RNA干扰上调天然免疫

目的:研究特异性RNA干扰对于天然免疫的上调作用。方法:分别分离WHV感染的土拨鼠和WHV转基因小鼠原代肝细胞,转染针对WHV、小鼠β-actin和GAPDH的siRNA。Northern blot和Real-time RT-PCR分别检测原代肝细胞中WHV、MxA、MHCⅠ、β-actin、GAPDH、IFN-β和IP-10的mRNA水平。结果:针对WHV、小鼠β-actin和GAPDH的siRNA抑制靶基因mRNA伴随MxA、MHCⅠ、IP-10等干扰素刺激基因的上调表达。这种干扰素刺激基因的上调表达只有在靶基因被特异siRNA降解时出现,呈剂量和沉寂效应依赖性,而且可以被siRNA特异性抑制剂所阻断。结论:RNAi上调天然免疫可能增强siRNA的抗病毒效应,有可能在抗病毒RNAi研究中发挥重要作用。     

RNA干扰抑制土拨鼠肝炎病毒X基因表达

目的:研究土拨鼠肝炎病毒(WHV)序列特异性siRNA对WHV X基因表达的抑制作用。方法:以WHV全长质粒为模板PCR扩增WHV X基因,克隆到pXF3H载体构建WHX-HA融合蛋白真核表达质粒(pXF3H-WHx);合成siRNA的模板序列,克隆到siRNA表达质粒psiRNA构建shRNA表达质粒(psiWx1、psiWx2);质粒pXF3H-WHx与psiWx1、psiWx2共转染Hela细胞,Western blot检测WHV X蛋白的表达。结果:Hela细胞中WHVX蛋白的表达受siRNA的抑制,psiWx1表达的siRNA抑制90%以上的X蛋白表达,并呈剂量依赖性,但是WHV X基因靶位点中2个突变的核苷酸可使这种干扰作用消失。结论:质粒表达的siRNA序列特异性抑制WHV X蛋白的表达。     

CpG联合恩替卡韦在体内诱导早期病毒学应答抑制土拨鼠肝炎病毒的复制

目的:研究CpG寡脱氧核苷酸对嗜肝病毒复制和基因表达的抑制作用及其作用机制,探索抗病毒治疗的新方法。方法:利用土拨鼠肝炎模型研究P类CpG的免疫刺激和抗病毒活性。土拨鼠肝炎病毒(woodchuck hepatitis virus,WHV)慢性感染的土拨鼠12只分为4组,分别接受CpG皮下注射(4 mg/kg,每周1次,共16周)、恩替卡韦(entecavir,ETV)饲养(0.5 mg·kg-1·d-1,共12周)、CpG联合ETV治疗,或不处理作为对照。在处理后的第1、2、3天,1、2、3、4、8、12、16、20、24和28周,采用定量PCR检测血清WHV载量和PBMC内ISGs mRNA的水平,ELISA检测WHs Ag(WHV surface antigen)水平,生物活性分析血清IFN水平。结果:相比对照组和CpG或ETV单独治疗组,CpG联合ETV治疗显著抑制WHV的复制和表达,出现早期病毒学应答并强烈抑制血清WHs Ag抗原水平。CpG联合ETV治疗组的4只动物中有3只在治疗的13~17周后血清WHs Ag低于检测下限。另外,接受CpG治疗的大部分动物血清中检测到IFN、PBMC中Mx A mRNA显著上调(10~100倍)。结论:P类CpG在慢性WHV感染的土拨鼠体内诱导天然免疫,从而产生强烈的病毒抑制作用。通过优化方法达到长期持续的病毒抑制效果,将促进在HBV感染的个体开展类似的研究,从而开发成为乙型肝炎治疗的新方法。     

靶向X基因shRNA特异抑制HBV基因表达和复制

目的:研究针对HBV X基因小发夹RNA(shRNA)对HBV基因表达和复制的抑制作用。方法:利用分子克隆方法构建了4个HBV X基因特异性shRNA的表达质粒pshHBx1-4,与HBV复制性质粒共转染HepG2细胞,Northern和Southern印迹法检测HBV的mRNA和病毒复制中间体,化学发光微粒免疫分析方法检测细胞培养上清中的HBsAg和HBeAg,免疫荧光染色分析细胞HBcAg的表达水平。结果:共转染pshHBx1-4显著抑制HBV mRNA表达、降低细胞培养上清中HBsAg和HBeAg的水平和细胞内HBcAg的表达水平、并有效抑制HBV的病毒复制中间体的合成。结论:HBV X基因特异性的shRNA可以有效抑制HBV的基因表达和病毒复制,有可能发展成为新的抗HBV制剂。     

DNA疫苗诱导的免疫应答控制土拨鼠肝炎病毒复制

目的:研究DNA疫苗在嗜肝病毒慢性感染的个体诱导产生的细胞和体液免疫应答水平,及其对嗜肝病毒复制的抑制作用,探索打破病毒特异性免疫耐受的新途径。方法:利用土拨鼠肝炎病毒(woodchuck hepatitis virus,WHV)转基因小鼠模型,采用WHV核心抗原(WHV core antigen,WHc Ag)的真核表达质粒(p WHc Im和p CGWHc)作为DNA疫苗免疫3次后,分别采用流式细胞仪检测WHc Ag特异性细胞毒性T淋巴细胞(Cytotoxical T cells,CTL),ELISA检测血清抗-WHc抗体水平,realtime PCR检测血清WHV DNA载量。结果:DNA疫苗在转基因小鼠体内诱导高水平的抗-WHc-Ig G2a抗体和WHc Ag特异性的CTL应答,而且DNA疫苗介导的免疫应答显著抑制WHV复制。与对照组相比,DNA疫苗处理使WHV转基因小鼠血清病毒载量下降2~3个Log值,其中p CGWHc免疫组的6只小鼠中3只血清DNA降至检测低限以下。结论:DNA疫苗可以在转基因小鼠体内诱导产生强烈的细胞和体液免疫应答,并控制WHV复制,提示DNA疫苗在打破嗜肝病毒特异性免疫耐受中具有重要作用,有可能开发成为乙型肝炎治疗的新方法。     

siRNA抑制乙型肝炎病毒在HepG2.2.15细胞中的复制与表达

目的 探讨靶向HBV S基因的siRNA表达质粒在HepG2.2.15细胞中对HBV病毒的复制与表达的抑制效应及其抗病毒活性.方法 设计并构建了两个靶向HBV S基因的siRNA表达质粒S1和S2,随机设计的用于对照的非同源siRNA表达质粒S3.首先在HepG2.2.15细胞中通过实时荧光定量PCR评估该siRNA表达质粒对HBV mRNA表达的抑制效应,接着在HepG2.2.15细胞中通过ELISA方法进一步枪测它们的抗病毒活性细胞上清液中HBV标志性蛋白HBsAg、HBeAg的表达水平.结果 在siRNA表达质粒转染HepG2.2.15细胞后48 h,HBV S基因mRNA表达量下降64%～88%,HBsAg和HBeAg的表达水平分别降低了60%～82%和56%～78%.S1+S2联合使用转染细胞中显著抑制HBV病毒的复制与表达的效率,而对照组S3无抑制效果.结论 发现靶向HBV S基因的siRNA表达质粒能够在HepG2.2.15细胞中有效的抑制HBV病毒的复制与表达,并能够降低细胞上清液中HBsAg和HBeAg的表达水平.S1+S2联合使用转染细胞中可以显著抑制HBV的复制与表达的效率.RNAi可能成为防治HBV感染有效的全新的抗病毒防御策略.     

RNAi通过PKR和TLR通路活化天然免疫

目的:研究特异性RNA干扰(RNA interference,RNAi)上调天然免疫的分子机制。方法:分别从土拨鼠肝炎病毒(Woodchuck hepatitis virus,WHV)转基因小鼠和WHV慢性感染的土拨鼠分离原代肝细胞,转染针对WHV和小鼠甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)的小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA),同时用特异性siRNA抑制剂和信号通路抑制剂,研究RNA活化蛋白激酶(RNA-activated protein kinase,PKR)、Toll样受体(toll-like receptor,TLR)3、7/8和视黄酸诱导基因Ⅰ(Retinoic acid-inducible gene-Ⅰ,RIG-Ⅰ)/黑色素瘤分化相关基因5(Melanoma differentiation-associated gene-5,MDA5)等信号通路在RNAi上调天然免疫中的作用,Real-time RT PCR检测靶基因和MxA的mRNA水平,Western blot检测信号通路分子磷酸化PKR、核因子κB(Nuclear FactorκB,NF-κB)和干扰素调节因子(interferon regulator factor,IRF)3的蛋白水平。结果:针对WHV和GAPDH的RNAi介导的黏病毒抵抗蛋白A(myxovirus resistance A,MxA)上调可以被PKR抑制剂和内体酸化抑制剂所阻断,特异性RNAi可以诱导PKR磷酸化和NF-κB与IRF3的核内转位。结论:特异性RNAi介导的靶RNA降解产物可能通过PKR和TLR-3,-7/8通路活化天然免疫。     

Bcl-2基因siRNA的筛选及对胃癌细胞MGC-803增殖的影响作用

目的:筛选有效抑制Bcl-2基因表达的siRNA序列,研究Bcl-2特异性siRNA对胃癌细胞的抑制作用。方法:设计并合成4对针对Bcl-2的siRNA序列,通过LipofectamineTM2000转染入人胃癌细胞MGC-803后,应用实时定量PCR和Western Blot法分别检测siRNA对细胞内Bcl-2 mRNA和蛋白的表达水平抑制效果,且经CCK-8法检测siRNA对胃癌细胞增值影响。结果:与对照组相比,所设计4对siRNA中siBcl-2抑制Bcl-2 mRNA和蛋白表达效果最佳,抑制率分别为88%和63%,且siBcl-2在转染后第96 h对癌细胞增殖有显著抑制效果。结论:成功筛选出1对能有效抑制Bcl-2基因表达的siRNA序列,为胃癌基因治疗提供实验依据。     

siRNA联合预照射对肺癌细胞survivin基因表达影响

目的 探讨小干扰RNA(siRNA)联合预照射对肺癌细胞survivin基因表达的影响。方法 在肺癌A549细胞中转染survivin基因的siRNA,分别用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)和Western Blotting方法检测survivin基因mRNA和蛋白的表达。将肺癌A549细胞分为单纯放射组、单纯转染组、转染+放射组,采用流式细胞术检测细胞凋亡率,采用细胞集落形成实验检测细胞增殖情况,采用CCK8测细胞生长曲线。结果 siRNA能抑制肺癌细胞survivin基因mRNA和蛋白的表达。siRNA联合预照射较单纯转染和单纯放射能显著增加细胞凋亡率,降低细胞的集落形成,抑制细胞生长。结论 预照射可以增强siRNA对肺癌细胞survivin基因的抑制作用。     

siRNA对HSC结缔组织生长因子的抑制作用

目的研究化学合成的小分子干扰RNA ( siRNA) 对鼠肝星状细胞 (HSC)结缔组织生长因子(CTGF)基因表达的抑制作用.方法针对大鼠CTGF mRNA 483、885和946位点化学合成3对21核苷酸(nt) siRNA, 分别以50、100、200 nmol/L浓度转染HSC T6, 以空白及转染非特异siRNA作为对照, 应用RT-PCR检测CTGF mRNA表达, 筛选出抑制效率最高的siRNA及其浓度; 再转染HSC T6, 抽提孵育24、48、72 h细胞总RNA及蛋白质, 应用RT-PCR和Western blot检测CTGF mRNA及蛋白质表达.结果与对照相比, 转染siRNA的HSC T6细胞CTGF mRNA表达水平明显降低, siRNA抑制效率在50 ～ 200 nmol/L范围呈浓度依赖性增高, 以483 siRNA 200 nmol/L最显著, 转染非特异siRNA的HSC T6细胞CTGF mRNA表达水平无明显变化; 转染483 siRNA的HSC T6细胞24 48、72 h CTGF mRNA分别下调 (91±2) %、(65±3) % (P均<0.01)和 (10±7) % (P=0.0634), 蛋白分别下调 (86±5)%、(94±4)%和 (42±9)% (P均<0.01).结论化学合成483 siRNA能高效抑制HSC的CTGF基因表达, 有效阻抑时间达72 h, 提示化学合成siRNA具有预防和治疗肝纤维化的潜力.     

RNA干扰靶向沉默FLIP基因对卵巢癌细胞A2780生物学特性的影响及生长抑制作用

目的探讨靶向FLIP基因的小干扰RNA（siRNA）对人卵巢癌细胞A2780生物学特性的影响及生长抑制作用。方法设计并体外化学合成FLIP序列特异性双链RNA，在脂质体（LipofectamineTM2000）介导下转染人卵巢癌细胞株A2780。采用半定量RT-PCR和Western blot法检测FLIP siRNAs转染前后A2780细胞FLIP基因mRNA和蛋白表达的变化,并筛选出抑制作用最强的FLIP-siRNA。采用四甲基偶氮唑盐（MTT）法、Annexin-V-PI双染法流式细胞术（FCM）分别检测FLIP-siRNA转染对A2780细胞的生长抑制作用和对凋亡的影响。结果特异性FLIP-siRNAs片段能有效降低A2780细胞中FLIP的 mRNA和蛋白水平（P＜0.01）,最大抑制率分别为77.4％和66.1％；转染FLIP-siRNA后，A2780细胞的生长活力明显下降（P＜0.05），RNA干扰组的细胞凋亡也显著增加（P＜0.05）。结论靶向FLIP基因的siRNAs可在转录和翻译水平抑制FLIP基因表达；并可抑制卵巢癌A2780细胞生长，促进其凋亡。     

维生素E脂质体纳米颗粒转运siRNA抑制丙型肝炎病毒核心蛋白表达的实验研究

目的 研究携带针对丙型肝炎病毒(hepatitis C virus,HCV)RNA的小干扰RNA(siRNA)的维生素E(Vitamin E)脂质体纳米颗粒在体外靶向抑制HCV复制的作用.方法采取“薄膜水化法”制备Vitamin E脂质体纳米颗粒,应用激光粒度分析仪测量纳米颗粒VE-DC/siRNA的颗粒大小及zeta电位,应用透射电子显微镜观察VE-DC形态及分散性.以Huh7.5.1细胞株作为载体.CCK-8法检测纳米颗粒的细胞毒性,琼脂糖凝胶电泳检测纳米颗粒携带siRNA的血清稳定性,蛋白印迹技术和免疫荧光技术检测该siRNA纳米颗粒的转染效率及对HCV的抑制作用.结果 Vitamin E脂质体纳米颗粒形态呈球形,粒度分布为(125.5-9.0)nm,zeta电位为(39.1±4.8)mV,分散均一.相较同浓度商品化脂质体,VE-DC/siRNA对细胞的毒性相对较小.血清稳定性实验显示,VE-DC/siRNA在24 h后siRNA无降解,较裸siRNA稳定性显著提高.携带siRNA的Vitamin E脂质体纳米颗粒可以较高效率进入Huh7.5.1细胞内,并抑制HCV核心蛋白的表达.结论 Vitamin E脂质体纳米颗粒可以转运siRNA至Huh7.5.1细胞,并抑制HCV核心蛋白的表达.     

乙型肝炎病毒DNA转染与鸭乙型肝炎病毒DNA感染原代鸭肝细胞对比研究

目的探讨HBVDNA复制和表达的跨种属特异性,为HBVDNA转染跨种属原代肝细胞模型的建立提供实践基础和理论依据.方法分离培养原代鸭肝细胞(PDH),电转线性HBVDNA(转染组,1.19×1012拷贝/1×107PDH)或急性感染DHBV(感染组,4×108病毒颗粒/1×107PDH),分别于转染/感染后ld、3d、5d等时点检测PDH培养上清或裂解液中HBsAg、HBeAg与DHBsAg(采用IMX系统或ELISA检测);并采用DotBlotting检测PDH裂解液中总HBVDNA.于转染/感染后2d提取PDH总DNA采用SouthemBlotting分析HBVDNA与DHBV复制型式.以单纯电击或未感染的PDH为对照组.结果转染后1d、3d和5d各时点转染组PDH裂解液中HBsAg分别为15.24、14.55和5.13(P/N值,阳性≥2.1),HBeAg均为阴性;PDH培养上清中HBsAg与HBeAg均阴性;感染组各时点PDH上清中DHBsAg分别为14.6、31.53、34.73(S/N值,阳性≥2.1);上述各项指标于对照组均为阴性.DotBlotting显示转染组与感染组PDH各时点的裂解液中HBVDNA与DHBVDNA均为阳性,对照组为阴性;SouthernBlot分析显示转染组HBVDNA与感染组DHBV均为游离复制型,可见4.0kb以下分子涂抹带,包括rcDNA、cccDNA(scDNA)和ssDNA等复制中间体;未见整合型HBVDNA-高分子区(4～24kg)涂抹带.结论HBVDNA在PDH中的复制和表达与DHBV感染组相似,可能为肝细胞内环境依赖性,无严格种属特异性限制.     

瞬时转染和稳定转染对RNAi抑制乙型肝炎病毒S基因表达的影响

目的:构建针对乙型肝炎病毒(HBV)S基因的siRNA表达载体Psuper-S1和Psuper-S2,观察瞬时转染及稳定转染对RNAi抑制HBV基因表达作用的影响.方法:设计并合成针对HBV S基因的siRNA寡核苷酸,经退火形成双链后克隆入Psuper载体,构建成功的siRNA表达载体分别瞬时转染和稳定转染表达HBV的2.2.15细胞,对所得细胞上清中的HBsAg和HBeAg进行定量检测,RT-PCR检测siRNA对靶基因Mrna的抑制效果,并比较两种转染方式对RNAi抑制HBV基因表达作用的影响.结果:在稳定转染并经潮霉素筛选所得的单克隆细胞株中,Psuper-S1和Psuper-S2均能明显抑制HBsAg及HBeAg的分泌(P<0.01),抑制率分别为83%和78%,RT-PCR结果证实HBV的Mrna明显降低,而瞬时转染细胞在蛋白质水平上及Mrna水平上的结果则比稳定转染的结果逊色.结论:针对HBV S基因的siRNA能稳定、高效、特异地抑制HBV基因的表达,转染效率对于靶基因的RNA干涉作用有明显的影响.     

siRNA干扰骨形态发生蛋白2对肝癌SMMC7721细胞迁移和侵袭能力的抑制作用

目的 设计并化学合成针对骨形态发生蛋白2(bone morphogenetic proteins,BMP-2)的siRNA分子片段,转染人肝癌SMMC7721细胞,观察其对SMMC7721细胞迁移和侵袭能力的影响.方法 设计并化学合成针对BMP-2的3个siRNA分子序列,阳离子脂质体法瞬间转染SMMC7721细胞,运用半定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)和Western印迹法检测细胞中BMP-2在mRNA水平和蛋白水平的变化,体外侵袭实验榆测转染后细胞侵袭能力的变化.实验共分6组,①正常对照组;②空白对照组;③阴性对照组;④～⑥分别为BMP-2-siRNA-A、BMP-2-siRNA-B、BMP-2一siRNA-C转染组.结果 RT-PCR和Western blot显示3对特异性BMP-2-siRNA转染肝癌细胞SMMC7721之后,其BMP-2的基凶和蛋白表达均受到抑制,以siRNA-B抑制效果最明显[(0.32±0.07)vs(0.92±0.14),(0.37±0.10)vs(0.89±0.17),P<0.01].体外侵袭实验显示转染后肝癌细胞数明显低于未转染组和阴性对照组[分别为(6.48±3.62)、(23.72±3.24)、(22.38 4-3.84),P<0.05].结论 BMP-2与肝癌的侵袭转移潜能相关,siRNA-BMP-2能明显抑制肝癌细胞SMMC7721的BMP-2表达,从而抑制肝癌细胞的迁移和侵袭能力.     

荧光定量PCR检测土拨鼠肝炎病毒核酸方法的建立

目的建立土拨鼠肝炎病毒(woodchuck hepatitis virus,WHV)核酸的荧光定量PCR(Real-time PCR)检测方法,应用于土拨鼠肝炎病毒模型的研究。方法分别根据土拨鼠肝炎病毒核心抗原(WHcAg)和表面抗原(WHsAg)的DNA序列设计13对扩增引物,从中筛选无非特异性扩增及引物二聚体且灵敏度高的引物,用于土拨鼠血清中WHV DNA的Real-time PCR检测。建立感染土拨鼠肝炎病毒的土拨鼠血清中WHV核酸的Real-timePCR检测方法。结果根据WHsAg基因的5’端设计的一对引物WHVSF1与WHVSR1,检测灵敏度可达1×101拷贝/μL,病毒拷贝数与Real-time PCR Ct值的标准曲线的R2值为0.997,且电泳未见明显非特异性条带及引物二聚体。结论建立了土拨鼠血清中WHV DNA的Real-time PCR检测方法,该方法为进一步研究土拨鼠肝炎病毒模型奠定了基础。     

下调SnoN基因表达对HepG2细胞增殖及凋亡的影响

目的通过小干扰RNA(siRNA)下调人肝癌HepG2细胞中SnoN基因的表达,探讨SnoN对HepG2细胞增殖、凋亡等生物学功能的影响及其意义。方法设计并化学合成3条靶向SnoN的siRNA序列,采用阳离子脂质体瞬时转染的方法将干扰序列转染至HepG2细胞内,采用RT-PCR和Western blot方法,检测转染后的抑制效果并筛选出一条抑制效果最好的干扰序列,然后采用CCK-8法和流式细胞术检测SnoN基因表达下调后HepG2细胞增殖、凋亡的变化。结果 3条siRNA均对SnoN的表达有抑制作用,以siRNA-C抑制效果最好。下调SnoN基因表达后,HepG2细胞的增殖受到抑制(P<0.05),细胞凋亡增加(P<0.05)。结论靶向SnoN的siRNA可有效抑制SnoN基因的表达,进而使HepG2细胞的生长受到抑制、细胞凋亡增加,表明SnoN基因可能与肝癌细胞的增殖与凋亡有关。