脂肪干细胞原代培养及诱导成肌细胞的实验研究

目的 探讨大鼠脂肪干细胞(ADSC)的培养及诱导分化为成肌细胞的方法 .方法 取SD大鼠脂肪组织,酶消化法分离、培养ADSC,免疫荧光和流式细胞仪检测相关表面抗原CD90、CD105和CD34的表达.取培养至第2代处于对数生长期细胞,分别用含5-氮杂胞苷(5-aza)的诱导培养液(诱导组)和基础培养液(对照组)进行培养.诱导时间为7、14、21、28和35 d,倒置相差显微镜观察细胞的生长情况和形态变化,免疫荧光和流式细胞仪检测成肌细胞特异性抗原desmin和myosin的表达.结果 成功从大鼠脂肪组织分离、培养出ADSC,相关表面抗原表达检测证实其干细胞特性.诱导组细胞诱导28 d后呈现成肌细胞特有的"漩涡"样生长形态,单个细胞表现出多核化;免疫荧光和流式细胞仪检测显示,desmin和myosin的表达率在诱导28 d时达最高,分别为52.57%和50.04%,而诱导前和对照组细胞均呈阴性表达.结论 成功从大鼠脂肪组织分离、培养ADSC,含5-aza的诱导培养液可将其诱导分化为成肌细胞,诱导 28 d成肌细胞特异性抗原表达率最高.     

体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞分化为心肌样细胞

[目的] 探讨体外培养定向诱导大鼠骨髓间充质干细胞 ( MSCs )向心肌样细胞分化的潜能.[方法] 取大鼠下肢骨骨髓,分离培养 MSCs,用 5-氮胞苷 ( 5-aza )定向诱导 24 h,相差显微镜下观察其形态变化,免疫组化法检测肌钙蛋白 ( cTnT )和心肌细胞结蛋白 ( desmin )表达,并通过 RT-PCR对肌球蛋白重链 ( MHC )在细胞中的表达进行鉴定.[结果] MSCs经 5-aza诱导后,部分细胞呈梭形,并可见肌管样结构.免疫组化检测示诱导后 MSCs的 cTnT阳性细胞数为 15%, Desmin表达强阳性, RT-PCR示诱导后 MSCs有 MHC表达.[结论] MSCs在体外能在一定条件下被诱导分化为心肌样细胞,是心肌缺血干细胞移植的较理想的细胞来源.     

大鼠脂肪干细胞冷冻复苏后的生物学特性及成骨细胞分化潜能的研究

目的 研究冻存复苏后大鼠脂肪干细胞（ADSCs）的生物学特性及其体外诱导成骨细胞分化的潜能。方法 冷冻保存6 个月的大鼠ADSCs 复苏后传代培养,显微镜下观察细胞形态;CCK8 检测细胞增殖,流式细胞仪检测CD44,CD105。第3 代细胞诱导成骨培养2 ～ 3 周后碱性磷酸酶（ALP）和茜素红染色,观察成骨情况。结果 复苏后ADSCs 形态类似成纤维细胞,增殖迅速。成骨诱导培养后表现出成骨细胞特性,ALP 染色活性增加,茜素红染色出现矿化结节。结论 冷冻保存复苏后的ADSCs 细胞生物性能稳定,定向诱导后可分化为 成骨细胞,可作为骨组织工程的种子细胞。     

微小RNA可在人骨髓间充质干细胞分化来源的心肌样细胞中表达

目的研究人骨髓间充质干细胞（hMSCs）分化来源的心肌样细胞中代表性微小RNA（miRNAs）的表达。方法利用FITC-偶联的CD29、CD34和CDllb抗体在流式细胞仪上检测分离的hMSCs的抗原表型。分别用5-氮胞苷（5-aza）和乳鼠心肌非接触共培养法诱导传至3代的hMSCs分化为心肌样细胞。用免疫化学法检测hMSCs分化来源的心肌样细胞中心肌特异的α-肌节辅肌动蛋白和心肌肌钙蛋白（cTnI）的表达：利用逆转录PCR和DNA测序鉴定5个代表性的心脏特异的初级微小RNA（pri-miRNAs）的表达。结果hMSC标志分子CD29表达率为98．87％．而造血细胞标志分子CD34和CDllb的表达率只是5％和0．4％。免疫化学分析显示．分别经5-aza和乳鼠心肌非接触共培养诱导的hMSC均可表达α-肌节辅肌动蛋白和cTnI，而在未分化的hMSCs中无表达。miRNA-143，-181可在5-aza诱导的hMSCs中表达，miRNA．143，-181，-206，-208可在乳鼠心肌非接触共培养的hMSCs中表达．而两种诱导方法均未能诱导miRNA-1-2在hMSCs中表达。结论利用5-aza和乳鼠心肌非接触共培养法诱导hMSCs分化的心肌样细胞中可以表达不同的心脏特异的pri-miRNAs。     

脂肪干细胞诱导成肌细胞治疗尿失禁的实验研究

目的 探索脂肪干细胞(ADSCs)诱导技术在压力性尿失禁治疗中的运用.方法 采用气囊扩张阴道的方法建立压力性尿失禁动物模型,并通过尿动力学和组织学方法进行检测.采集大鼠自体的ADSCs,运用5-Aza诱导技术体外诱导成肌细胞,并通过Desmin、Myosin免疫荧光标记加以证实,回植注射于尿失禁大鼠模型膀胱颈部的后尿道肌层内.术后1、3个月分别采用尿动力学和组织学方法检测回植效果,另取未诱导的ADSCs回植作为对照组.结果 回植后1、3个月,实验组最大膀胱容量、漏尿点平均压和最大膀胱平均压均显著低于对照组(P值均<0.05).与造模后大鼠后尿道相比,实验组回植后1、3个月大鼠后尿道黏膜下肌层增厚,出现较多的粗大纵形肌束,黏膜下较多肌细胞存在;对照组回植后1、3个月大鼠后尿道黏膜下肌层稍有增厚,但不如实验组黏膜下肌层丰满.结论 ADSCs具备向成肌细胞等转化的能力,运用其多向分化能力,诱导培养成肌细胞,治疗压力性尿失禁,具有创伤小、恢复快的特点.     

间介中胚层样细胞在肾脏再生中的应用

目的 体外诱导脂肪干细胞分化为间介中胚层样细胞,对肾脏脱细胞支架进行再细胞化,经共培养构建有部分肾脏结构的组织工程肾脏。方法 手术获取Wistar大鼠腹股沟脂肪垫,从中分离、培养原代脂肪干细胞后对其进行干细胞特性鉴定。经过在不同阶段添加糖原合成酶激酶3抑制剂(CHIR99021)和成纤维生长因子9(FGF9),诱导脂肪干细胞分化为间介中胚层样细胞,并于诱导7 d后进行间介中胚层相关蛋白鉴定。将诱导成功的间介中胚层样细胞结合制备好的肾脏脱细胞支架进行共培养,10 d后获取再细胞化的组织工程肾脏,并对其进行肾脏分化的鉴定。结果 获取的脂肪干细胞具有成骨成脂及成软骨分化的能力,能表达脂肪干细胞表面标志物。体外诱导7 d后得到的间介中胚层样细胞经过免疫荧光鉴定可以观察到锌指蛋白转录因子和配对盒基因-2的阳性表达,Western blot验证可得到同样的阳性结果。结合肾脏脱细胞支架后培养10 d,通过免疫荧光鉴定可以观察到Wilms肿瘤基因1、GATA连接蛋白-3和E-钙黏素的阳性表达。结论 脂肪干细胞可被诱导分化为间介中胚层样细胞,诱导后的间介中胚层样细胞结合肾脏脱细胞支架可以观察到肾系分化的现象。     

糖尿病患者脂肪干细胞（ADSCs）向内皮细胞分化能力的研究

目的 研究糖尿病患者脂肪干细胞（ADSCs）诱导分化为内皮细胞的能力,以指导糖尿病患者的自身ADSCs移植治疗.方法 取健康患者和糖尿病患者脂肪组织,进行ADSCs的分离、培养和传代,分别取P3代ADSCs,使用内皮细胞诱导培养基于24孔板内进行两组细胞向内皮细胞的诱导分化,对比观察诱导过程中两组细胞的形态变化,并取诱导6、9、12天的两组细胞进行CD31的免疫细胞化学染色,观察诱导结果.结果 糖尿病患者脂肪组织采取和健康人ADSCs类似的分离培养流程可以获得呈典型形态的ADSCs;两组细胞向内皮细胞诱导后,6天细胞形态均逐渐发生改变,9天出现CD31免疫细胞化学染色阳性的细胞,12天可观察到典型内皮细胞形态,并且CD31染色阳性细胞增加.结论 糖尿病患者ADSCs在体外存在诱导剂情况下能够分化为内皮细胞.     

脂肪组织源性干细胞分步诱导分化为神经元样细胞

目的探讨脂肪组织源性干细胞(ADSCs)诱导分化为神经元样细胞的可行性。方法 ADSCs分离自雄性SD大鼠附睾脂肪垫,差速贴壁法纯化ADSCs,传至第3代培养细胞行流式细胞术行表型鉴定(CD106,CD11b,CD45,CD90,CD29,CD49d),并进行成脂诱导。取鉴定后的ADSCs用分步诱导法,即先用含10 ng/ml碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、20ng/ml表皮生长因子(EGF)、2%B27的DMEM/F12培养基I培养,诱导其向神经干细胞转分化,再用含10 ng/ml胶质细胞源性神经营养因子(GDNF),10 ng/ml脑源性神经营养因子(BDNF),1μmol/L维甲酸(RA)的培养基II诱导分化为神经元样细胞(NLCs),免疫细胞化学法鉴定细胞表面标记物巢蛋白(nestin),神经细胞特异性标志微管相关蛋白(MAP2),神经元核蛋白(NeuN)。结果分离纯化的ADSCs CD90、CD29表达强阳性;成脂诱导分化后细胞油红O染色阳性;ADSCs经培养基I培养7 d后聚集成球样细胞团悬浮于培养液中,表达nestin;继而用培养基II诱导分化4 h后细胞球逐渐贴壁,球周边少数细胞向外发出突起,形似神经元,MAP2、NeuN均呈阳性。结论特定条件下,ADSCs在体外可被逐步诱导分化为NLCs。     

Experimental study on MyoD gene induced differentiation of bone marrow mesen-chymal stem cells into myoblasts in vitro

Objective: To explore the possibility of the transfection of MyoD gene induced bone marrow mesenchymal stem cells ( MSCs) to differentiate into myoblasts in vitro. Methods: The eukaryotic expression plasmid vector pIRES2-EGFP-MyoD was transfected into MSCs with lipotransfection method, and the positive cells were selected by G418; The expression of MyoD was detected in the transfected MSCs with RT-PCR and the amplified, purified product was identified by sequencing; The reporter gene enhanced green fluorescence protein ( EFGP) was observed in the transfected cells under a fluorescent and a laser confocal microscopes; Immunohistochemical methods was used to examine the expressions of MyoD, myogenin, myosin, myoglobin and desmin in the differentiated cells. The ultrastructure changes of the cells before and after transfection were observed with electron microscopy. Results: The expression of MyoD was detected in the transfected MSCs with RT-PCR and the amplified, purified product was as same in sequence a     

人大网膜间充质干细胞的体外培养、鉴定及诱导化分方法

目的建立人大网膜脂肪问充质干细胞（adiposederivedIIlesechymalSteITIcells,ADSCs）的原代培养及诱导分化为脂肪细胞的方法．方法术中取人大网膜脂肪组织,采用胶原酶消化法原代培养,经流式细胞仪鉴定细胞CD44、CD34、CD90和CD45分子、MTTr法测定细胞生长曲线,取P3细胞以3-异丁基-1-甲基黄嘌呤、胰岛素、地塞米松及吲哚美辛诱导该细胞向脂肪细胞分化,油红O脂肪染色法进行脂肪细胞鉴定．结果培养卅的细胞形态均-呈梭形或漩涡状生长,经流式细胞仪鉴定为ADSCs,细胞生长曲线表明P3细胞增值旺盛,用分化培养基诱导后,细胞形态由梭形变为圆形,细胞体积增大,胞浆内聚集脂肪颗粒,油红0染色鉴定为成熟的脂肪细胞．结论该方法能培养出形态均一的人大网膜ADSCs,经诱导后可向成熟脂肪细胞分化．     

MyoD基因诱导大鼠心脏成纤维细胞分化为成肌细胞的实验研究

目的：探讨MyoD基因诱导大鼠心脏成纤维细胞分化为成肌细胞的可能性。方法：将MyoD基因重组腺病毒载体转染大鼠心脏成纤维细胞，观察转染后大鼠心脏成纤维细胞形态的变化；用RT-PCR和Western blot方法检测MyoD和肌细胞生成素的表达；免疫组化检测骨骼肌肌球蛋白和结蛋白的表达。结果：MyoD基因转染后的大鼠心脏成纤维细胞形态和排列方式发生明显变化；RT-PCR可检测出转染后细胞表达MyoD；Western blot结果表明转染后细胞表达MyoD和肌细胞生成素；免疫组化检测骨骼肌肌球蛋白和结蛋白表达均为阳性。结论：MyoD基因可诱导体外培养的大鼠心脏成纤维细胞分化为成肌细胞，为进一步研究MyoD对心肌损伤的修复作用奠定了基础。     

大鼠脂肪干细胞源性神经球分化为雪旺细胞样细胞

目的:体外诱导大鼠脂肪干细胞为雪旺细胞样细胞?方法:分离?培养和鉴定大鼠脂肪干细胞;表皮生长因子(epidermal growth factor, EGF)和碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)诱导大鼠脂肪干细胞为神经球,并对神经球进行鉴定;视黄酸?forskolin?血小板衍生生长因子(platelet-derived growth factor, PDGF)及heregulin等诱导神经球为雪旺细胞样细胞,并对雪旺细胞样细胞的形态和表面标志物进行鉴定?结果:大鼠脂肪干细胞为成纤维细胞样单层贴壁细胞,表达间质细胞标志物fibronectin,不表达神经干细胞标志物nestin,并能进行成脂和成骨分化?大鼠脂肪干细胞能被诱导为悬浮生长的神经球;神经球表达nestin,不表达fibronectin,并能进一步分化为雪旺细胞样细胞?雪旺细胞样细胞呈双极或三极,并表达雪旺细胞经典标志物胶质原纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein, GFAP)?S100和p75?结论:大鼠脂肪干细胞能在体外分化为雪旺细胞样细胞?这种雪旺细胞样细胞对于治疗神经系统疾病具有重要意义?     

人骨髓间充质干细胞体外定向诱导分化为心肌样细胞的超微结构

目的：培养人骨髓间充质干细胞（hMSCs）,体外向心肌细胞(CMs)定向诱导分化,进行超微结构观察,为hMSCs体外向CMs诱导分化提供理论依据。方法：体外分离培养扩增hMSCs并进行流式细胞仪分析鉴定;选用生长良好,纯度高的P5代hMSCs,用5-氮杂胞苷（5-Aza,10 μmol•L^-1）体外定向向CMs诱导分化,对其进行Desmin检测,在倒置显微镜及透射电镜下观察细胞形态学和超微结构。结果：流式细胞仪检测显示体外分离纯化培养扩增出细胞不表达CD34,高表达CD44,表明扩增细胞为hMSCs。hMSCs经5-Aza诱导分化后其形态发生改变,逐渐由长梭形变为多角形及星形,并表达Desmin。透射电镜下可见细胞大小不一致,细胞表面有许多微绒毛;细胞器丰富,胞质内可见丰富的线粒体、粗面内质网;部分细胞内可见大量糖原颗粒沉积,小部分细胞内可见髓样小体;胞浆内可见肌丝样结构,细胞间存在细胞连接。结论：体外分离培养扩增的hMSCs经5-Aza诱导,可分化成具有CMs超微结构特性的心肌样细胞。     

Neurogenic differentiation of murine adipose derived stem cells transfected with EGFP <Emphasis Type="Italic">in vitro</Emphasis>

Some studies indicate that adipose derived stem cells(ADSCs)can differentiate into adipogenic,chondrogenic,myogenic,and osteogenic cells in vitro.However,whether ADSCs can be induced to differentiate into neural cells in vitro has not been clearly demonstrated.In this study,the ADSCs isolated from the murine adipose tissue were cultured and transfected with the EGFP gene,and then the cells were induced for neural differentiation.The morphology of those ADSCs began to change within two days which developed i...     

MyoD基因诱导骨髓间充质干细胞分化为成肌细胞的实验研究

目的：探讨MyoD基因诱导骨髓间充质干细胞（MSCs)分化为成肌细胞的可能性。方法：利用脂质体转染方法，将真核表达的双顺反子质粒载体pIRES2-EGFP-MyoD转入MSCs中，G418筛选，用RT－PCR检测MyoD的表达，扩增产物纯化测序鉴定；荧光显微镜和激光共聚焦观察报告基因产物；免疫组化检测MyoD,myogenin,myosin,myoglobin desmin的表达，电镜观察转染前后细胞超微结构的变化。结果：RT－PCR可检测出转染后细胞表达MyoD,扩增产物纯化测序与Gene Bank比较完全一致，荧光显微镜和激光共聚焦观察均可见绿色荧光，免疫组化检测MyoD,myogenin,myosin,myoglobin,desimin表达均为阳性，转染后的MSCs观察表现为较为成熟细胞的形态学特点，且胞浆中有丝状物结构，结论：MyoD基因可成功诱导体外培养的骨髓MSCs分化为成肌细胞，为进一步研究MSCs和成肌细胞促进创伤修复提供了实验基础。     

大鼠脂肪源性干细胞来源的施万样细胞的增殖能力

目的：通过检测大鼠脂肪源性干细胞（ADSCs）来源的施万样细胞的增殖能力,探讨其在神经修复再生领域的应用及其意义。方法：取大鼠附睾旁脂肪组织进行ADSCs的分离与培养;将第4代ADSCs在β-巯基乙醇（β-ME）、反式维甲酸（ATRA）、血小板衍生因子AA（PDGF-AA）、碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）、腺苷酸环化酶激活剂（Forskolin）和Heregulin-β的联合作用下诱导分化为施万样细胞。采用免疫荧光法、Western blotting法和Real-time PCR法检测施万细胞（SCs）标记物S-100β、P75和胶质纤维酸性蛋白（GFAP）的表达水平;采用MTT法检测施万样细胞的增殖能力,观察其有丝分裂增殖现象。结果：诱导分化后的施万样细胞呈梭形、栅栏样排列。S-100β、P75和GFAP蛋白免疫荧光为Cy3/FITC标记,阳性产物位于细胞浆及其突起。Western blotting和Real-time PCR法检测,施万样细胞中S-100β、P75和GFAP蛋白和mRNA表达水平明显高于ADSCs（P<0.01）。MTT法检测,施万样细胞有较强的有丝分裂增殖能力。结论：ADSCs能够成功被诱导分化为施万样细胞,并表达SCs标记物;施万样细胞有较强的有丝分裂增殖能力,可作为神经组织工程理想的种子细胞。     

脂肪来源干细胞体外成骨和成脂及成神经的诱导分化研究

目的 探讨脂肪组织来源干细胞 (adipose stem cell,ADSC) 的表面表型及向成骨、成脂和成神经多向分化的生物学特性.方法 取SD大鼠的腹股沟、附睾垫和腹膜后脂肪,Ⅰ型胶原酶消化、分离培养ADSC,检测第3代ADSC的CD29、CD44和CD45的表达情况.将ADSC加入成骨诱导剂,通过茜素红S染色鉴定成骨细胞;成脂诱导剂利用油红O染色鉴定脂肪细胞;神经干培养基诱导,免疫荧光染色鉴定诱导的神经元.结果 ADSC表达CD29(99.07±0.12)%、CD44(95.82±0.68)%和CD45(0.11±0.12)%.其经成骨诱导4周,茜素红S染色显示聚集的细胞团中央形成红色钙化结节,碱性磷酸酶染色可见到细胞的胞质内有紫红色颗粒;成脂诱导1周,油红O染色可见细胞质内有橙红色脂滴;经过神经干培养基诱导6 d后,免疫荧光染色显示诱导的细胞Nestin、NF-200及GFAP阳性表达.结论 ADSC表达间质干细胞的表面表型,体外经诱导培养后可向成骨细胞、脂肪细胞和神经元多向分化,表明 ADSC具有干细胞的多向分化潜能.     

体外定向诱导人胎盘源间充质干细胞向内皮细胞分化

目的：探讨人胎盘源间充质干细胞（HPMSCS）在特定环境诱导下向内皮细胞分化的潜能，为其促进创伤愈合提供理论依据。方法：在患者知情同意的情况下，从足月分娩产妇娩出的胎盘组织中分离培养HPMSCS，通过倒置显微镜观察其生物学形态，利用流式细胞术检测其表面标志，并通过成骨诱导鉴定及成脂肪诱导鉴定确定其多向分化潜能。对鉴定后的HPMSCS在体外通过内皮细胞诱导液使之向内皮细胞分化，并对诱导后细胞进行细胞化学荧光染色，检测内皮细胞特异性Ⅷ因子（vWF）的表达；采用流式细胞术检测诱导后细胞表面标志，观察是否具有内皮细胞表型。结果：HPMSCS在培养基中持续培养后,形态由成纤维细胞样转变为类似内皮细胞的铺路石样结构。成熟内皮细胞特异的表面标志vWF为阳性表达。流式细胞术检测结果显示：CD31及CD34均有表达。结论：本诱导方案能够诱导HPMSCS出现内皮细胞表型,提示HPMSCS在体外特定条件下具有定向分化为内皮细胞的潜能。     

Conditioned Medium from Human Umbilical Vein Endothelial Cells Promotes Proliferation,Migration, Invasion and Angiogenesis of Adipose Derived Stem Cells

Preeclampsia (PE) is a pregnancy-specific hypertensive complication, closely related to endothelial dysfunction. Adipose derived stem cells (ADSCs) have the capacity to differentiate into endothelial cells for vascular repair. Therefore, we hypothesized that induced endothelial differentiation of ADSCs might hold great potential for the treatment of PE. In this study, the primary ADSCs and human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) were isolated by the collagenase digestion method. The supernatant of HUVECs was collected from the first generation of cells. Then, ADSCs were divided into two groups: ADSCs alone group and induced ADSCs (iADSCs) group. In iADSCs group, ADSCs were induced by HUVECs conditioned medium and ADSCs special culture medium at a ratio of 1:1 over a two-week period. In order to identify the endothelial characteristics of iADSCs, CD31 and CD34 were examined by flow cytometry. The proliferation, migration, invasion and angiogenesis assays were employed to compare the bioactivity of iADSCs and ADSCs. Furthermore, The levels of angiogenic related factors including vascular endothelial growth factor (VEGF) and placenta growth factor (P1GF) were detected by RT-PCR and Western blotting. Results showed conditioned medium from HUVECs promoted ADSCs proliferation, migration, invasion and angiogenesis. In addition, the levels of VEGF and P1GF were significantly enhanced in iADSCs group. This study uncovered the iADSCs application potential in the therapy and intervention of PE.     

子宫平滑肌肉瘤与特殊类型良性平滑肌瘤的鉴别

目的　探讨鉴别子宫平滑肌肉瘤 (LMS)和特殊类型良性平滑肌瘤的高度敏感和特异的免疫组化指标。方法　选取子宫平滑肌肿瘤 82例 ,其中子宫平滑肌肉瘤 17例 ,富于细胞型平滑肌瘤2 5例 ,奇异型平滑肌瘤 15例 ,普通型平滑肌瘤 2 5例 ,用免疫组化SP法检测各组织中结蛋白、α平滑肌特异性肌动蛋白 (SMA)、调宁蛋白、重型钙调蛋白结合蛋白 (h caldesmon)、雌及孕激素受体、增殖细胞核抗原 (PCNA)、肥大细胞和CD4 4v3的表达。结果　虽然子宫LMS中结蛋白、SMA、h caldesmon、CD4 4v3的阳性表达率均低于富于细胞型或奇异型平滑肌瘤 (P <0 .0 5 ) ,但这些指标鉴别良、恶性子宫平滑肌瘤的意义有限。子宫LMS中雌、孕激素受体的阳性表达率和肥大细胞数均较富于细胞型或奇异型平滑肌瘤明显减少 ,但PCNA指数较后两者明显高 (P <0 .0 1)。结论　PCNA的增高和雌、孕激素受体的表达减少可用来辅助鉴别良、恶性子宫平滑肌瘤 ,用肥大细胞计数来鉴别诊断子宫LMS的灵敏度和特异性均较高。