人内皮抑素在毕赤酵母中的表达、纯化及其对小鼠肺腺癌LA795细胞生长的抑制

目的通过基因重组技术获得能高效分泌表达人内皮抑素的毕赤酵母菌株;观察纯化的重组人内皮抑素(rhES)对小鼠肺腺癌LA795生长的抑制作用。方法 利用氯化锂转化法将人内皮抑素基因整合入毕赤酵母基因组,获得可分泌表达人内皮抑素(endostatin)的菌株。用肝素亲和层析的方法纯化目的蛋白。观察人内皮抑素对碱性纤维生长因子(bFGF)刺激的人血管内皮细胞系ECV－304细胞增殖的作用。将接种LA795肺腺癌细胞的T739小鼠随机分成2组,分别给予rhES和磷酸缓冲盐液(PBS)皮下注射,每日1次,连续14d。观察2组小鼠肿瘤生长情况。结果经筛选获得表达量较高的转化菌株,其表达的rhES能明显抑制bFGF刺激的人血符内皮细胞系ECV－304细胞的增殖,与对照组比较具有显苫差异(P＜0．001),动物实验表明其有效抑制小鼠肺腺癌LA795的生长(P＜0．001)。结论用毕亦酵母作为宿主分泌表达的rhES具有良好的生物学活性,能有效抑制小鼠肺腺癌LA795的生长。     

重组人内皮抑素对小鼠肺腺癌肿瘤血管生成及肺转移的抑制作用

目的：观察酵母表达重组人内皮抑素（recombinant human endostatin,rhES)对小鼠肺腺癌LA795原位肿瘤微血管生成及肺转移的抑制作用。方法：对含有人内皮抑素基因的重组酵母菌株进行诱导表达及纯化rhES;将接种LA795小鼠肺腺癌细胞的T739小鼠随机分成两组，每组各10只，于接种后第6日起始予rhES和磷酸缓冲盐液（PBS）皮下注射，每日1次，连续14d；观察两组小鼠原位肿瘤微血管生成情况及肺部肿瘤转移情况。结果：经甲醇诱导酵母转化子表达rhES，并用肝素亲和层析的方法获得纯化的rhES；治疗结束后用免疫组化方法观察两组小鼠原位肿瘤微血管密度发现rhES治疗组肿瘤微血管密度明显小于PBS对照组（P＜0．01）；观察两组小鼠肺部发现rhES治疗组小鼠肺部未见有明显肿瘤转移病灶，而PBS对照组小鼠肺部可见大量散在肿瘤转移病灶；两组小鼠肺湿重比较具有显著性差异（P＜0．01）。结论：rhES具有良好的生物学活性，显著抑制了小鼠肺腺癌LA795肿瘤血管生成，并能有效抑制肿瘤的肺部转移。     

重组人内皮抑素对小鼠肺腺癌肿瘤血管生成及肺转移的抑制作用

目的观察酵母表达重组人内皮抑素(recombinant human endostatin, rhES)对小鼠肺腺癌LA795原位肿瘤微血管生成及肺转移的抑制作用。方法对含有人内皮抑素基因的重组酵母菌株进行诱导表达及纯化rhES;将接种LA795小鼠肺腺癌细胞的T739小鼠随机分成两组,每组各10只,于接种后第6日起给予rhES和磷酸缓冲盐液(PBS)皮下注射,每日1次,连续14 d;观察两组小鼠原位肿瘤微血管生成情况及肺部肿瘤转移情况。结果经甲醇诱导酵母转化子表达rhES,并用肝素亲和层析的方法获得纯化的rhES;治疗结束后用免疫组化方法观察两组小鼠原位肿瘤微血管密度发现rhES治疗组肿瘤微血管密度明显小于PBS对照组(P<0.01);观察两组小鼠肺部发现rhES治疗组小鼠肺部未见有明显肿瘤转移病灶,而PBS对照组小鼠肺部可见大量散在肿瘤转移病灶;两组小鼠肺湿重比较具有显著性差异(P<0.01)。结论rhES具有良好的生物学活性,显著抑制了小鼠肺腺癌LA795肿瘤血管生成,并能有效抑制肿瘤的肺部转移。     

重组人内皮抑素在酵母中的表达及对人肺腺癌Astc-a-1细胞生长的抑制

目的在一种高效外源基因表达系统———毕赤酵母系统表达重组人内皮抑素,评价纯化的内皮抑素对人肺腺癌Astc-a-1细胞生长抑制的作用,为临床研究做进一步的探讨。方法和结果在酵母系统成功表达了重组人内皮抑素(re-combinant human endostatin),经肝素亲和层析得到了较高纯度的内皮抑素,经过筛选的人内皮抑素能够有效抑制ECV-304细胞的增殖,并与对照组有非常显著性差异(P<0.01);动物实验表明其能够有效抑制裸鼠肺腺癌Astc-a-1细胞的生长,统计学分析有非常显著性差异(P<0.01)。结论酵母系统内能够大量表达具有生物学活性的重组人内皮抑素,能在人体外有效抑制裸鼠肺腺癌Astc-a-1的生长,对其应用于临床具有重要意义。     

重组人内皮抑素对小鼠肺腺癌LA795的抑制作用

目的观察重组人内皮抑素(rhES)对小鼠肺腺癌LA795生长和转移的抑制作用。方法对ThES高效表达克隆pCX的表达产物进行纯化,得到ThES。将LA795肺腺癌细胞接种于T739小鼠背部皮下,随机分成2组,接种后第10天起分别给予rhES20mg/kg·b.w.或等体积PBS缓冲液皮下注射,1次/d,共14d。观察2组肿瘤生长情况、肺湿重、肺表面转移结节数、动物生存时间,分别进行t检验。结果治疗前后rhES组肿瘤体积分别为(650±201)mm3、(1642±211)mm3;而PBS组肿瘤体积由治疗前的(623±248)mm3增至(9194±952)mm3。rhES组肺湿重、肺表面转移结节数明显少于PBS组,动物生存时间明显延长(P<0.01)。结论rhES可明显抑制LA795所致的小鼠实验性肿瘤的生长与转移,延长动物的生存时间。     

内皮抑素基因腺病毒载体的构建及表达

目的：构建人内皮抑素（Human Endostatin，hE）基因的腺病毒载体，并研究其对胃癌细胞株SGC-7901、MKN-45及人脐静脉内皮细胞系ECV304生物学特性的影响。方法：采用Lipofectamine2000法将含有人内皮抑素基因的质粒pCA13-hE与pBGHE3共同转染293细胞；免疫荧光法及Western Blot检测hE的表达；用不同感染复数（Muhiplicity of infection，MOI）的重组人内皮抑素基因的腺病毒感染ECV304细胞，观察细胞生长。结果：成功构建了含hE基因的腺病毒载体；经含hE基因腺病毒载体感染的人SGC-7901胃癌细胞株、MKN-45胃癌细胞株均表达hE蛋白；表达的hE蛋白具有一定的生物学活性，可以抑制人静脉内皮细胞系ECV304的生长。结论：获得了有表达功能活性的Endostatin腺病毒载体，表达产物可抑制ECV304细胞的增殖，为肿瘤的抗血管基因治疗提供了必要条件。     

苏拉明对肺腺癌小鼠移植瘤的抑制作用及碱性成纤维细胞生长因子表达的影响

目的研究苏拉明联合顺铂对肺腺癌LA795细胞T739小鼠移植瘤的抑制作用和移植瘤内bFGF表达的影响。方法复制小鼠移植瘤模型，将32只接种高转移性LA795肺腺癌细胞的T739小鼠随机分成4组：对照组、顺铂组、苏拉明组和顺铂＋苏拉明组。用药干预16d，用药中观察肿瘤生长情况，于接种后24d处死各组小鼠，取出双肺和剥离皮下肿瘤，计算出肺转移发生率，计数各组小鼠肺表面转移结节数及算出肺表面结节转移抑制率。移植瘤标本行病理观察，免疫组化和图像分析系统定量检测肿瘤组织微血管密度（MVD）及碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）表达。结果各用药组肿瘤的生长受到抑制，瘤重明显低于对照组，其抑瘤率分别为23．03％、34．40％和56．30％。苏拉明组与对照组比肺表面转移结节数、肺转移发生率下降，肺表面结节转移抑制率上升，联合组更为明显。病理观察见各用药组肿瘤细胞出现坏死、苏拉明组及联合组肿瘤间质中血管数减少。苏拉明组，顺铂＋苏拉明组MVD、bFGF的表达都比对照组减少，差异有显著性（P〈0．01）；两者联合有协同下调MVD、bFGF表达的作用，而单用顺铂组与对照组比差异无显著性。结论苏拉明可明显抑制肺腺癌细胞在小鼠体内的生长和转移，与顺铂有协同作用，其机制可能与下调bFGF表达，抑制其微血管形成有关。     

重组人内皮抑素诱导人脐带静脉血管内皮细胞凋亡

目的观察人内皮抑素重组蛋白对人脐带静脉血管内皮细胞增殖的影响。方法采用细胞凋亡的荧光检测法检测对内皮细胞凋亡的影响。MTT法观察不同浓度的重组人内皮抑素对人脐带静脉血管内皮细胞（ECV304）增殖的抑制作用。结果重组人内皮抑素具有明显的抑制内皮细胞增殖的作用，ED50=550ng／ml，随重组蛋白浓度的增加抑制作用更为明显。结论重组人内皮抑素对细胞增殖的抑制与其浓度呈正相关，存在剂量效应关系；内皮抑素抗血管生成的机制与其抑制内皮细胞增殖、诱导内皮细胞凋亡有关。     

Effects of eukaryotic expression plasmid encoding human tumstatin gene on endothelial cells in vitro

摘要： 背景 肿瘤抑素（tumstatin）是一种新型的内源性血管生成抑制剂,目前的研究大都是用纯化的肿瘤抑素蛋白。本研究的目的是研究肿瘤抑素过表达质粒的体外抗血管生成作用,揭露其抑制血管内皮细胞生长的潜在机制,并寻找一种能够持续释放肿瘤抑素的方法。 方法：构建了肿瘤抑素真核表达质粒pcDNA-tumstatin并用它转染人脐静脉内皮细胞系ECV304细胞和人肾癌细胞系ACHN细胞。采用RT-PCR和Western blot技术分别检测tumstatin在两种细胞中的表达情况。通过细胞增殖实验（CCK-8）和细胞周期分析评价tumstatin 过表达对ECV304细胞增殖的影响。为研究pcDNA-tumstatin 体外抑制血管内皮细胞的机制,采用western blot技术检测细胞周期蛋白D1的蛋白水平。 结果 DNA测序确认了pcDNA-tumstatin质粒构建成功。RT-PCR和western blot 结果表明tumstatin能在这两种细胞中有效表达。Tumstatin基因转入后,ECV304细胞生长受到明显抑制,细胞周期停滞于G1期。我们的研究也表明,pcDNA-tumstatin可能通过下调cyclin D1蛋白的水平来抑制血管内皮细胞增殖。 结论 pcDNA3.1+介导的tumstatin过表达能够特异性的抑制血管内皮细胞的增殖,这可能是由于cyclin D1下调导致的细胞周期阻滞于G1期导致的。此外,基因治疗或许是持续释放tumstatin的一种新的策略。     

人内皮抑素基因的克隆、表达、纯化及活性测定

目的 获得有生物学活性的人内皮抑索蛋白。方法 用反转录多聚酶链反应(RT-PCR)得到人内皮抑素编码区基因，连接PGEM-T载体，测序确认，定向克隆入pBV220表达载体，转化大肠杆菌DH5α进行表达、纯化及活性测定。结果 经测序分析证实，所获得的552bp基因片段序列属于人内皮抑素基因，构建表达载体在大肠杆菌中表达，经SDS-PAGE分析，出现特异性蛋白质条带，并具有生物学活性。结论 人内皮抑素基因在大肠杆菌中获得非融合表达．表达蛋白能够抑制人脐静脉血管内皮细胞(ECV304)的增殖，为应用内皮抑素进行抗血管生成治疗奠定了基础。     

重组人内皮抑素在酵母中的表达及对人肺腺癌Astc－a－1细胞生长的抑制

OBJECTIVE: To achieve expression of recombinant human endostatin (rhES) in a highly efficient foreign gene expression system, the yeast strain Pichia pastoris, and to evaluate the inhibitory effect of rhES on the growth of nude mouse pulmonary adenocarcinoma cells. METHODS AND RESULTS: The rhES gene was efficiently expressed in the yeast strain, and heparin affinity chromatography yielded highly purified endostatin identified by Western blotting, which proved to significantly inhibit the growth of the ECV-304 cells in vitro and also the growth of the lung adenocarcinoma Astc-a-1 in nude mice. CONCLUSIONS: The rhES gene can be expressed in Pichia pastoris, and has the ability to restrain the growth of ECV-304 cells and lung adenocarcinoma Astc-a-1 in nude mice, showing important potentials for future clinical applications.     

人Endostatin在毕赤酵母菌中的表达及其抑癌活性研究

目的在毕赤酵母中获得有活性的分泌型重组Endostatin.方法一步法抽提胎肝总RNA,RT-PCR扩增endostatin全基因.用T-A克隆技术构建克隆载体;双酶切回收550bp的endostatin基因,亚克隆入酵母表达载体.重组质粒分别以PCR、酶切及测序鉴定.电转化法将线形化的重组表达DNA转导入GS¨5感受态细胞,SDS-PAGE电泳筛选阳性重组子,G25及Heprin亲和层析柱初步纯化重组蛋白.MTT法测定重组endosatatin对血管内皮细胞增殖的抑制作用.结果RT-PCR获得550bp的特异扩增条带,T-A克隆后,PCR挑选阳性重组子,测序证实序列正确;亚克隆后的表达载体,PCR可得550bp的特异条带,EcoRI、Not I双酶切获得550bp和3kb的条带,与预期一致,DNA测序证明核苷酸序列100%正确.SDSPAGE证实重组菌较空白有一明显条带,Heparin亲和层析后,1mol/INaCl洗脱的蛋白峰在体外可特异性抑制血管内皮细胞的增殖.结论在毕赤酵母菌中成功地获得了分泌表达的活性endostatin蛋白.     

苏拉明联合紫杉醇对LA795肺腺癌小鼠移植瘤生长的抑制作用及机制

目的观察苏拉明联合紫杉醇对LA795肺腺癌小鼠移植瘤生长的抑制作用,并探讨其作用机制。方法将32只皮下接种LA795肺腺癌细胞T739小鼠随机分为对照组、紫杉醇组、苏拉明组和联合组,每组8只。观察移植瘤生长情况,饲养24 d后处死小鼠,剥离皮下移植瘤,采用免疫组化检测移植瘤组织中血管生成素-2(Ang-2)和微血管密度(MVD)。结果紫杉醇组、苏拉明组和联合组移植瘤的生长明显受到抑制,以联合组生长最慢。对照组移植瘤质量大于其他3组(P<0.05)。紫杉醇组和苏拉明组移植瘤质量大于联合组(P<0.05);苏拉明组、紫杉醇组及联合组的抑瘤率分别为22.638%、25.629%及54.109%,其Q值为1.274(>1.15)。苏拉明组和联合组移植瘤组织内Ang-2的表达均低于对照组和紫杉醇组(P<0.05)。对照组移植瘤组织内MVD高于其他3组(P<0.05);紫杉醇组或苏拉明组移植瘤组织内MVD高于联合组(P<0.05)。移植瘤组织中Ang-2表达、MVD与移植瘤质量均呈正相关(r=0.468、0.526,P<0.01)。结论苏拉明可下调肿瘤组织Ang-2表达,抑制肿瘤内微血管形成,与紫杉醇联合对LA795肺腺癌小鼠皮下移植瘤生长发挥协同抑制作用。     

重组人内皮抑素提取方法的优化及其对膀胱癌的抑制作用

目的 摸索重组人内皮抑素(rhES)蛋白的最佳表达条件.探索内皮抑素(Es)对膀胱癌实体肿瘤及细胞系的抑制作用.方法 分别从不同异丙基-β-D硫代半乳糖苷(IPTG)浓度、加IPTG 时机、表达时间等几个方面对 rhES 的蛋白表达条件进行摸索和优化.活性检测:(1)动物实验:观察内皮抑素对裸鼠皮下移植瘤的生长情况的影响.(2)细胞实验:MTT法、肿瘤细胞生长曲线观察内皮抑素对T-24膀胱癌细胞系的作用.结果 rhES 在大肠杆菌中的表达量占总菌体蛋白的58.65%,纯化后的蛋白纯度为96.22%.动物实验:rhES的抑瘤率为66.8%.细胞实验:MTT实验中rhES的半数抑制浓度IC_(50)=22μg/ml;肿瘤细胞生长曲线表明第7天时rhES组的细胞数比对照组减少了58.75%.结论 本实验所优化的最佳表达条件可获得高表达、高活性的rh Es蛋白,Es不但对裸鼠接种的膀胱癌有抑制作用,对膀胱癌细胞系也有抑制作用.     

复方三根制剂对T739小鼠肺癌转移的实验研究

目的:探讨中药复方三根制剂对T739小鼠阻抑LA795肺癌转移的相关机制,为临床运用中药防治肺癌转移提供实验依据.方法:用中药复方三根制剂(FFSG)灌喂载有LA795高转移鼠肺腺癌的T739小鼠,进行整体实验性治疗.观察FFSG(FFSG组)对T739实验鼠移植瘤的抑瘤率及抗肺转移率.并与环磷酰胺(CTX)治疗组和空白对照组作比较.结果:FFSG组抑瘤率27.2%,CTX组抑瘤率89.4%;FFSG组抗肺转移率45.7%,CTX组59%;两组与对照组比较,差异有显著性意义(P<0.05).结论:FFSG具有一定抑制T739小鼠移植瘤生长和肺转移的作用.     

人CD40分子基因转染人脐静脉内皮细胞ECV-304

目的 构建人CD40的真核表达载体，建立持续、稳定高表达CD40的人脐静脉内皮细胞ECV-304。方法 将含有CD40的克隆载体pUCD40酶切后，再克隆到真核表达载体pCDNA3．1中，构建重组质粒pCDNA3．1（＋）／CD40，并对重组质粒进行酶切鉴定。然后用脂质体法将重组质粒转染ECV-304，G418筛选转染的细胞。RT-PCR、Western-blotting和流式细胞仪定性定量检测转染后的ECV-304的CD40的表达情况。结果 经酶切鉴定，重组体中已插入目的基因片段CD40。RT-PCR和Western-blotting证实，重组质粒转染的ECV-304中有CD40基因的表达，流式细胞仪检测转染后的ECV-304的CD40的表达率为95％。结论 成功构建了真核表达载体pCDNA3．1（＋）／CD40．并建立了高表达CD40的ECV-304，为筛选抗动脉粥样硬化药物奠定了基础.