芫根调节免疫功能的小肠转录组学研究

利用生物信息学技术初步探索芫根调控肠道免疫功能的分子生物学机制。方法 选择雄性SPF级BALB/c小鼠18只，随机分为3组，每组6只。SC1组小鼠每只每次灌胃芫根提取液150 μL，SC2组小鼠每只每次灌胃绞碎芫根原浆悬液150 μL，NC组小鼠每只每次灌胃生理盐水150 μL，连续7 d每日灌胃一次。分别取每组小鼠小肠组织样品提取RNA，总RNA的质检合格后，进行转录组测序。按GO功能和KEGG信号通路对差异表达基因聚类分析揭示差异表达高度富集的免疫相关通路。从免疫角度分析芫根灌胃小鼠小肠组织的基因表达变化情况。结果 转录组测序共检测到27733条 mRNA的表达，SC1组与NC组比较，显著差异表达基因1635个，其中上调差异表达基因1236个，下调差异表达基因399个；SC2组与NC组比较，显著差异表达基因2872个，其中上调差异表达基因2233个，下调差异表达基因639个（P＜0.05）。按GO功能和KEGG信号通路聚类分析显示差异表达基因在白介素分泌、干扰素反应、T细胞受体信号通路及维生素和脂肪消化吸收等途径的富集度在两个芫根组中均居于前20位（P＜0.01），肠黏膜趋化因子CCL20和巨噬细胞极化标志物CD274等免疫蛋白编码基因差异表达显著且同属于上述多个免疫通路。结论 芫根灌胃小鼠小肠的差异表达基因在白介素分泌、干扰素反应、T细胞受体信号通路、营养物质消化吸收等途径高度富集，提示芫根对肠道免疫系统及肠黏膜功能的调节，其中CD274的表达上调和CCL20的表达下调提示诱导M1型巨噬细胞极化和T细胞活化可能是芫根调控免疫和维护肠道正常结构功能的重要途径。     

Bcr／abl特异性RNA干扰真核表达载体的构建

目的：构建特异性的抗慢性髓细胞白血病融合基因bcr／abl mRNA的siRNA真核细胞表达载体，探索RNA干扰(RNAi)分子靶向治疗慢性髓细胞性白血病(CML)的作用。方法：根据GenBank数据库提供的bcr／abl基因核苷酸序列，按照Tusehl设计原则，选择设计双链小干扰RNA(small interfering RNA，siRNA)，再转化为能表达其小发卡结构RNA(Small hairpin RNAs，shRNA)的DNA序列，并与pTER质粒定向连接，构建受控于人RNA聚合酶Ⅲ启动子H1的真核表达载体pTER／shRNA1、pTER／shRNA2，经限制性内切酶酶切和DNA测序进行鉴定。结果：构建慢性粒细胞白细胞bcr／abl融合基因siRNA真核表达载体pTER／shRNA1、pTER／shRNA2，经限制性内切酶酶切和DNA测序证实与设计完全一致。结论：抗慢性粒细胞白细胞bcr／abl融合基因siRNA真核细胞表达载体的构建成功。     

SERPINA3K原核表达系统的构建及其表达

目的：通过构建丝氨酸蛋白酶抑制因子SERPINA3K的原核表达载体,并将其转化到Rosetta-g ami2感受态细胞中,表达重组SERPINA3K,从而为对其功能的深入研究奠定了基础.方法：以小鼠MS-1细胞cDNA为模板通过PCR的方法扩增Serpina 3k基因的表达全片段,再将其插入到原核表达载体pET-41a中,酶切并测序鉴定重组体.将构建好的重组质粒转化大肠杆菌Rosetta-gami2感受态细胞,表达产物用Western blot鉴定.结果：原核表达载体pET-4 1a-Serpina 3k成功构建,可在大肠杆菌Rosetta-gami2中高效表达,得到重组蛋白SERPINA3K,经Western blot鉴定正确.结论：成功构建SERPINA3K原核表达载体且获得表达,为研究SERPINA3K生物学活性及产品开发提供了实验基础.     

吗啡成瘾小鼠对正常小鼠学习记忆力能力的影响

目的:用BALB/C小鼠建立动物模型,观察吗啡成瘾戒断小鼠对其周围的正常小鼠学习记忆能力的影响。方法:将吗啡成瘾戒断小鼠与正常小鼠同笼饲养,然后用Morris水迷宫实验测定正常小鼠的学习记忆能力,应用RT-PCR的方法检测正常小鼠海马中PKCa、GABA分子表达的变化。结果:水迷宫实验证明,与生理盐水组相比,实验组小鼠的学习记忆能力明显降低(P<0.05),海马中PKCa和DABA的表达都明显升高(P<0.05)。     

双歧杆菌胞壁蛋白诱导人肠腺上皮细胞β-防御素2(hBD-2)mRNA的表达

目的 :检测双歧杆菌对人肠腺上皮细胞 β 防御素 2基因的激活作用及其活性组分。方法 :应用逆转录聚合酶链反应 (RT PCR)法和Northern杂交检测HT 2 9细胞hBD 2mRNA的表达 ;采用超声破碎细胞、超速离心、蛋白萃取等方法分离双歧杆菌胞壁蛋白质成份。结果 :RT PCR和Northern杂交分析显示 ,在正常培养条件下HT 2 9细胞无可见的hBD 2mRNA表达信号 ,但在双歧杆菌菌体、细胞壁和胞壁蛋白刺激下均检测出显著的hBD 2mRNA表达。结论双歧杆菌能诱导人肠腺上皮细胞hBD 2基因的表达 ,双歧杆菌胞壁蛋白可能是其诱导作用的活性组分。双…     

节律基因mClock在肿瘤实验化疗中的作用

目的 研究节律基因mClock在顺铂诱导小鼠Lewis肺癌细胞(LLC)凋亡中的作用.方法 体外采用12-十四酸佛波酯-13-乙酸盐(PMA)诱导LLC细胞近日节律,荧光定量聚合酶链式反应(PCR)检测细胞mClock基因的节律性表达.于诱导后不同时间点,顺铂(CDDP)处理细胞,24 h后四甲基偶氮唑盐比色法(MTT)法和流式细胞术检测(FCM)其对细胞的增殖与凋亡的影响.采用脂质体介导方法将mClock基因转染至LLC细胞,顺铂处理细胞,24 h后MTT法和流式细胞术检测其对细胞的增殖与凋亡的影响.结果 PMA作用LLC后,mClock基因呈现节律性表达.PMA诱导LLC节律表达的不同时间点,细胞对顺铂的敏感性不同.mClock过表达使顺铂作用后LLC凋亡率下降,细胞增殖明显.结论 mClock能够抑制顺铂诱导LLC的凋亡.     

Tat蛋白对节律基因表达的影响

【摘要】目的 探讨HIV Tat 蛋白是否可以在细胞内影响主要节律基因Clock,Cry,Bmal1,Per的表达。方法 用lipofectamineTM2000将HIVat表达质粒转入PC12细胞,使Tat在PC12细胞中表达。转染48h后提取mRNA和蛋白,分别通过实时荧光定量PCR技术和Western blot技术检测节律基因在mRNA和蛋白水平表达的变化。结果 研究结果显示,与未处理组和空质粒组相比,转染组Cry1的表达水平显著升高（P＜0.05）;Clock的表达水平显著降低（P＜0.05）;Bmal1和Per的表达水平无明显变化（P＞0.05）。 结论 HIV Tat影响了近日节律基因Cry1和Clock的表达,表现为Cry1表达水平升高,Clock表达水平下降,提示TAT蛋白可以影响节律基因的表达并且可能通过对近日节律的影响调节细胞生理功能。     

hPeriod1PAS结构域相互作用蛋白的筛选和研究

目的寻找与近日节律系统核心基因Period1（Per1）相互作用的新蛋白，揭示近日节律相关的可能信号通路。方法采用酵母双杂交方法，以人Per1的PAS结构域为诱饵，扫描人下丘脑cDNA文库，并通过体外转录、免疫共沉淀验证蛋白间相互作用；通过RT—PCR检测RACK1（receptors for activated Ckinase）表达的组织特异性及节律性；运用RNAi技术初步研究RACK1与Per1的信号联系。结果人下丘脑区域RACK1蛋白与Per1存在相互作用；RACK1在多器官组织保守表达，但其表达未呈现明显节律性；上调及下调Per1表达，RACK1的RNA水平无显著变化。结论细胞内接头分子RACK1是一种新的Per1作用蛋白，可能介导、调控Per1的功能。     

双歧杆菌胞壁蛋白诱导人肠腺上皮细胞β-防御素-2 mRNA的表达

目的 检测双歧杆菌对人肠腺上皮细胞β-防御素-2(hBD-2)基因的激活作用及其活性组分．方法 应用遵转录聚合膏链反应(RT—PCR)法和Northern杂交检测HT-29细胞hBD-2mRNA的表达；采用超声破碎细胞、超速离心、蛋白萃取等方法分离双歧杆菌胞璧蛋白质成分．结果 RT—PCR和Northern杂交分析显示，在正常培养条件下HT-29细胞无可见的hBD-2mRNA表达信号，但在双歧杆菌菌体、细胞璧和胞璧蛋白刺激下均检测出显著的hBD-2mRNA表达．结论 双歧杆菌能诱导人肠腺上皮细胞hBD-2基因的表达。双歧杆菌胞壁蛋白可能是其诱导作用的活性成分。     

PMA诱导节律基因表达对细胞紫外线损伤的影响

目的研究诱导NIH3T3细胞节律基因表达对细胞紫外线损伤的影响。方法用体外节律诱导剂乙酰肉豆蔻佛波酯诱导NIH-3T3细胞节律基因表达。分别选择mPer2基因表达的谷值和峰值时刻对细胞进行紫外线照射,以非诱导节律的单纯照射组为对照,通过流式细胞术检测细胞凋亡和细胞周期分布,平板克隆形成试验检测细胞增殖情况。结果mPer2基因表达峰值时进行紫外线照射的细胞,与mPer2基因表达谷值时和非诱导节律紫外线照射细胞比较,增殖能力强、凋亡率低、G1期阻滞明显。结论节律基因诱导的NIH3T3细胞的紫外线损伤减小,并与mPer2的基因表达相关,其保护作用可能与mPer2基因过表达有关。