丙型肝炎病毒E2蛋白作为酵母双杂交体系"饵"载体的构建及表达

目的 :用丙型肝炎 (丙肝 )病毒 (hepatitisCvirus,HCV)胞膜蛋白 2 (envelopeprotein 2 ,E2 )胞外区片段 ,构建酵母双杂交体系中“饵”载体 ,明确其在酵母细胞中的表达 ,排除自身激活作用 ,验证其能否用于酵母双杂交体系筛选cDNA文库。方法 :设计引物 ,从本室构建的含中国株Ⅲ型HCVE2片段的载体上 ,扩增出不包含C末端跨膜区的E2片段E2 6 6 1,经EcoRI和PstI双酶切后 ,克隆到酵母双杂交的“饵”载体pAS2 1质粒上 ,构建成载体pAS2 1 E2 6 6 1。阳性克隆经EcoRI和PstI双酶切鉴定后 ,转入酵母中 ,用酵母蛋白抽提物作Western杂交 ,证实其表达 ;滤膜印记杂交验证其有无自身激活作用。结果 :所构建的载体 pAS2 1 E2 6 6 1双酶切后 ,片段大小正确 ;转入酵母后 ,提取酵母质粒 ,PCR扩增出预期大小的片段 ,Western杂交出现阳性条带 ;滤膜杂交 ,转有 pAS2 1 E2 6 6 1和阴性对照pLAM5 ' 1的酵母菌落没有激活报告基因 ,而GAL4全长的阳性对照菌落变为蓝色。结论 :含有HCVE2 6 6 1的“饵”载体构建正确 ,在酵母细胞中能表达出E2蛋白 ,并且没有自身激活报告基因的功能 ,能够应用于酵母双杂交体系。     

乙型肝炎病毒前S区不同片段在酵母双杂交系统中的表达及对报告基因激活作用的检测

目的　用含乙型肝炎病毒 (HBV)前 S区不同大小的c DNA片段构建酵母双杂交诱饵载体 ,并检测其表达产物对酵母细胞有无毒性作用及对报告基因有无激活作用 .方法　PCR扩增含 HBV前 S区不同大小的 c DNA片段 ,分别克隆入 p U C19质粒 ,经测序正确后 ,再分别亚克隆入酵母双杂交诱饵载体 p GBKT7中 .将重组质粒导入酵母菌 AH10 9,检测其表达产物在酵母细胞中对报告基因有无激活作用 .结果　成功获得含 HBV前 S区不同大小的 c DNA片段 ,HBV前 S区不同片段所表达的蛋白对酵母菌 AH10 9无毒性 ,但是对报告基因均有激活作用 .结论　不能利用酵母双杂交 Gal4系统 3来研究与 HBV前 S区相互作用的蛋白 ;证实了 HBV前S区不同片段所表达的蛋白的自激活功能 ,为进一步研究乙型肝炎病毒致病机制打下了基础     

Bit1基因在酵母双杂交系统中的表达及对报告基因激活作用的检测

目的:用Bit1基因片段构建酵母双杂交诱饵载体,并检测其表达产物对酵母细胞有无毒性作用及对报告基因有无激活作用. 方法:运用RT-PCR技术从卵巢癌细胞系Caov-3中扩增出Bit1基因片段,克隆入pUC19质粒,经测序正确后,再克隆入酵母双杂交诱饵载体pGBKT7中,将重组质粒导入酵母菌AH109,检测其表达产物在酵母细胞中对报告基因有无激活作用. 结果:成功获得Bit1基因片段,Bit1基因表达的蛋白对酵母菌AH109无毒性,对报告基因亦无激活作用. 结论:可以利用酵母双杂交Gal4系统来研究与Bit1相互作用的蛋白.     

HCV核心蛋白在酵母双杂交系统中的表达及自激活作用检测

目的: 检测用含丙型肝炎病毒(HCV)核心蛋白的cDNA片段构建的酵母双杂交诱饵载体的表达产物对酵母细胞有无毒性作用及对报告基因有无激活作用. 方法: PCR扩增含HCV核心蛋白不同大小的cDNA片段,分别克隆入pUC19质粒,经测序正确后,再分别亚克隆入酵母双杂交诱饵载体pGBKT7中. 将重组质粒导入酵母菌AH109,检测其表达产物在酵母细胞中对报告基因有无激活作用. 结果: 成功获得含HCV核心蛋白的cDNA片段,HCV核心蛋白对酵母菌AH109无毒性,且对报告基因无激活作用. 结论: 利用酵母双杂交Gal4系统3研究与HCV核心蛋白相互作用的蛋白,证实了HCV核心蛋白无自激活功能.     

用于筛选COPS3相互作用蛋白酵母双杂交诱饵载体pGBKT7-COPS3的构建及鉴定

目的 用COPS3基因片段构建酵母双杂交GAL4系统的诱饵载体pGBKT7-COPS3，并检测其表达产物对酵母细胞有无毒性及对报告基因有无激活作用。方法 运用RT-PCR技术从骨肉瘤细胞系SOSP-9607中扩增出COPS3基因片段，克隆入pUC19质粒，经测序正确后，插入酵母双杂交诱饵载体pGBKT7中，将重组质粒导入酵母菌AH109，检测其表达产物在酵母细胞中对报告基因有无激活作用。结果 成功获得COPS3基因片段，其表达蛋白对酵母菌AH109无毒性，对报告基因亦无激活作用。结论可以利用酵母双杂交GAL4系统来研究与COPS3相互作用蛋白。     

乙型肝炎消毒前S区不同片段在酵母双杂交系统中的表达及对报告基因激活作用的检测

目的 用含乙型肝炎病毒（HBV）前S区不同大小的cDNA片段构建酵母双杂交诱饵载体，并检测其表达产物对酵母细胞有无毒性作用及对报告基因有无激活作用。方法 PCR扩增含HVB前S区不同大小的cDNA片段，分别克隆入pUC19质粒，经测序正确后，再分别亚克隆入酵母双杂交诱饵载体pGBKT7中。将重组质粒导入酵母菌AH109。检测其表达产物在酵母细胞中对报告基因有无激活作用。结果 成功获得含HBV前S区不同大小的cDNA片段，HBV前S区不同片段所表达的蛋白对酵母菌AH109无毒性，但是对报告基因均有激活作用。结论 不能利用酵母双杂交Ga14系统3来研究与HBV前S区相互作用的蛋白；证实了HBV前S区不同片段所表达的蛋白的自激活功能，为进一步研究乙型肝炎病毒致病机制打下了基础。     

杜氏盐藻S腺苷高半胱氨酸水解酶酵母双杂交诱饵载体的构建及自激活和毒性检测

目的:构建杜氏盐藻S腺苷高半胱氨酸水解酶(SAHH)的酵母双杂交诱饵载体pGBKT7-SAHH,并检测其对酵母细胞的毒性和自激活作用。方法:应用RT-PCR扩增杜氏盐藻的SAHHcDNA,测序分析后与酵母双杂交诱饵载体pGBKT7连接,构建诱饵载体pGBKT7-SAHH。用PEG/LiAc法将诱饵载体转入AH109和Y187酵母中,通过表型筛选检测诱饵蛋白对酵母有无毒性和自激活作用。结果:成功构建了诱饵载体pGBKT7-SAHH并成功转化到酵母细胞AH109和Y187中,表达的融合蛋白对宿主酵母细胞无毒性。在AH109和Y187酵母细胞中诱饵载体均未激活报告基因HIS3和ADE2,但是激活了报告基因MEL1。结论:诱饵载体pGBKT7-SAHH可用酵母双杂交方法筛选与SAHH相互作用的蛋白。     

PER1与RACK1蛋白作用位点分析

目的 筛选人下丘脑视交叉上核(SCN)区域内与PERIOD1(PER1)相互作用的新蛋白,研究RACK1与PER1的作用特点,明确其结合的关键结构域.方法 采用酵母双杂交方法,筛选得到人SCN区域内与PER1-PAS结构域相互作用的新蛋白,并构建5种表达不同长度RACK1片段的酵母文库质粒与PER1诱饵质粒共转染酵母AH109进行杂交,通过营养缺陷筛选、报告基因检测获得阳性克隆,并采用体外转录、免疫共沉淀实验证实阳性克隆蛋白间的相互作用.结果 酵母双杂交筛选得到人SCN区域内表达RACK1蛋白的克隆,重组RACK1表达质粒与PER-PAS诱饵质粒进行酵母双杂交筛选后得到三个阳性克隆:RACK1(WD1-7)、RACK1(WD4-7)和RACK1 (WD5-7),β-半乳糖苷酶测试阳性证实报告基因表达,免疫共沉淀结果显示阳性克隆与PER1蛋白间存在相互作用.结论 RACK1与PER1存在直接相互作用,RACK1含有7个WD40结构域,本研究发现与PER1结合的最小区域位于Ⅴ、Ⅵ、Ⅶ三个WD40结构域,提示其碳端序列为其结合的关键部位.     

酵母双杂交研究小鼠肝脏再生TGF-β调控通路中相关转录因子的相互作用

目的 采用酵母双杂交系统研究肝脏再生调控途径转化生长因子β(TGF-β)信号通路中4种转录因子的相互作用.方法 经CCl4腹腔注射诱导建立小鼠肝损伤再生模型,提取模型小鼠肝脏组织总RNA作为模板,经RT-PCR获得cDNA.经肝脏再生基因芯片检测显示差异表达且与TGF-β信号通路相关的激活转录因子3(ATF3)、DNA结合抑制因子3(ID3)、DNA损伤诱导的转录因子3(DDIT3)和LIM蛋白家族成员FHL2(FHL2)作为候选基因,进行基因克隆和载体构建,PCR及DNA测序鉴定.采用酵母双杂交系统进行自激活检测实验和酵母双杂交实验,观察ATF3、FHL2、DDIT3和ID3之间的相互作用.结果 PCR及DNA测序鉴定表明,ATF3、FHL2、DDIT3、ID3基因克隆与载体构建成功.自激活检测显示ATF3、FHL2、DDIT3和ID3不存在自激活现象;酵母双杂交实验发现7对蛋白互作,分别为ID3/ATF3、FHL2/ATF3、ATF3/ATF3、FHL2/FHL2、ID3/FHL2、ID3/ID3和ID3/DDIT3.结论 ATF3、FHL2和ID3间的蛋白互作可能对TGF-β信号通路具有调控作用;蛋白互作网络可作为肝损伤再生机制研究的途径之一.     

杜氏盐藻寡糖基转移酶亚基stt3a酵母双杂交诱饵载体的构建及自激活和毒性检测

目的:观察杜氏盐藻寡糖基转移酶亚基stt3a的酵母双杂交诱饵载体表达产物对酵母细胞有无毒害作用并检测其自激活作用.方法:应用PCR方法获得stt3a可溶端的基因片段,将基因片段按正确的方向插入到酵母表达质粒pGBKT7中,经限制性内酶切鉴定正确后,用PEG/LiAc法转化到酵母菌株Y187中,并通过表型筛选检测诱饵蛋白...     

麻疹的双相移位研究进展

近年新生儿、婴儿、成人麻疹患者逐年增加,临床表现一般仍较典型,成年人麻疹患者全身中毒症状较重。麻疹抗体检测结果阳性是主要的诊断依据。麻疹发病的双相移位的机理可能是,免疫保护力不足,婴儿出生时麻疹抗体力低。孕期母传胎的麻疹抗体减弱,母经乳汁传给婴儿的抗体减弱,成人麻疹抗体水平逐年下降。预防措施是怀孕前给予育龄妇女麻疹疫苗接种,鼓励母乳喂养,麻疹疫苗计划免疫适当提前,在成人追加麻疹疫苗的免疫,加强病毒变异的研究等。     

人工全髋关节置换术的手术配合

目的：介绍人工全髋关节置换术的手术配合做法;方法：主要在手术配合的六个方面,解决防感染、防栓塞等问题。结果：30例人工全髋关节置换术均获成功,结论：手术配合是护士责任心和基本功的全面体现,对提高手术效果有至关重要的影响。     

尿液pH值对红细胞检验影响的探讨

[目的 ]通过尿液 pH值对红细胞检验影响的观察 ,更加科学、准确地诊断血尿和血红蛋白尿。[方法 ]采用干化学分析仪检测和尿液显微镜红细胞计数 ,观察 180例正常人尿标本加入正常人血标本后 ,不同 pH值 ,不同时间内 ,观察红细胞溶解情况。 [结果 ]pH <5 .5以下时 ,随着时间的延长 ,红细胞溶解现象明显。 1h后观察有显著性差异 (P <0 .0 5 ) ;2h后有非常显著性差异 (P <0 .0 1)。[结论 ]pH <5 .5时对红细胞计数影响较大 ,易致红细胞发生溶解现象 ,出现假性血红蛋白尿 ,对血尿和血红蛋白尿很难区分 ,给临床诊断造成不便 ,更易引起漏诊和误诊。     

87株幽门螺旋杆菌VacA等位基因的分析

目的以研究方法LiPA（Line Probe Assay）分析VacA等位基因的表达,了解幽门螺旋杆菌致病机理的理解。方法从三个不同城市87位进行胃镜检查患者的胃粘膜中培养出幽门螺旋杆菌,提取DNA,用LiPA方法分析VacA等位基因。结果（1）87位患者以sic（88．5％）和m2a（63．2％）分布为主,未发现s1b和s2;（2）混合菌株感染率为41．4％,远远高于西方国家,其中上海的混合感染率最高（62．5％）,与北京（41．0％）和南宁（20．8％）相比具有显著性差异,P〈0．01;（3）北京、海、南京三个不同城市s1、m等位基因亚型分布率存在差异;（4）溃疡病和非溃疡病患者m1和m2的分布率没有显著性差异。结论我国幽门螺旋杆菌多重菌株感染率较高,不同的m基因型与消化性溃疡的发生无显著性相关。     

喉癌主癌灶手术切缘的临床特点分析

目的探讨研究喉癌主癌灶手术的安全切缘在临床上的特点。方法回顾性分析2007年6月—2011年3月已经确诊喉癌的患者100例,随机分成A、B两组,A组为观察组50例,主要采取手术切缘后,然后采取镜下观察分析;B组为观察组50例,主要采取手术切缘后,然后采取肉眼观察分析,将结果进行临床特点分析比较。结果早期的喉癌患者和晚期的喉癌患者的阳性切缘例数,差异无统计学意义（P〉0.05）;晚期的阳性切缘发生次数高于早期的阳性切缘发生次数,差异有统计学意义（P〈0.05）。声门上区[SG]2、3和5、10mm;跨声门型[TG]2、3mm和5、10mm的切缘对比,差异有统计学意义（P〈0.05）。SG、G、TG、IG的2mm和3mm,5mm和10mm对,差异无统计学意义（P〉0.05）。肉眼阳性切缘观察39个,镜下阳性切缘观察43,两者差异无统计学意义（P〉0.05）。结论依据原发不同部位、不同分期和不同范围选取适合的切线,就可以有效地减少阳性切缘的发生。     

儿童腹痛328例病因诊断及分析

目的：根据儿童急性腹痛的特点，诊断儿童腹痛应综合临床及相关检查提供的依据，做出准确诊断，给予适当治疗。方法：对临床328例腹痛患儿进行选择性辅助检查和分析。结果：小儿腹痛病因复杂，腹腔内疾病占64．63％，共17种病因；腹腔外疾病占35．37％，共6种病因。结论：仔细询问病史、认真体格检查、密切观察病情、针对性地选择辅助检查，在儿童腹痛的诊断上具有重要的意义。     

妊娠晚期重度妊高征的监测

重度妊高征表现为高血压、蛋白尿、浮肿等症状 ,严重可以导致母婴死亡。对妊娠足月的重度妊高征 ,可以根据其临产与否及宫颈条件 ,立即决定其为阴道分娩或是剖宫产术。对于妊娠晚期的重度妊高征 ,因其胎龄不足月 ,胎儿生长发育及胎肺成熟度情况需通过一定时间的治疗 ,根据其病情变化来决定其治疗方案或终止妊娠的时机[1,2 ] 。这就需要我们对这一阶段的治疗进行监测 ,防止母儿并发症的发生。现将 2 0 0 0年至今我院收治妊娠晚期重度妊高征 30例的监测结果回顾分析如下。1　资料和方法1.1　研究对象　选择孕 31～ 36周重度妊高征 30例 ,其中 …     

80例局限性银屑病误诊原因分析

本文报告80例局限于小腿或手或足的银屑病。均经皮肤组织病理检查确诊。因部位比较特殊。受多种理化因素影响,使皮疹形态发生轻重程度不同的变化,常看不到典型损害,因而误诊为神经性皮炎,湿疹,慢性皮炎及癣等。作者对误诊原因进行了分析后,提出了鉴别诊断方法。     

腰椎间盘突出症再次手术的原因分析

目的解决腰椎间盘突出症手术中神经压迫。方法对1980～1998年再手术资料进行统计分析,讨论分析再手术原因,再次手术前影像学检查,观察病理变化以确定再手术方法。结果对11例随访6个月～1年,优7例(68．4％),良3例(36．8％),差1例(2．8％)。结论初次手术前详细查体和分析X线片,术中用导尿管和神经剥离探查,尽量避免髓核遗留,手术范围不宜太大,尽量减少对软组织和脊柱结构的破坏,避免形成硬膜囊与神经根粘连而致单纯形疤痕。