体外诱导成体大鼠骨骼肌组织来源的干细胞向神经干细胞的转化

目的研究成体Sprague-Dawley(SD)大鼠骨骼肌来源的干细胞(MDSCs)体外诱导向神经干细胞(NSCs)分化的可行性。方法通过酶消化和连续贴壁的方法体外分离成年SD大鼠腓肠肌中的MDSCs。当传代至4-6代时,加入神经干细胞的特殊培养基Neurobasal-A和细胞因子进行诱导分化。用免疫细胞化学、Western blot以及realtime-PCR方法进行鉴定。结果MDSCs在神经干细胞特殊培养基中培养7~10 d后可形成类似神经球的细胞聚集物。运用免疫细胞化学、Western blot以及realtime-PCR检测发现MDSCs的标记蛋白结蛋白(desmin)表达下调,NSCs的特异性抗原神经巢蛋白(Nestin)开始表达。结论在神经干细胞的特殊培养基培养7~10 d后,MDSCs能够向神经干细胞转化。这种现象提示MDSCs有可能作为治疗神经系统疾病尤其是神经退行性疾病的一种新的干细胞来源。     

丁酸钠对大鼠骨髓间充质干细胞向平滑肌细胞分化的影响

目的探讨组蛋白去乙酰化酶抑制剂(histone deacetylase inhibitors,HDACi)丁酸钠对在体外与膀胱平滑肌细胞(bladder smooth muscle cells,BSMCs)接触共培养的骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)分化能力的影响。方法常规培养大鼠BMSCs及BSMCs至第3代,种植于多孔膜两侧进行接触共培养。实验组BMSCs培养上室面添加含3 mmol/L丁酸钠诱导其分化;对照组不含丁酸钠行接触共培养。免疫荧光化学染色法对2组BMSCs中平滑肌标志性蛋白calponin进行检测,同时用逆转录PCR(RT-PCR)和荧光定量PCR法(real-time PCR)对BMSCs中平滑肌α肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)、calponin、平滑肌肌球蛋白重链(smooth muscle-myosin heavy chain,SM-MHC)行进鉴定。结果大鼠原代BMSCs流式检测显示CD29、CD44、CD166表达阳性,阳性率分别为96.55%、92.76%、99.54%;CD31、CD45表达阴性,阳性率为1.39%、5.56%。BSMCs鉴定α-SMA、calponin、SM-MHC 3种标志性蛋白的表达均为阳性。细胞免疫荧光染色显示平滑肌标志性蛋白calponin的表达均随时间的延长而增加,实验组表达强度明显高于对照组。RT-PCR和荧光定量PCR显示实验组中BMSCs平滑肌标志性基因α-SMA、calponin、SM-MHC随共培养时间的延长逐渐增多,与对照组比较有明显差异(P<0.05)。结论 HDACi丁酸钠可以增强BMSCs向平滑肌细胞的分化能力,提示提高组蛋白乙酰化程度可以促进BMSCs分化。     

MHP 36神经干细胞体外经Ⅳ型胶原诱导向平滑肌细胞分化的研究

目的研究MHP 36神经干细胞在体外经Ⅳ型胶原诱导向平滑肌细胞的分化潜能。方法体外培养MHP 36神经干细胞,采用Ⅳ型胶原在37℃培养箱促分化,在分化第1、2、4天分别收获细胞并通过PCR和Western免疫印迹分别检测平滑肌细胞特异性标志物(SMαA,SMMHC,SM22,Myocardin)基因和蛋白表达。最后对分化第4天的细胞进行细胞免疫荧光染色来鉴定SMαA、SMMHC的表达。结果 MHP36神经干细胞在37℃培养条件下从第2天开始逐渐变长、呈梭形,并在培养基中形成螺旋状结构。PCR及免疫印迹证实SMαA,SMMHC,SM22,Myocardin的基因和蛋白表达从分化第1天到第4天显著增加(P<0.05)。此外,分化第4天的细胞表达成熟的SMαA,SMMHC胞浆蛋白。结论 MHP36神经干细胞在体外经Ⅳ型胶原诱导可向平滑肌细胞分化,并表达平滑肌细胞的特异性标志物。     

Jagged1蛋白在肌源性干细胞分化为神经样细胞过程中的表达差异

目的Jagged1蛋白在大鼠肌源性干细胞（MDSCs）体外增殖分化为神经样细胞过程中的表达差异研究。方法大鼠乳鼠骨骼肌消化后体外培养增殖,第5代传代后细胞分为2组：对照组完全培养基培养,诱导组加入诱导剂诱导。6d后观察2组细胞的形态变化,并进行NSE免疫细胞化学鉴定。然后通过免疫荧光观察Jagged1蛋白的表达差异。结果诱导组细胞NSE染色阳性,免疫荧光结果显示对照组Jagged1蛋白表达阳性,实验组基本不表达。结论大鼠肌源性干细胞分化为神经样细胞过程中Jaggedl蛋白表述存在明显差异。     

大鼠骨髓间充质干细胞向表皮细胞分化的初步研究

目的体外分离培养骨髓间充质干细胞,并探索表皮细胞生长因子诱导MSCs分化的潜能及条件.方法采用直接贴壁法,分离培养大鼠股骨和胫骨骨髓间充质干细胞,应用免疫细胞化学法检测细胞CD44、CD106、CD29、CD90、CD34等,对分离的细胞进行鉴定.以10～40 ng/ml的表皮生长因子处理第3代MSCs,观察细胞角蛋白的表达.用Western blot方法摸索integrin β1的表达与MSCs分化状态的关系.结果原代培养的骨髓间充质细胞CD44、CD106、CD29、CD90免疫细胞化学染色为阳性,CD34为阴性,符合骨髓间充质干细胞特征.MSCs经不同浓度的EGF体外诱导7 d后,免疫细胞化学结果显示,EGF浓度为30 ng/ml和40 ng/ml时,细胞角蛋白出现阳性表达;体外诱导14 d,呈角蛋白染色阳性的细胞比例进一步增加,同时integrin β1表达量下降.结论体外培养的MSCs在EGF诱导下,具有分化为表皮细胞的倾向,同时integrin β1可能在MSCs分化中具有一定的作用.     

小鼠CD45-/CD31+肺侧缘细胞诱导分化为血管平滑肌细胞的体外培养

目的探讨在体外诱导分化CD45-/CD31+肺侧缘细胞的特性。方法取小鼠肺组织,流式细胞术分选小鼠CD45-/CD31+肺侧缘细胞;免疫荧光检测其侧缘细胞表型标记物ATP结合盒转运蛋白G2(ABCG2)和干细胞表面标记物干细胞抗原1(stem cell antigen 1,Sca1)的表达,逆转录PCR检测其ABCG2、平滑肌细胞标志物平滑肌肌动蛋白(smooth muscle actin, SMA)及血管平滑肌细胞标志物α-血管平滑肌原肌球蛋白（α-SMT）表达。分选的CD45-/CD31+肺侧缘细胞体外培养14 d后,细胞克隆形成实验和流式细胞术对其进行鉴定。分选的CD45-/CD31+肺侧缘细胞体外诱导14 d后,免疫荧光检测细胞α-SMT的表达,逆转录-PCR检测分化诱导前后细胞中的ABCG2、SMA及α-SMT基因表达。结果成功分选出目的细胞群CD45-/CD31+肺侧缘细胞,其表达ABCG2 和Sca1蛋白,ABCG2和SMA基因,不表达α-SMT基因。细胞体外培养14 d后,出现的细胞克隆鉴定为CD45-/CD31+肺侧缘细胞。CD45-/CD31+肺侧缘细胞分化诱导前表达ABCG2,少量表达SMA,不表达α-SMT,分化诱导14 d后表达α-SMT基因和蛋白、SMA基因,不表达ABCG2基因。结论CD45-/CD31+肺侧缘细胞是血管平滑肌细胞的祖细胞,具有干细胞分化特性。在体外培养可分化为血管平滑肌细胞。     

人肌源干细胞体外成骨作用的实验研究

目的探讨人肌源性干细胞(MDSCs)的分离、培养、鉴定及体外成骨作用,为临床应用提供实验依据。方法采用消化法分离MDSCs,应用差速贴壁法纯化干细胞,免疫细胞化学染色对细胞鉴定,MDSCs在骨形态发生蛋白-2(BMP-2)诱导分化后,检测其碱性磷酸酶、骨钙素。结果成功获得高纯度的MDSCs,免疫组织化学方法能够有效鉴定MDSCs,BMP-2诱导MDSCs后能够合成碱性磷酸酶、骨钙素。结论可通过体外原代培养获得高纯度MDSCs,其具有干细胞特征,并能够转化为骨系细胞,发挥成骨作用,为组织工程的临床应用提供种子细胞。     

细胞间接触诱导骨髓间充质干细胞向平滑肌细胞分化的实验研究

目的通过两种细胞的共培养探讨细胞间接触对间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)分化的影响。方法分别采用密度梯度离心法和胶原酶消化法分离培养了骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)和膀胱平滑肌细胞(bladder smooth muscle cells,BSMCs)。并对其进行了鉴定。在此基础上以单独培养的BMSCs和BSMCs分别作为阴性和阳性对照组,将获得的BMSCs和BSMCs在体外通过接触与非接触共培养作为实验组,对诱导后的BMSCs是否向平滑肌(smooth muscle cells,SMCs)分化通过免疫荧光和Western blot进行鉴定。结果对BMSCs进行流式细胞术检测结果显示CD90、CD44表达阳性率分别为99.78%,60.27%,CD45表达阴性,阳性率为0.21%。在BMSCs与BMSCs共同培养的实验中,Western blot结果显示:BMSCs本身表达少量calponin蛋白,接触组calponin的表达随培养时间的延长逐渐增多,非接触组无明显变化;免疫荧光显示:接触组在共培养第8天...     

TGF-β1介导人乳牙牙髓干细胞分化为血管平滑肌细胞的研究

目的 血管化的主要方案是先生成血管组成细胞(血管内皮细胞和血管周细胞),然后将这些细胞构建成血管结构.由于受体自身内皮细胞和血管平滑肌细胞的稀缺性和异质性,限制了其在血管组织工程学中的广泛运用.因此,本研究对于人乳牙牙髓干细胞(SHED)是否能够诱导分化成为功能性血管平滑肌细胞(vSMCs)进行了相关方面的研究.方法 利用转化生长因子(TGF)-β1作为刺激因子,诱导SHED分化为vSMCs.完成诱导后,通过RT-PCR、流式细胞术分析、Western blot和免疫荧光技术检测基因和特异性蛋白表达情况.此外,借助Matrigel血管生成功能实验来验证SHED来源的vSMCs是否能行使平滑肌细胞的功能.结果 通过分析平滑肌细胞特定标志物(如a-SMA、SM22a、 Calponin和SM-MHC)的表达,证实了 TGF-β1可以诱导 SHED分化为vSMCs,且流式细胞术证实分化的效率处于较高的水平,其标志物表达比例高达α-SMA 86. 1％,SM22α 93. 9％, Calponin 56. 8％,SM-MHC 88. 2％.体外 Matrigel 血管生成功能实验表明,由SHED诱导分化的vSMCs在稳定由人脐静脉血管内皮细胞所形成的血管结构中发挥着与原代 vSMCs相似的作用.结论 在血管组织工程中,SHED可以成功地诱导为vSMCs,能够成为血管组织工程中一种有前景的种子细胞.     

体外诱导骨髓基质干细胞向内皮细胞分化的实验研究

目的：探讨成体骨髓基质干细胞体外定向诱导分化为内皮细胞的可行性，为心血管组织工程提供新的种子细胞来源。方法：骨髓穿刺抽取绵羊骨髓液，密度梯度离心法获取骨髓单个核细胞，通过贴壁培养纯化骨髓基质干细胞。以含EGF、bFGF、IGF和肝素的M199培养液培养原代细胞，并以VEGF诱导骨髓基质干细胞向内皮细胞分化。通过CD34、CD31流式细胞仪分析，免疫组化CD34、CD31、Ⅷ因子相关抗原染色鉴定内皮细胞，UEA结合实验及NO含量测定评价内皮细胞功能。结果：骨髓基质干细胞表达α-SMA，不表达CD34和CD31。体外定向诱导2周后分化为内皮细胞。呈梭形，表达CD34和CD31及Ⅷ因子相关抗原，UEA结合试验阳性，并具有分泌NO的功能。结论：体外培养条件下骨髓基质干细胞能够分化为内皮细胞，并具有成熟内皮细胞的生物学特性和功能。     

大鼠子宫动脉和冠状动脉平滑肌细胞表现型的差异

目的:探讨大鼠体内雌激素对子宫动脉和冠状动脉的作用与两者的平滑肌细胞(SMC)表现型的关系.方法:HE染色观察子宫动脉和冠状动脉的的组织形态学结构.间接免疫荧光染色比较子宫动脉和冠状动脉SMC中平滑肌特异性肌动蛋白α-SM actin和非肌细胞型肌动蛋白β-NM actin平均荧光强度.Western blot检测子宫动脉和冠状动脉SMC的α-SM-actin和β-NM-actin含量,并检测β-雌二醇刺激下两者β-NM actin含量变化情况.结果:冠状动脉SMC以收缩型SMC为主,高表达α-SM actin;子宫动脉SMC以合成型SMC为主,高表达β-NMactin.在生理浓度β-雌二醇刺激下子宫动脉SMC的β-NM actin含量显著上升.结论:冠状动脉和子宫动脉的SMC表现型存在明显差异,前者显示收缩型SMC特点,后者接近合成型SMC.雌激素能够刺激合成型SMC的增殖.     

Deltex-1对骨髓间充质干细胞增殖及其向平滑肌细胞分化的影响

目的 探讨Deltex-1对骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,bMSCs)增殖及其向平滑肌细胞(smooth muscle cells,SMCs)分化的影响.方法 分离培养大鼠骨髓bMSCs,采用流式细胞仪检测鉴定.通过Deltex-1过表达腺病毒载体pAd/Deltex-1感染bMSCs后,采用CCK-8(cell count kit-8)法检测Deltex-1过表达对bMSCs增殖的影响;将未感染、经Deltex-1病毒感染及经空病毒感染的bMSCs与SMCs共培养,采用免疫荧光细胞化学、RT-PCR及Western blot分别检测其bMSCs中SMCs标志物平滑肌肌球蛋白重链(smooth muscle myosin heavy chain,SM-MHC)及Notch信号通路相关因子Notch-1的表达,单纯培养的bMSCs、SMCs的相同检测作正常对照.结果 成功分离、培养大鼠bMSCs.CCK-8检测证实:与对照比较,经Deltex-1病毒感染的bMSCs生长减慢,48 h开始显得更为明显(P＜0.05,P＜0.01);免疫荧光细胞化学、RT-PCR及Western blot检测显示:与对照比较,经Deltex-1病毒感染的bMSCs与SMCs共培养后显著表达SMCs的标志物SM-MHC,较弱表达Notch信号通路相关因子Notch-1 (P ＜0.01).结论 Deltex-1过表达可抑制bMSCs的增殖,并促进其向SMCs分化.     

Skeletal muscle-derived stem cells exhibit cardiocyte competences

Adult stem cells from skeletal muscle cells were induced to differentiate into cardiocytes to see if stem cells from another different but histologically-comparable tissues can differentiate to the target cells. Skeletal muscles-derived stem cells （MDSCs） were isolated from adult skeleton muscle tissues by differential adhesion, and immunocytochemically identified by using Sca-1. In order to induce the proliferation but not differentiation of MDSCs, the cells were cultured in Dulbecco’s modified Eagle’s medium/F12 （DMEM/F12） supplemented with 1：50 B27, 20 ng/mL basic fibroblast growth factor （bFGF）, 20 ng/mL epidermal growth factor （EGF） in a suspension for 6 days. Then these stem cells were treated with 5 μmol/L 5-azacytidine for 24 h in an adherence culture. The characteristics of induced cells were examined by immunocytochemistry, quantitative real time RT-PCR and morphological observation of cell phenotype. Our results showed that the appearance of some cells gradually changed from spindle-shape into polygonal or short-column-shape. Some of these post-treated cells could contract spontaneously and rhythmically. The expression of GATA-4 and cTnT was increased 1 and 2 week（s） after the treatment. And about 16.6% of post-treated cells were cTnT-positive. Therefore, we are led to conclude that skeletal muscle-derived stem cells could differentiate into cardiocyte-like cells, which exhibited some characteristics of cardiocytes.     

体外诱导羊膜上皮细胞转分化为雌性生殖细胞的初步实验研究

目的 建立体外分离、培养人羊膜上皮细胞(hAECs)的方法,研究其向雌性生殖细胞转分化的潜能。 方法 体外分离、培养并鉴定hAECs后,采用添加5%人卵泡液的培养基作为诱导剂,倒置显微镜下观察细胞形态的改变,化学发光免疫技术检测培养基中雌二醇(E₂)含量的变化,应用实时荧光定量PCR (RT-PCR)、Western blot等方法检测雌性生殖细胞相关基因及蛋白表达水平的变化。 结果 体外培养hAECs呈多角形,具有上皮细胞特有的铺路石样外观,并表达其特异性细胞角蛋白19(CK19),同时能表达胚胎干细胞(ESC)特异的转录因子POU5f1转录因子4(Oct-4)。采用添加5%人卵泡液的培养基诱导14 d后,对照组大部分细胞仍保持上皮细胞的多角形态,而诱导组细胞融合呈集落样生长。E₂含量检测结果显示,对照组无E₂生成,而诱导组E₂水平从第8 d开始增加,至第10 d达到高峰,然后下降。RT-PCR、Western blot结果表明,诱导组生殖细胞特异性基因生长分化因子9(GDF9)、无精症缺失基因(DAZL)的mRNA表达水平明显升高(P<0.05),而联会复合体蛋白3(SCP3)的mRNA表达水平无明显升高(P>0.05),DAZL的蛋白表达水平亦明显增加(P<0.05)。 结论 人卵泡液可在体外诱导hAECs向雌性生殖细胞方向转分化。     

成年大鼠骨骼肌肌源性干细胞向神经细胞的分化

目的 研究成体骨骼肌肌源性干细胞(MDSCs)向神经细胞分化的潜能.方法 从成年 SD 大鼠骨骼肌组织中培养出肌源性干细胞,采用 bFGF、EGF 诱导出神经球样细胞团,并检测 nestin 表达.再在贴壁培养条件下,用 RA、BDGF 诱导分化,并检测 NSE、GFAP 的表达.结果 MDSCs 能被诱导出神经球样细胞团,并表达 nestin.这些细胞进一步诱导,部分细胞表现出神经元样或胶质细胞样形态,并表达 NSE 或 GFAP.结论 MDSCs 能向神经细胞样细胞分化,有望用于神经系统疾病的治疗.     

Induced differentiation of adipose-derived stromal cells into myoblasts

This study aimed to induce the differentiation of isolated and purified adipose-derived stromal cells(ADSCs) into myoblasts,which may provide a new strategy for tissue engineering in patients with stress urinary incontinence(SUI).ADSCs,isolated and cultured ex vivo,were identified by flow cytometry and induced to differentiate into myoblasts in the presence of an induction solution consisting of DMEM supplemented with 5-azacytidine(5-aza),5% FBS,and 5% horse serum.Cellular morphology was observed under an i...     

BDNF基因转染促进骨髓间充质干细胞向神经元样细胞分化

目的: 将脑源性神经营养因子(brain derived neurotrophic factor, BDNF)基因转入骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells, MSC),使其作为种子细胞和基因治疗的载体将BDNF基因导入脊髓损伤组织,为探索一种更为有效的脊髓损伤治疗方法提供实验基础。方法: 分离、培养、鉴定大鼠骨髓间充质干细胞;实验组应用已构建的pEGFP-N1-BDNF进行基因转染,空质粒组用pEGFP-N1空质粒进行转染,阴性对照组只加入培养基,并进行Western 印迹分析;将转染BDNF的实验组、转染空质粒组和未转染的阴性对照组细胞在体外向神经元样细胞诱导分化,比较3组细胞诱导后神经元样细胞分化率,并进行统计学分析。结果: 流式细胞检测培养细胞CD90(+),CD44(+), CD34(-)、CD45(-);经Western印迹检测证实实验组MSC表达BDNF-EGFP;实验组细胞向神经元样细胞分化率高于空质粒组和未转染的阴性对照组,差异具有统计学意义(P<0.05)。结论: BDNF基因转染MSC后,可以促进其向神经元样细胞分化,BDNF在MSC向神经元样细胞分化过程中具有重要作用。     

E1A激活基因阻遏子在不同表型血管平滑肌细胞中的表达

目的 探讨血管平滑肌细胞表型转换、分化过程中E1A激活基因阻遏子(cellular repressor of E1A-stimulated genes,CREG)的表达变化及其相关机制。方法 将PCR扩增的CREG片段插入pGEX-4T-1原核表达载体,纯化的CREG融合蛋白免疫家兔以制备多克隆抗体。以人胸廓内动脉平滑肌细胞(human internal thoracic artery smooth muscle cells,HITASY)为模型,[^3H]标记脱氧胸苷掺入法测定去血清培养HITASY细胞DNA合成变化。以Western印迹观察HITASY细胞在去血清培养过程中SM α-肌动蛋白、肌钙结合蛋白(calponin)的表达,RT-PCR和Western印迹分析去血清培养诱导CREG mRNA和蛋白表达变化;免疫组化法观察CREG在细胞内的表达及定位。结果 构建载体并成功得到抗CREG多克隆抗体。去血清培养可使HITASY细胞DNA合成明显降低。随去血清培养时间延长,除SM α-肌动蛋白和肌钙结合蛋白表达逐渐上调之外,CREG mRNA转录活性和蛋白翻译合成亦上调。免疫组化显示去血清培养后,CREG蛋白在细胞内表达并主要位于细胞核周。结论 去血清能促使HITASY细胞由合成表型向收缩表型转换,同时伴CREG mRNA和蛋白表达上调。