含CpG免疫刺激序列的质粒增强HBsAg诱导的免疫应答

目的 探讨以含有多拷贝CpG寡脱氧核苷酸的质粒作为治疗性乙肝疫苗佐剂的可行性。 方法 构建含有6个拷贝D型CpG ODN的质粒pKO-CG6,将该质粒以及载体pKO分别刺激健康人以及HBV感染者的外周血单核细胞（PBMC）,检测PBMC的增殖以及分泌的细胞因子IFN-与IL-12,进一步将重组HBsAg分别联合这两种质粒免疫小鼠,检测小鼠的细胞和体液免疫应答。结果 质粒pKO-CG6与载体pKO在体外均能有效激活健康人以及HBV感染者PBMC的增殖反应,并促进IFN-与IL-12的产生,其中pKO-CG6的免疫刺激活性明显强于载体pKO。小鼠体内试验表明,虽然载体pKO也具有免疫佐剂作用,但pKO-CG6更能显著增强HBsAg诱导的免疫应答,尤其是细胞免疫应答。 结论 含有多拷贝D型CpG ODN的质粒能有效激活HBV感染者的PBMC,并增强HBsAg在小鼠体内的免疫原性,对于治疗性乙肝疫苗具有潜在应用前景。     

siRNA联合恩替卡韦在原代肝细胞中抑制土拨鼠肝炎病毒基因表达和复制

目的:在原代土拨鼠肝细胞中研究siRNA联合恩替卡韦(ETV)对土拨鼠肝炎病毒(WHV)基因表达和复制的抑制作用。方法:分别设计合成针对WHV PreS1、S、C、X基因的4种siRNA,转染原代土拨鼠肝细胞,同时给予ETV处理,Southern和Northern印迹检测WHV病毒复制中间体和mRNA水平,realtime PCR检测细胞上清中WHV DNA。结果:4种siRNA对WHV基因表达和复制的作用显示出不同的动力学特征,siWHs和siWHx的抑制作用最强,而siWHpreS1和siWHc的活性相对较弱。在原代肝细胞中,首先出现的是WHV mRNA水平的降低,然后是WHV复制中间体水平的降低,siWHs和siWHx最高抑制60%～70%的mRNA和病毒复制中间体,同时抑制细胞上清中90%的WHV DNA。另外siWHx与ETV联合应用不仅可以增强抗病毒作用,而且可以防止ETV停药反跳。结论:siRNA在WHV自然感染的原代肝细胞中可以有效抑制病毒的基因表达和复制,因而siRNA有可能开发成为新的抗HBV药物,尤其适用于核苷(酸)类似物的联合应用。     

DNA疫苗诱导的免疫应答控制土拨鼠肝炎病毒复制

目的:研究DNA疫苗在嗜肝病毒慢性感染的个体诱导产生的细胞和体液免疫应答水平,及其对嗜肝病毒复制的抑制作用,探索打破病毒特异性免疫耐受的新途径。方法:利用土拨鼠肝炎病毒(woodchuck hepatitis virus,WHV)转基因小鼠模型,采用WHV核心抗原(WHV core antigen,WHc Ag)的真核表达质粒(p WHc Im和p CGWHc)作为DNA疫苗免疫3次后,分别采用流式细胞仪检测WHc Ag特异性细胞毒性T淋巴细胞(Cytotoxical T cells,CTL),ELISA检测血清抗-WHc抗体水平,realtime PCR检测血清WHV DNA载量。结果:DNA疫苗在转基因小鼠体内诱导高水平的抗-WHc-Ig G2a抗体和WHc Ag特异性的CTL应答,而且DNA疫苗介导的免疫应答显著抑制WHV复制。与对照组相比,DNA疫苗处理使WHV转基因小鼠血清病毒载量下降2~3个Log值,其中p CGWHc免疫组的6只小鼠中3只血清DNA降至检测低限以下。结论:DNA疫苗可以在转基因小鼠体内诱导产生强烈的细胞和体液免疫应答,并控制WHV复制,提示DNA疫苗在打破嗜肝病毒特异性免疫耐受中具有重要作用,有可能开发成为乙型肝炎治疗的新方法。     

TLR9在 CpG寡脱氧核苷酸所致种属特异性免疫效应中的意义

目的：探讨TLR9在CpG寡脱氧核苷酸（CpG-ODN）种属特异性免疫效应中的意义。方法：CpG-ODN体外刺激人、猕猴、小鼠外周血单个核细胞（PBMC）,ELISA测培养液IFN-α含量;RT-PCR检测PBMC中TLR9的表达水平。结果：CpG-ODN 2216有效诱导人PBMC分泌IFN-α,而对猕猴和小鼠却无明显的免疫刺激活性;TLR9在人PBMC中均有表达,并且在CpG-ODN介导激活的人PBMC中表达上调;TLR9在猕猴PBMC中不表达。结论：TLR9是构成CpG-ODN种属特异性的重要分子基础。     

Toll样受体4介导抑制Bewo细胞中乙型肝炎病毒的复制

目的探讨Toll样受体4（TLR4）介导的天然免疫对Bewo细胞中乙型肝炎病毒（HBV）复制的影响。方法首先用TLR4配体LPS处理Bewo细胞,观察细胞TLR4 mRNA表达的动力学。然后将2μg 1.3倍HBV全基因重组质粒pcDNA3.1（＋）-HBV1.3转染Bewo细胞,12h后,以LPS处理3d。最后,用抗TLR4处理Bewo细胞1h后,加入10μg/ml LPS刺激。采用荧光定量RT-PCR、微粒子酶免疫分析法（MEIA）和荧光定量PCR法分别检测细胞TLR4 mRNA表达、HBsAg、HBeAg及HBV DNA水平。结果 LPS可显著诱导Bewo细胞TLR4 mRNA表达（P〈0.05）,呈时间和剂量依赖性;与对照组比较,LPS可显著抑制HBV复制（P〈0.001）,LPS对HBV DNA、HBsAg及HBeAg的抑制率（%）分别为29.70±6.03、32.12±5.98和33.89±1.28。抗TLR4可显著逆转LPS对HBV复制的抑制作用（P〈0.01）。结论 TLR4介导的天然免疫可一定程度地抑制Bewo细胞中HBV复制,为防治HBV宫内感染提供了新的途径。     

基于TLR3补肾健脾方水提物抑制乙肝病毒复制机制研究

目的：通过pHBV1.3-pCR2.1质粒转染HepG2细胞探讨补肾健脾方水提物抑制乙肝病毒的免疫机制。方法：250μg/ml、500μg/ml补肾健脾方水提物干预pHBV1.3-pCR2.1质粒转染HepG2细胞,ELISA法检测细胞上清HBsAg、HBeAg含量;500μg/ml补肾健脾方水提物干预pHBV1.3-pCR2.1质粒转染HepG2细胞,Westen blot法检测Toll样受体3(TLR3)、p-IRF3蛋白表达,qRT-PCR法检测细胞内IFN-β mRNA表达;补肾健脾方干预HepG2细胞,pHBV1.3-pCR2.1质粒转染HepG2细胞,TLR13 siRNA下调TLR3表达,Westen blot法检测TLR3、p-IRF3蛋白表达,qRT-PCR法检测细胞内IFN-β mRNA表达。结果：500μg/ml补肾健脾方与空白对照组、250μg/ml补肾健脾方比较,HBsAg均明显下降（P<0.05,P<0.01）;500μg/ml补肾健脾方与空白对照组、250μg/ml补肾健脾方比较,HBeAg均明显下降（P<0.05,P<0.01）;...     

恩替卡韦联合强的松治疗乙型肝炎病毒相关性肾炎19例

目的观察恩替卡韦联合强的松治疗乙型肝炎病毒相关性肾炎（HBV-GN）的近期疗效。方法选择19例HBV-GN患者,定量PCR测得血清HBVDNA≥104拷贝/mL,在常规治疗基础上加用恩替卡韦0.5mg/d和强的松1mg/kg·d。于治疗后1、3、6、12个月复查血常规、尿蛋白定量、肝、肾功能、血清HBV标志物变化。结果恩替卡韦联合强的松治疗HBV-GN总有效率94.7%（18/19）,显效率为63.2%（12/19）,无效1例;治疗3、6、12个月HBVDNA累计转阴的分别有13、15例和17例;治疗6、12个月HBeAg转阴的分别有1例和2例,抗-HBe转阳的只有1例。结论 HBV-GN以肾病综合症为主,恩替卡韦联合强的松治疗HBV-GN效果显著、安全、耐药率低。     

髓样细胞分化蛋白抑制乙型肝炎病毒复制的机制研究

目的探讨髓样细胞分化蛋白（MyD88）对乙型肝炎病毒复制的抑制作用及其机制。方法以连接了MyD88全长序列的腺病毒为载体感染HepG2.215细胞,免疫荧光法确认Ad5-MyD88的感染效率后,以无关蛋白GFP作为对照,用ELISA、Real-time PCR、Northern blotting、Southern blotting分别检测上清中的HBsAg和HBeAg的含量及HBV RNA、DNA的表达观察MyD88对HBV复制抑制作用的影响。结果与GFP相比,感染了带有MyD88序列腺病毒的HepG2.215细胞上清中HBsAg、HBeAg含量、细胞内RNA及Core particle DNA的水平全面下降。结论 MyD88可降低HepG2.215细胞内HBV的复制水平;MyD88在抑制HBV复制过程中有着一定的作用。     

硫代反义寡脱氧核苷酸在树体内对HDV复制与表达的抑制作用

目的：在树（Ｔｕｐａｉａ）体内观察硫代反义寡脱氧核苷酸（Ｓ－ＡＳＯＤＮ）对ＨＤＶ复制、表达的抑制作用。方法：树同时接种ＨＢＶ阳性血清０．１ｍｌ、ＨＤＶ阳性血清０．３ｍｌ后，将１６只ＨＤＶ／ＨＢＶ感染成功的树随机分为两组，给药组８只树按每只每次经尾静脉注射Ｓ－ＡＳＯＤＮ３ｍｇ，隔日１次，共７次。对照组中２只注射等量生理盐水，另６只不作处理。注射后５、１０、１５、２５ｄ取血及肝组织采用免疫组化、斑点杂交及原位杂交法检测ＨＤＶＡｇ及ＨＤＶＲＮＡ。结果：于注射结束时（１５ｄ）给药组有７只树肝内ＨＤＶＡｇ及ＨＤＶＲ－ＮＡ转为阴性，对照组８只树中仅１只转为阴性。停止使用Ｓ－ＡＳＯＤＮ１０ｄ后，给药组２只阴转树肝内又可检出ＨＤＶＡｇ和ＨＤＶＲＮＡ，对照组仍有７只可检出。结论：Ｓ－ＡＳＯＤＮ在树体内能有效抑制ＨＤＶ复制及表达，但作用并不完全，可能与用药剂量不足，时间不够长及仅用硫代修饰尚不能直接导向靶基因有关     

TLR2、TLR4在乙型肝炎病毒转染的HepG2细胞株的表达

目的探讨乙肝病毒全基因组瞬时转染HepG2细胞后，对HBV抗原分泌，病原识别受体Toll样受体2、4（TLR2、4）的表达及细胞增殖的影响。方法已构建pBlueScript—HBV质粒并经测序，转化宿主菌，摇菌后提取质粒，用Sapl酶切，获得HBV 3．2kb基因组，采用脂质体瞬时转染肝癌细胞株HepG2，IMX检测HBV所分泌抗原，台盼蓝计数检测细胞增殖活性，直接免疫荧光流式细胞术（FCM）检测TLR2、4在细胞株上表达的阳性细胞率，并与空白对照绗对比。结果HBsAg利HBeAg的分泌随着转染HBV DNA量的增加而升高，除4μg和6μg组两组间比较的表面抗原外，差异均有显著性意义（P〈0．05）。TLR2、4在转染后均有上调，TLR4在各组间差异显著（P〈0.05），但TLR2只在最大剂量转染组时差异有显著性（P〈0．05）。台盼蓝拒染法示细胞存活随转染剂量的升高而减少（P〈0．05），但4μg和6μg两组间比较无显著意义（P〉0．05）。而各转染剂量组HBsAg和e抗原的分泌及细胞的存活数均与TLR2、4的表达呈显著正相关（P〈0．01）。结论研究结果初步表明乙肝病毒可能直接引起HepG2细胞TLR2、4的上调，而且TLR的上调可能启动了细胞的凋亡或坏死机制，成为HBV损伤细胞的非免疫细胞介导机制。     

胸腺五肽穴位注射联合恩替卡韦治疗慢性乙型肝炎的临床研究

目的探讨胸腺五肽穴位注射联合恩替卡韦对慢性乙型肝炎的疗效。方法100例患者随机分为实验组和对照组,观察穴位注射与静脉注射对慢性乙型肝炎的疗效。结果两组患者谷丙转氨酶恢复速度、HBV—DNA下降程度、HbeAg—HbeAb血清学转换率方面均有差异。结论胸腺五肽穴位注射较静脉用药疗效好。     

甲泼尼龙联合恩替卡韦治疗原发性肾病综合征合并乙肝病毒感染的疗效观察

目的 探讨甲泼尼龙联合恩替卡韦治疗原发性肾病综合征合并乙肝病毒感染的临床疗效和安全性.方法 20例原发性肾病综合征合并乙肝病毒感染的患者(微小病变9例,轻度系膜增生性肾小球肾炎11例),采用甲泼尼龙联合恩替卡韦治疗,观察治疗前后患者的24 h尿蛋白定量、血清蛋白、肝肾功能、HBV-DNA定量及不良反应.结果 甲泼尼龙联合恩替卡韦治疗原发性肾病综合征合并乙肝病毒感染患者的肾脏和肝脏总有效率均达100%,且无明显的肝肾功能损害及HBV的再激活.结论 甲泼尼龙联合恩替卡韦治疗原发性肾病综合征合并乙肝病毒感染临床疗效肯定,且具有很好的安全性.     

锦州地区920例病毒性肝炎血清病毒标志物的调查

采用 EL ISA技术对 92 0例病毒性肝炎患者进行血清学分析 ,其结果甲型肝炎患者 6 5例 (占 7.0 % ) ,乙型肝炎患者771例 (占 83.8% ) ,丙型肝炎患者 84例 (占 9.2 % ) ,混合和重叠感染患者 2 0例 ,表明 :甲、乙、丙三型病毒性肝炎在锦州地区均有散发存在 ,尤以乙型肝炎为主     

重组腺病毒HBx体内抑制恶性肿瘤细胞的实验研究

目的 探讨人乙肝病毒x蛋白(HBx)在体内对肿瘤细胞增殖能力的影响.方法 利用连接有增强型绿色荧光蛋白的腺病毒(Ad-eGFP),在体外感染H22肿瘤细胞,观察腺病毒对H22细胞的感染效率;在小鼠腹腔内接种小鼠肝癌H22细胞,建立恶性腹水模型,腹腔注射重组腺病毒HBx(Ad-HBx)、空载腺病毒(Ad-null)或生理盐水(对照组),检测腹水肿瘤细胞内的HBx蛋白表达并观察其对肿瘤细胞增殖能力、腹水形成及腹膜渗透性、红细胞等腹水性状的影响.结果 腺病毒体外对H22细胞有高的感染效率.HBx蛋白能在腹水肿瘤细胞中表达,在体内环境中Ad-HBx能改善腹膜的渗透性(P<0.05),抑制小鼠腹水生成(P<0.05),使腹水中的红细胞、癌细胞水平明显减少(P<0.05),流式细胞术分析提示Ad-HBx使腹水中的肿瘤细胞周期有明显G2/M阻滞.结论 体内环境中Ad-HBx能在肿瘤细胞内表达HBx蛋白,通过细胞周期阻滞明显抑制肿瘤细胞的增殖能力,有望成为治疗癌性腹水的一种新方法.     

恩替卡韦联合还原型谷胱甘肽治疗乙型肝炎肝硬化临床研究

目的:观察恩替卡韦(ETV)联合还原型谷胱甘肽(GSH)治疗乙型肝炎肝硬化的临床疗效。方法:将52例乙型肝炎肝硬化患者随机分为两组。治疗组27例应用ETV联合GSH治疗,加用内科营养支持对症治疗;对照组25例常规内科营养支持对症治疗。两组治疗前后比较临床治愈好转率,并观察主要肝功能、PTA及HBVDNA定量检测指标的变化。结果:治疗结束后,治疗组总有效率为81.5%,疗效优于对照组的28%(P<0.01),且治疗组TBIL、ALB、ALT、CHE、PTA及HBVDNA等实验指标的定量检测值均较对照组有明显改善(P<0.05),同时治疗组治疗前后其肝功能、PTA与HBVDNA检测也有显著改善(P<0.01)。结论:恩替卡韦(ETV)联合还原型谷胱甘肽(GSH)治疗乙型肝炎肝硬化有较好疗效。     

替比夫定联合阿德福韦酯与恩替卡韦单药治疗失代偿期乙型肝炎肝硬化疗效比较

目的比较阿德福韦酯（ADV）与替比夫定（LDT）初始联合与恩替卡韦（ETV）单药治疗失代偿期乙型肝炎肝硬化患者的安全性及疗效,找到更有效更安全的治疗方法。方法：将符合标准的86例失代偿期乙型肝炎肝硬化患者随机分成联合用药组和单独用药组,联合用药组服用阿德福韦酯及替比夫定,单独用药组服用恩替卡韦,每组43例,治疗疗程为48周,记录不同时间两组肝功能、肾功能、出凝血时间、HBVDNA定量的变化、CTP评分和MELD评分,并进行组间比较。结果：联合治疗组和单药组在治疗第24周、48周时ALT复常两组差异均无统计学意义,治疗第24周、48周时,HBeAg阴转例数两组差异有统计学意义,治疗第24周、48周时,两组HBVDNA低于检测值的例数差异无统计学意义。结论：LDT与ADV初始联合更适用于临床,且联合组HBeAg血清学转换率高于单药组,具有统计学意义。     

安络化纤丸联合恩替卡韦治疗慢性乙型肝炎肝纤维化疗效观察

目的评价安络化纤丸联合恩替卡韦治疗慢性乙型肝炎肝纤维化的疗效。方法采用安络化纤丸联合恩替卡韦治疗慢性乙型肝炎30例，并与单用恩替卡韦治疗28例随机对照观察1年。结果联合治疗组治疗后患者各项肝纤维化指标下降幅度明显大于单用恩替卡韦治疗组（P〈0．01）。结论联合用药更有利于阻断或逆转肝纤维化的形成和发展。     

苦参素葡萄糖注射液联合恩替卡韦分散片治疗慢性乙型肝炎的临床观察

目的观察苦参素葡萄糖注射液联合恩替卡韦分散片治疗慢性乙型肝炎的临床疗效。方法 90例慢性乙型肝炎患者随机分为两组,对照组口服恩替卡韦分散片,治疗组在对照组基础上注射苦参素葡萄糖注射液。比较两组HBV-DNA转阴率、HBe Ag转阴率、ALT复常率,肝纤维化指标LN、HA及PCⅢ水平及不良反应发生情况。结果治疗组HBV-DNA转阴率、HBe Ag转阴率、ALT复常率均高于对照组(P0.05);肝纤维化指标LN、HA及PCⅢ水平均优于对照组(P0.01)。结论苦参素葡萄糖注射液联合恩替卡韦分散片可有效抑制HBV-DNA复制,具有较好的临床疗效。