兔骨髓间充质干细胞的分离、培养与鉴定

背景：目前对骨髓间充质干细胞常用的分离方法有密度梯度离心法、贴壁筛选分离法。目的：联合应用密度梯度离心法和贴壁筛选分离法体外分离培养、扩增兔骨髓间充质干细胞，并对其进行鉴定。设计、时间及地点：对比观察的细胞学实验，于2007-10／2008-03在上海市第六人民医院中心实验室完成。材料：2月龄新西兰纯种大耳白兔6只用于骨髓间充质干细胞取材与原代培养，1．073kg／L的Percoll分离液。方法：实验采用Percol分离液利用密度梯度离心法及结合贴壁分离筛选法来分离、纯化骨髓间充质干细胞，在采用密度梯度离心法得到骨髓间充质干细胞后，经贴壁培养及反复换液纯化骨髓间充质干细胞。分别取第3，5，7，9代骨髓间充质干细胞，行细胞计数，绘制细胞生长曲线。主要观察指标：倒置显微镜下观察原代及传代细胞的形态、生长情况。采用CD44及CD34抗体进行间接免疫荧光标记鉴定培养的干细胞。CD44染色呈阳性，CD34染色呈阴性，说明所提取、纯化的细胞是骨髓间充质干细胞。结果：增殖传代的骨髓间充质干细胞呈长梭形均匀分布生长，形态比原代培养的细胞更均匀，细胞生长旺盛、增殖迅速，胞核明显，核仁清晰，核浆比例大，细胞形态均匀，平行排列呈螺旋状或漩涡状，传代至第5代时无明显变化。随传代次数的增加，细胞增殖能力逐渐下降，第3～5代细胞增殖能力强。所分离培养的细胞均表达CD44，不表达CD34。结论：在体外采用密度梯度离心及贴壁培养法可获得高纯度的兔骨髓间充质干细胞。     

老年全髋关节置换术后VancouverB 2、VancouverB 3型股骨假体周围骨折行翻修术治疗的临床疗效

目的探讨老年人工髋关节置换术后VancouverB2、VancouverB3型股骨假体周围骨折行关节翻修手术时的假体选择对临床疗效的影响。方法回顾性分析采用手术治疗的32例髋关节置换术后股骨假体周围骨折的老年患者的临床资料。根据Vancouver分型及股骨峡部皮质骨完整情况采用不同治疗方法:14例VancouverB2型假体周围骨折患者以及2例VancouverB3型假体周围骨折,而且两种类型假体周围骨折16例患者其股骨峡部完整皮质骨均≥4 cm,应用生物型全涂层远端固定长柄假体翻修+钢丝或捆绑带环扎固定;13例VancouverB3型假体周围骨折患者和2例骨缺损虽然不严重但股骨峡部完整皮质骨4 cm的VancouverB2型患者,应用生物型组配式锥柄假体翻修,其中8例同时应用同种异体骨板捆绑固定,1例VancouverB 3型假体周围骨折患者应用骨水泥长柄假体+钢丝或捆绑带环扎固定。随访时记录Harris髋关节评分,通过骨折部位的疼痛情况及X线片来判断骨折是否愈合。结果病例均获得随访,随访时间12～36个月,平均(24.5±0.5)个月。骨折均愈合,愈合时间为6～12个月,平均(8.5±0.5)个月,8例使用异体骨板的患者中,均与宿主骨发生骨性愈合。Harris髋关节评分由术前(4.0±1.2)分提高至末次随访的(78.6±16.4)分,差异有统计学意义(t=2.82,P=0.018)。并发症:双下肢不等长2例;下肢深静脉血栓2例,并发症发生率12.5%(4/32)。随访期间未出现大腿疼痛、假体周围感染、无菌性松动及再骨折病例。结论根据Vancouver分型,综合考量股骨峡部骨质条件,对于股骨峡部完整皮质骨4cm的假体周围骨折老年患者,应用生物型组配式假体柄可以取得良好的早中期临床疗效;而对于股骨峡部完整皮质骨≥4 cm的假体周围骨折老年患者,在行翻修手术治疗时,应用一体化全涂层远端固定长柄假体甚至骨水泥假体,术中操作简单、省时,在减少术后并发症方面,较生物型组配式锥柄更具有实际应用性。     

平台髌骨角测量膝关节表面置换术髌骨高度的变化

目的研究平台髌骨角对于膝关节表面置换手术前后髌骨高度的准确性、可重现性,特点及不足,以及手术影响髌骨高度的变化因素。 方法选取吉林大学中日联谊医院骨科2015年1月到2016年1月资料完整的100例全膝关节置换术的患者作为研究样本,所有患者均为骨关节炎和类风湿性关节炎的病人,选取患者术前术后的膝关节侧位片,膝关节屈曲角度为30°。测量所选患者的术前术后膝关节侧位片平台髌骨角的。运用广泛使用的3种测定髌骨高度方法进行54例全膝关节置换患者手术前后侧位片的测量。3种方法为改良Black-burne-Peel指数,改良Caton-Desehamps指数和改良Insall-Salvati指数。由2名观察者使用标准的方法,独立的方式进行了524个数据的测量。对这2名观察者测量的数据进行组内相关系数(ICC)和95%可信区间的统计,对改良Black-burne-Peel指数,改良Caton-Desehamps指数、改良Insall-Salvati指数和平台髌骨角的术前术后数据进行配对t检验。 结果改良Insall-Salvati指数(术前ICC＝0.75;术后ICC＝0.87)、改良Black-burne-Peel指数(术前ICC＝0.65;术后ICC＝0.88)、改良Caton-Desehamps指数(术前ICC＝0.72;术后ICC＝0.88)和平台髌骨角(术前ICC＝0.86;术后ICC＝0.93)均具有更高的术后组内相关系数。其中,平台髌骨角的组内相关系数是最高的,患者术后的髌骨高度出现了降低。4种方法的术前术后数据比较显示,除了改良Insall-Salvati指数之外,改良Caton-Desehamps(t＝3.69)、改良Black-burne-Peel指数(t＝3.50)和平台髌骨角(t＝7.55)的测量均提示患者手术前后的髌骨高度差异具有统计学意义(均P<0.01)。 结论平台髌骨角在反应膝关节表面置换术的髌骨高度变化具有准确性、可重现性、直观、简洁、快速的优点,可以有效地评估膝关节表面置换术后患者髌骨高度的变化。     

雄激素和雄激素受体对肝癌细胞株PEG10表达的作用

目的 探讨雄激素和雄激素受体(AR)对肝癌细胞株PEG10表达的调控作用.方法 设计合成针对人ARsiRNA,并转染HepG2和7404肝癌细胞株.用双氢睾丸酮(DHT)干预HepG2细胞.Western Blot检测AR和PEG10表达水平.结果 从3对AR siRNA中筛选到1对siRNA(AR siRNA-3),它在2种肝癌细胞株中均可有效抑制AR的表达,其抑制作用呈剂量依赖关系.2种肝癌细胞株中,浓度为240 nmol/L的AR siRNA-3在转染后24 h,对AR抑制效率可达80%以上,且抑制效果可持续至72 h.AR siRNA-3转染24h后PEG10表达水平降低,转染48 h后,PEG10表达水平降低非常明显,72 h后PEG10表达有所上升.DHT可促进HepG2细胞PEG10的表达,呈剂量依赖关系.DHT对AR表达未见明显作用.结论 雄激素和AR参与了肝癌细胞株PEG10表达的调控.这可能是男性肝细胞癌发病率较高的原因之一.     

抗结缔组织生长因子小分子干扰RNA防治大鼠肝纤维化研究

目的探讨经门静脉注射抗结缔组织生长因子(CTGF)小分子干扰RNA(siRNA)是否能在体内抑制大鼠肝CTGF基因表达及防治大鼠肝纤维化。方法雄性SD大鼠24只,均分成4组,模型组皮下注射40%CCl4(3ml/kg)及门静脉注射生理盐水,每3d1次,连续6周;预防组皮下注射CCl4及门静脉注射抗CTGFsiRNA(0.1mg/kg),每3d1次,连续6周;治疗组皮下注射CCl42周,随后再给予抗CTGFsiRNA及CCl44周;对照组门静脉注射生理盐水6周。于最后1次CCl4注射后3d行门静脉测压,并取血及组织标本,检测血清转氨酶、透明质酸(HA)及Ⅲ型前胶原(PⅢNP)浓度,应用RTPCR及Western印迹法检测CTGFmRNA及蛋白质在大鼠肝组织表达,应用HE及Siriusred胶原染色检测肝组织炎症及纤维化,应用偏光扫描对肝组织胶原染色面积进行定量。结果与模型组相比,预防组及治疗组大鼠肝组织CTGFmRNA及蛋白质表达显著下调,肝组织炎症、坏死及纤维化明显减轻,血清转氨酶、HA及PⅢNP浓度显著降低;预防组、模型组和治疗组的肝组织胶原染色面积分别为5.8%±0.8%、12.3%±0.8%和7.2%±0.9%(P<0.01);门静脉压力分别为(14.2±2.3)cmH2O、(20.6±5.8)cmH2O和(15.1±3.6)cmH2O(P<0.05),明显降低。结论经门静脉注射抗CTGFsiRNA能在体内显著抑制大鼠肝CTGF基因表达并能有效防治大鼠肝纤维化,提示抗CTGFsiRNA有潜力成为防治肝纤维化的一种新策略。     

全二维气相色谱飞行时间质谱在现代分析中的应用进展

全二维气相色谱-飞行时间质谱(GC×GC-TOFMS)技术是将全二维气相色谱的高分离效能与飞行时间质谱的强大结构定性识别功能完美结合,不仅实现对复杂物质体系更准确的分离、检测及结构鉴定,而且简化了样品的前处理过程,样品分析时间更短,为样品成分分析及结构鉴定提供了一个重要和全新的技术支撑。文章综述了全二维气相色谱-飞行时间质谱技术在燃料油、环境监测、中药化学成分等方面的应用进展,阐述其在各领域应用范围及研究现状,旨在为应用者提供参考依据,促进全二维气相色谱-飞行时间质谱的应用推广和技术发展。     

抗结缔组织生长因子小分子干扰RNA设计、合成及活性鉴定

目的　设计、合成及筛选高效抗肝纤维化关键基因———结缔组织生长因子 (CTGF)的小分子干扰RNA(siRNA)。方法　应用RNA设计软件 ,模拟SD大鼠CTGFmRNA二级结构 ,设计并合成针对CTGFmRNA 483、885及946位点的三对 2 1核苷酸 (nt)siRNA ,转染肝星状细胞系 (HSCT6) ,以空白及转染非特异siRNA(与CTGFmRNA无同源性的 2 1ntsiRNA)作为对照 ,应用逆转录 聚合酶链反应 (RT PCR)检测HSCT6细胞CTGFmRNA表达。结果　与对照相比 ,转染siRNA的HSCT6细胞CTGFmRNA明显下调 ,在 5 0～ 2 0 0nmol/L范围 ,CTGFmRNA下调幅度呈浓度依赖性增加 ,以 483siRNA 2 0 0nmol/L最显著 ,转染非特异siRNA的HSCT6细胞CTGFmRNA表达水平无明显变化。转染 483siRNA的HSCT6细胞 2 4、48及 72hCTGFmRNA分别较对照下调 91%± 2 %、65 %± 3 % (t =78.82 ,3 7.5 3 ,P均 <0 .0 1)和 10 %± 7% (t =2 .5 5 ,P =0 .0 6) ,在 2 4～ 72h范围 ,CTGFmRNA下调幅度呈时间依赖性降低。结论　成功筛选到能高效阻抑CTGF表达的 483siRNA ,其有效阻抑时间约 72h ,有望通过介导CTGFmRNA剪切而抑制肝纤维化的发生与发展 ,可发展为新一代防治肝纤维化的核酸药物     

siRNA对HSC结缔组织生长因子的抑制作用

目的研究化学合成的小分子干扰RNA (siRNA)对鼠肝星状细胞 (HSC)结缔组织生长因子 (CTGF)基因表达的抑制作用。方法针对大鼠CTGFmRNA 4 83、885和 94 6位点化学合成 3对 2 1核苷酸 (nt)siRNA ,分别以 5 0、10 0、2 0 0nmol/L浓度转染HSCT6 ,以空白及转染非特异siRNA作为对照 ,应用RT PCR检测CTGFmRNA表达 ,筛选出抑制效率最高的siRNA及其浓度 ;再转染HSCT6 ,抽提孵育 2 4、4 8、72h细胞总RNA及蛋白质 ,应用RT PCR和Westernblot检测CTGFmRNA及蛋白质表达。结果与对照相比 ,转染siRNA的HSCT6细胞CTGFmRNA表达水平明显降低 ,siRNA抑制效率在 5 0 ～2 0 0nmol/L范围呈浓度依赖性增高 ,以 4 83siRNA 2 0 0nmol/L最显著 ,转染非特异siRNA的HSCT6细胞CTGFmRNA表达水平无明显变化 ;转染 4 83siRNA的HSCT6细胞 2 4　 4 8、72hCTGFmRNA分别下调 (91± 2 ) %、(6 5± 3) % (P均 <0 .0 1)和 (10± 7) % (P =0 .0 6 34) ,蛋白分别下调 (86± 5 ) %、(94± 4 ) %和 (4 2± 9) % (P均 <0 .0 1)。结论化学合成 4 83siRNA能高效抑制HSC的CTGF基因表达 ,有效阻抑时间达 72h,提示化学合成siRNA具有预防和治疗肝纤维化的潜力     

顶空进样GC-MS分析柴胡不同炮制品的挥发性成分

目的:研究柴胡不同炮制品中的挥发性成分,为揭示"勿令犯火"的炮制规律提供参考。方法:采用顶空进样GC-MS分析。采用HP-5 MS色谱柱。初始温度60℃,保持2 min;以10℃·min-1至250℃,保持10 min。电离方式为电子轰击,电子能量70 e V,离子源温度230℃,四级杆温度150℃,进样量1μL。采用面积归一化法测定挥发性成分的相对含量并对其加以鉴定。结果:生品柴胡挥发性成分占总检出物的89.21%,鳖血拌制柴胡97.37%,鳖血炒制柴胡98.00%,酒制柴胡94.90%,醋制柴胡98.88%。各炮制品均共有戊醛、己醛、庚醛和1-戊醇等成分。其中己醛为生品柴胡、鳖血拌制柴胡及鳖血炒制柴胡中含量最高成分。戊醛、庚醛和2-戊基呋喃在鳖血炒制柴胡中的含量均高于其他炮制品。己酸为醋制柴胡中独有成分。结论:柴胡不同炮制品的挥发性成分差异较大,可能是其发挥药效的重要物质基础。     

大鼠虚热证模型的建立与评价

目的:对热性中药致虚热证模型的复制和评价进行探究。方法:使用不同剂量热性中药附子、干姜、肉桂灌胃大鼠。每天观察大鼠的活动状态、毛发光泽、爪色、二便等一般状况,每天定时测定大鼠的肛温、粪便量、尿液量、饮水量、饮食量,并于体液消耗量出现明显差异时采集血液和相关组织器官,测定血清三碘甲状腺原氨酸(T3),甲状腺素(T4),血浆环磷酸腺苷(cAMP)及环磷酸鸟苷(cGMP)含量的变化和相关脏器指数。结果:与空白组比较,各模型组大鼠饮水量、体液消耗量大多数升高,动物出现虚热证的证候;且血清中T4含量呈增高趋势,T3/T4降低。模型低剂量组和模型中剂量组的cAMP和cGMP含量与空白组比较大多数显著升高,而模型高剂量组含量则有所降低。结论:灌胃热性中药可以复制出虚热证模型,体液消耗量的增加对虚热证模型复制有一定的指导意义。