大鼠的海马内,观察移植后1周、2周、4周、8周和16周大鼠海马的脑电图、病理学和MRI改变情况.结果 与KA未移植组相比,移植组大鼠海马脑电图的波幅明显降低,最高降低达40%以上;KA移植组海马CA3区锥体细胞数与未移植组相比有极显著性差异（P＜0.01）;KA移植组海马损伤侧的Timm染色与未移植组相比也有极显著性差异（P＜0.01）;MRI检查发现在神经干细胞移植后1周和2周时低信号改变区比较局限,但移植4周、8周和16周后低信号改变明显增大,且随着时间的推移低信号改变区逐渐增大.结论 骨髓源性神经干细胞移植至KA大鼠后能与宿主细胞进行整合,且对宿主海马具有显著的修复作用,但其具体的作用机制尚待进一步研究.     

星形胶质细胞水通道4表达变化与胶质瘤性脑水肿的关系

目的 研究脑胶质瘤细胞对体外血脑屏障模型水转运及星形胶质细胞水通道4的影响。方法 利用重水的荧光特性及高效液相系统检测体外血脑屏障模型对水转运的变化。采用半定量RT-PCR的方法分析胶质瘤细胞作用后星形胶质细胞水通道4的表达变化。结果 胶质瘤细胞可以明显增强体外血脑屏障模型对水由内皮细胞腔面至基底面的扩散。这一过程不依赖于白蛋白等大分子物质的通透性变化。同时，胶质瘤细胞明显降低了胶质细胞水通道4的表达水平。结论 胶质瘤细胞可以明显增强体外血脑屏障模型对水由内皮细胞腔面向基底面的扩散。胶质瘤性脑水肿不一定是血浆中大分子物质通透性增加的结果。胶质瘤细胞对胶质细胞水通道4的影响可能是胶质瘤性脑水肿产生的分子机制之一。     

激光共聚焦扫描显微镜动态观察体外培养大鼠皮层神经元受氯化亚铁作用时过氧化物水平及膜电位的变化

目的:建立外伤性癫痫的铁离子诱导细胞模型,观察N-乙酰半胱氨酸及德巴金预处理对受氯化亚铁作用的皮层神经元过氧化物及膜电位的影响。方法:实验于2004-10/2005-06在南方医科大学珠江医院神经外科实验室完成。①培养的新生SD大鼠神经元细胞,随机分为5组:对照组,模型组(1mmol/L),N-乙酰半胱氨酸预处理组(终浓度0.08g/L);丙戊酸钠(德巴金)预处理组(终浓度0.1g/L);N-乙酰半胱氨酸 德巴金预处理组(终浓度分别为0.08g/L及0.1g/L)。②采用荧光探剂DiBAC4(3)和乙酰乙酸盐2’,7’二氯氢化荧光素分别标记,激光共聚焦扫描显微镜(LCSM)断层光切扫描动态观察体外培养的大鼠脑皮层神经元受氯化亚铁作用时的细胞膜电位和过氧化物水平变化。③免疫组织化学检测核因子-κB的表达情况。结果:①大鼠脑皮层神经元过氧化物水平:与对照组比较,模型组过氧化物的相对荧光强度值著性增高(3.39±1.21,18.95±16.26,P=0.038<0.05);N-乙酰半胱氨酸预处理组及N-乙酰半胱氨酸 德巴金预处理组相对荧光强度变化呈负值(-19.66±10.40,-14.84±5.08),与模型组比较差异有显著性(P<0.01);德巴金预处理组(22.89±0.91)相对荧光强度变化与模型组比较,差异无显著性意义(P>0.05)。②各组细胞膜电位测定结果:德巴金预处理组及N-乙酰半胱氨酸 德巴金预处理组相对荧光强度值明显低于模型组(-11.18±3.12,4.45±1.69,25.15±8.84,P<0.01);而N-乙酰半胱氨酸预处理组相对荧光强度变化(23.13±18.92)与模型组差异无显著性意义(P>0.05)。③模型组较对照组核因子κB染色强度明显增加;N-乙酰半胱氨酸预处理组与N-乙酰半胱氨酸 德巴金预处理组较模型组染色强度明显降低。结论:氯化亚铁对皮层神经元的作用可导致过氧化物的生成,导致膜电位的改变,N-乙酰半胱氨酸预保护可减少其过氧化物等自由基的生成,德巴金可起到稳定皮层神经元膜电位的作用,两者共同预处理可显著减轻皮层神经元受氯化亚铁作用的损伤。抗氧化剂联合抗癫痫药可能有助于防治与铁剂诱发有关的癫痫发作。     

多巴胺对体外培养神经细胞的影响

目的　研究高浓度多巴胺 (DA)对神经细胞的毒性作用。　方法　观察不同浓度、不同时间DA对体外培养神经细胞的毒性 ,并用琼脂糖凝胶电泳、原位末端标记、流式细胞仪进行细胞凋亡的检测。　结果　 (1)高浓度DA引起神经细胞凋亡 ;(2 )给予 80、16 0、32 0 μmol/LDA处理 2 4h后神经细胞凋亡率分别为 (41 49± 1 32 ) %、(6 5 6 7± 1 6 8) %、(84 6 5± 2 2 1) % ,明显高于浓度效应对照组〔(2 0 7± 0 2 6 ) % ,P <0 0 5〕 ;(3)在给予 30 0 μmol/LDA处理的条件下 ,经过 12、2 4、48h后 ,神经细胞的凋亡率分别为 (37 90± 0 39) %、(6 9 34± 3 31) %、(82 0 7± 0 86 ) % ,明显高于时间效应对照组〔(2 30± 0 11) % ,P <0 0 5〕。　结论　高浓度DA对体外培养神经细胞具有细胞毒性 ,诱导神经细胞凋亡 ,具有时间及剂量效应。     

壳聚糖-siRNA纳米粒的制备及其特征分析

目的 探讨离子凝胶法制备壳聚糖（CS）-siRNA纳米粒的特点，并分析其理化性质。方法 将CS、三聚磷酸钠（TPP）和siRNA通过离子凝胶法制备CS—siRNA纳米粒：透射电镜观察其形态，zeta电位／粒度分析仪测定纳米粒的平均粒径和zeta电位；分光光度计测定上清中siRNA含量．计算包封率、siRNA的体外控释能力；凝胶电泳分析与胎牛血清作用后纳米粒中siRNA的稳定性。结果 成功制备的CS—siRNA纳米粒经电镜观察发现纳米粒呈球形，大小均匀；zeta电位／粒度分析仪测定其平均粒径为83．3nin．zeta电位＋24．2mV；包封率为95％，24h内siRNA的体外释放率不足20％；电泳结果表明CS—siRNA性质稳定，能够阻止RNase对siRNA的降解，具有保护siRNA的作用。结论 离子凝胶法制备CS—siRNA纳米粒方法简单、条件温和，包封率高、稳定性好：纳米粒体外能显著延缓siRNA释放，保护siRNA免受降解。     

核转染增强型绿荧光蛋白对兔原代骨髓基质细胞向神经细胞方向分化的影响

目的研究以最近发展起来的核转染技术转染增强型绿荧光蛋白（EGFP）质粒进行基因修饰对兔原代骨髓基质细胞向神经细胞方向分化的影响。方法从兔股骨抽取骨髓，密度梯度离心法获取原代骨髓基质细胞。以Nucleofector^TM技术转染pEGFP—C2（EGFP组），以同期培养未转染的细胞作为对照组（control组）。以“CYTOKINE·神经干细胞培养基”＋10％胎牛血清诱导BMSCs向神经细胞方向分化。流式细胞仪检测转染效率。比较两组细胞的生长增殖以及Nestin、NSE、GFAP抗原的表达情况。结果在转染后24h成功发现EGFP的表达。两组细胞具有相似的形态学变化以及生长曲线。诱导18d，两组细胞NSE、GFAP的表达比例无统计学意义。结论Nucleofector^TM技术是一种简易而高效的转染兔原代骨髓基质细胞的方法；EGFP可以作为兔骨髓基质细胞有效的基因表达标记；核转染pEGFP-C2对兔原代骨髓基质细胞体外增殖及向神经细胞方向分化无明显影响。     

骨髓源性神经干细胞自体移植对癫(癎)大鼠海马的修复作用

目的 探讨骨髓源性神经干细胞自体移植对癫(癎)大鼠海马的修复作用.方法 雄性SD大鼠随机分为正常对照组、移植组和非移植组.无菌条件下分离大鼠骨髓基质细胞,在特定条件下培养、诱导其分化为神经干细胞;对移植组和非移植组大鼠建立颞叶癫(癎)模型,将诱导分化的神经干细胞自体移植至移植组大鼠右侧海马内,观察移植后1周、2周、4周、8周和16周模型鼠海马的形态学变化.结果 移植组与非移植组海马CA3区锥体细胞数各时间点显著少于正常对照组(均P＜0.01);与非移植组比较,移植组海马CA3区锥体细胞数于移植后第2～16周明显增多(均P＜0.01);移植组各时间段之间差异有统计学意义(均P＜0.01).与正常对照组相比,移植组和非移植组海马损伤侧的Timm染色评分显著增高(均P＜0.01);但移植组移植2周后各时间点评分显著低于非移植组(均P＜0.01);非移植组随制模时间延长评分持续升高.MRI检查显示在神经干细胞移植后1周和2周时低信号改变区比较局限,此后低信号影随着时间的推移逐渐增大.结论 骨髓源性神经干细胞自体移植至癫(癎)大鼠后能够在海马中生存并迁移,具有减轻海马CA3区锥体细胞缺失、抑制海人酸引起的苔状纤维发芽的修复作用.     

骨髓基质细胞体外诱导分化成神经元和胶质细胞

目的　探索骨髓基质细胞 (bonemarrowstromalcells,BMSC)体外诱导分化为神经元和神经胶质细胞的可行性 ,为BMSC在神经科学领域内的应用奠定基础。方法　以成年犬BMSC为实验对象 ,利用碱性成纤维细胞生长因子 (bFGF)、表皮生长因子 (EGF)、维甲酸 (RA)、脑源性神经营养因子 (BDNF)、胶质细胞系来源神经营养因子 (GDNF)等作为增殖及分化诱导因子 ,进行增殖培养、分化诱导 ;免疫组化法进行细胞性质鉴定。结果　加入bFGF、EGF增殖培养 72h可见细胞分裂相 (成纤维细胞样细胞 )。加入RA、BDNF、GDNF诱导 3d ,部分细胞有NSE、GFAP成分表达 ;第 10d可见有神经元、神经胶质形态样细胞形成 ,经细胞成分 (NSE、GFAP)鉴定证实为神经元、神经胶质细胞。结论　BMSC在体外培养条件下 ,经过bFGF、EGF、RA、BDNF、GDNF等因子的“程序性”作用 ,可以分化成神经元和神经胶质细胞