稳定高表达RORα基因的人胃癌MGC803细胞系的构建与鉴定

目的 构建维甲酸相关孤核受体α(RORα)基因的真核表达载体,并建立稳定高表达RORα的人胃癌MGC803细胞,为研究RORα的功能奠定基础。方法根据RORα基因的cDNA全序列,设计一对带有限制性酶切位点的引物。从人胃癌MGC803细胞中提取mRNA作为模板合成RORα cDNA第一链,并用上述引物扩增目的基因全序列,然后经双酶切插入到真核表达载体pcDNA3.1(+),转化大肠杆菌DH5α;用氨苄青霉素筛选pcDNA3.1(+)-RORα的阳性菌株,双酶切和测序进行鉴定。用经鉴定的重组质粒pcDNA3.1(+)-RORα转染MGC803细胞,G418筛选获得RORα/MGC803细胞株;Real-time PCR和Western blot检测该细胞株RORα的表达情况。结果经双酶切鉴定,构建的真核表达载体pcDNA3.1(+)-RORα包含有大约1 640 bp的插入片段,与预期大小一致;表达载体经测序鉴定,其插入片段碱基序列与RORα基因的cDNA序列完全一致。用构建的真核表达载体pcDNA3.1(+)-RORα转染MGC803细胞后,筛选到可稳定传代的RORα/MGC803细胞株。Real-time PCR与Western blot检测显示,RORα/MGC803细胞RORα mRNA和蛋白表达增高。结论成功构建真核表达载体pcDNA3.1(+)-RORα和建立高表达RORα基因的RORα/MGC803细胞。     

人EGFR基因真核表达质粒的构建及其在293细胞中的表达

目的:构建人表皮生长因子(EGFR)基因真核表达系统,拟为EGFR靶向腺病毒准备包装细胞.方法:用RT-PCR法,从人A431细胞中逆转录出EGFR基因cDNA,插入到pcDNA3.1(+)质粒中,拟构建EGFR真核表达载体,经测序证实.用脂质体将重组质粒转染293细胞,经G418筛选获得稳定表达EGFR重组克隆,用Western blot鉴定转染细胞中EGFR基因的表达.结果:经限制性内切酶酶切及测序结果分析证实EGFR基因已插入重组质粒.Western blot方法证实转基因293细胞中存在人EGFR基因的表达.结论:成功构建的人EGFR/pcDNA3.1(+)真核表达系统能够在293细胞稳定表达.     

人AQP5真核表达质粒的构建及其在胃癌细胞中的表达

目的构建人pcDNA3.1-AQP5/myc-His真核表达质粒,观察水通道蛋白5(AQP5)基因在胃癌AGS细胞中的稳定表达。方法采用基因重组技术将人AQP5cDNA插入真核表达载体pcDNA3.1/myc-His,构建人pcDNA3.1-AQP5/myc-His真核表达质粒。脂质体介导空载体pcDNA3.1/myc-His和表达质粒pcDNA3.1-AQP5/myc-His分别转染人胃癌AGS细胞株,G418筛选,挑取阳性克隆,扩大培养,逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和蛋白质印迹法(Western Blot)分别检测AQP5mRNA和蛋白表达。结果双酶切和基因测序结果均证实人pcDNA3.1-AQP5/myc-His真核表达质粒构建成功。AQP5转染组与空白对照组、空载体组比较,AQP5mRNA表达显著增加(P<0.05),AQP5蛋白表达显著上调(P<0.05)。结论成功构建人AQP5真核表达质粒并获得稳定表达AQP5基因的胃癌AGS细胞系,为进一步研究AQP5蛋白对胃癌恶性表型的影响奠定实验基础。     

人同源盒基因NKX3.1cDNA真核表达载体的构建及表达

目的：构建人同源盒基因NKX3.1 cDNA真核表达载体,研究其在前列腺癌细胞PC 3、LNCaP中的表达情况。方法：以人前列腺癌细胞LNCaP细胞中的总RNA为模板,RT PCR扩增NKX3.1基因全长编码片段,T/A克隆至pCR2.1载体中。经酶切、测序鉴定后,将NKX3.1cDNA重组到真核表达载体pcDNA3.1（+）中。将pcDNA3.1 NKX3.1表达载体瞬时转染前列腺癌细胞PC 3和LNCaP 细胞,RT PCR和Western blot法检测NKX3.1cDNA在转录水平和蛋白水平的表达。结果：人同源盒基因NKX3.1 cDNA真核表达载体pcDNA3.1 NKX3.1经酶切及测序鉴定正确。 pcDNA3.1 NKX3.1转染PC 3和LNCaP细胞后,经RT PCR和Western blot证明在mRNA和蛋白水平均能有效表达NKX3.1。结论：成功构建了真核表达载体pcDNA3.1 NKX3.1, 转染前列腺癌细胞PC 3和LNCaP后能有效表达。     

重组人血管抑素表达载体的构建及在人肝癌细胞系中的表达

目的：构建重组人血管抑素（hANG）的表达载体并检测其在肝癌细胞系中的稳定表达. 方法：利用RT-PCR从人胚胎肝组织中扩增出hANG cDNA片段,将其克隆到pCR-Blunt Ⅱ-TOPO载体和pcDNA3.1（＋）表达载体,利用克隆PCR、限制性内切酶消化以及序列测定对获得的hANG基因片段及重组载体进行验证. 将重组pcDNA3.1-hANG真核表达载体转染到人肝癌细胞SMMC-7721对其表达状况进行检测. 结果：所获得的hANG片段（1.1 kb）序列与报道的序列完全一致. 酶切鉴定的结果表明含血管抑素基因的重组pcDNA3.1-hANG表达载体构建成功. 转染重组pcDNA3.1-hANG的人肝癌细胞SMMC-7721表达了血管抑素. 另外,从生长曲线结果来看,转染pcDNA3.1-hANG真核表达载体和空载体的人肝癌细胞SSMC-7721和未转染的SSMC-7721细胞的生长速度无明显差别. 结论：成功地构建了重组人血管抑素真核表达载体并获得能稳定表达人血管抑素的SSMC-7721肝癌细胞,为开展下一步的实验奠定了基础.     

pcDNA3.1/Cx43真核表达质粒的构建及其在人神经胶质瘤U251细胞中的稳定过表达

目的建立稳定过表达pcDNA3.1/连接蛋白43(Cx43)重组质粒的人神经胶质瘤U251细胞系。方法设计人Cx43的引物,采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)从低表达Cx43的U251细胞中扩增出目的片段,双酶切后定向连入pcDNA3.1载体,构建pcDNA3.1/Cx43真核表达质粒,经酶切、PCR、测序检测构建的正确性。采用脂质体转染法将重组质粒转入U251细胞,G418筛选出稳定转染的细胞系,采用RT-PCR、Western blot分别检测稳定转染pcDNA3.1/Cx43重组质粒的U251细胞中Cx43基因、蛋白的表达水平。结果酶切、PCR及测序表明pcDNA3.1/Cx43重组质粒构建成功,筛选获得稳定过表达Cx43的U251细胞。结论构建了pcDNA3.1/Cx43真核表达质粒及稳定过表达Cx43的U251细胞株,为下一步以Cx43为靶标进行人神经胶质瘤的基因治疗研究奠定了实验基础。     

SV40T抗原真核表达载体的构建及表达

目的:构建SV40T抗原的特异性真核表达载体,并导入胃癌细胞株SGC7901进行表达鉴定.方法:扩增小鼠H /K ATPase β亚基启动子,与pMT18-T载体相连,并将其亚克隆至真核表达载体 pcDNA3.1(-),构建pcDNA3.1(-)/HK; 从含有SV40T基因的pLITAg质粒酶切回收SV40T基因,与pcDNA3.1(-)/HK相连,构建胃壁细胞特异性表达载体pcDNA3.1(-)/HKSV,同时构建非特异性表达载体pcDNA3.1(-)/SV,进行酶切及测序鉴定.用脂质体转染的方法将构建的载体导入胃癌细胞株SGC7901,PCR扩增基因组DNA,RT-PCR检测SV40T mRNA的表达.结果:限制性内切酶分析与测序结果显示,真核表达载体pcDNA3.1/HKSK构建成功;转染该载体的SGC7901细胞可检测到SV40T基因DNA的存在,且有SV40T mRNA的表达.结论:特异性表达SV40T基因的真核表达载体pcDNA3.1(-)/HKSV构建成功.     

健康人APOBEC3G基因的克隆及真核表达载体的构建与鉴定

目的克隆人载脂蛋白B mRNA编辑酶催化多肽样3G（apolipoprotein B mRNA editing enzyme,catalyticpolypeptide 3G,APOBEC3G）基因cDNA,构建APOBEC3G基因的真核表达载体,并在体外进行表达和鉴定。方法采用RT-PCR技术从健康人外周血单个核细胞中克隆APOBEC3G基因,将该基因插入pcDNA3.1真核表达载体,构建pcDNA3.1-A3G真核表达质粒,并利用脂质体将重组质粒pcDNA3.1-A3G转染HepG2和HL7702细胞,经免疫细胞化学、Western blot等方法检测APOBEC3G真核表达情况。结果双酶切鉴定和测序结果表明,APOBEC3G真核表达载体构建成功。免疫细胞化学和Western blot结果均显示,转染pcDNA3.1-A3G的HepG2和HL7702细胞APOBEC3G蛋白均高表达,转染空质粒pcDNA3.1和未转染的HepG2和HL7702细胞APOBEC3G蛋白低表达或不表达。结论成功构建了人载脂蛋白B mRNA编辑酶催化多肽样3G真核表达载体pcDNA3.1-A3G,为进一步研究APOBEC3G抗HBV作用奠定实验基础。     

人MT1-MMP真核表达载体的构建及其在HepG2细胞中的表达及意义

目的：克隆人膜型基质金属蛋白酶1（MT1-MMP）基因,构建真核表达载体,并检测其在人肝癌细胞HepG2中的表达。方法：采用逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）从人正常肝组织中扩增MT1-MMP全长cDNA,将之与pMD18-T载体连接,测序后将该片段亚克隆至真核表达载体pcDNA3.1中。将构建好的pcDNA3.1/MT1-MMP真核表达载体经酶切鉴定后,采用脂质体法转染入HepG2细胞,经G418筛选,得到阳性克隆细胞株。应用RT-PCR检测转染前后该细胞株MT1-MMP mRNA表达水平。结果：①RT-PCR获得长度约为704 bp的目的片段,与预期片段相符;②将pcDNA3.1/MT1-MMP真核表达载体经EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切鉴定,得到约5 400 bp和704 bp两个片段,测序结果证实所插入目的片段与GenBank中MT1-MMP cDNA序列匹配;③重组质粒转染株MT1-MMP mRNA表达水平（1.66±0.43）明显高于空质粒组（1.21±0.25）和对照组（1.19±0.18)(P<0.01）。结论：成功构建pcDNA3.1/MT1-MMP真核表达载体,并在人肝癌细胞株HepG2中稳定表达。     

pcDNA3.1(-)/UBE2C质粒在Chang Liver细胞中的表达和鉴定

[摘要] 目的 构建pcDNA3.1(-)/UBE2C真核表达质粒并建立人正常肝细胞Chang Liver的稳定表达株。方法 采用RT-PCR法从HepG2细胞中克隆得到UBE2C cDNA全长序列, 将之与pMD18-T载体连接。双酶切和测序鉴定后,再将UBE2C片段亚克隆到真核表达载体pcDNA3.1(-)。构建好的pcDNA3.1(-)/UBE2C真核表达质粒经双酶切和测序鉴定后,采用脂质体法将其转入Chang Liver细胞株中,经G418筛选,得到阳性克隆细胞株,再用Western blot法检测转染后UBE2C的蛋白表达水平。结果 pcDNA3.1(-)/UBE2C质粒经双酶切鉴定和DNA测序证实,目的基因UBE2C的序列完全正确,真核表达质粒成功构建。Western blot检测显示,转pcDNA3.1(-)/UBE2C组UBE2C的蛋白表达水平高于转pcDNA3.1(-)组,具有统计学意义（P﹥0.01）。结论 成功构建UBE2C基因的真核表达质粒并建立其稳定表达的Chang Liver细胞株,为下一步研究奠定基础。     

人bax真核表达载体的构建及其在人胃癌耐药细胞系SGC7901/VCR中的表达

目的：构建人ｂａｘ真核表达载体,经脂质体导入人胃癌耐药细胞ＳＧＣ７９０１／ＶＣＲ,并检测ｂａｘ基因在转导株的表达．方法：采用分子克隆技术将ｂａｘ基因插入真核表达载体ｐＢＫ－ＣＭＶ的多克隆位点之间,以脂质体介导法将目的基因导入受体细胞ＳＧＣ７９０１／ＶＣＲ,Ｇ４１８筛选克隆细胞,Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ检测ｂａｘ基因的表达．结果：成功地构建了重组质粒ｐＢＫ－ｂａｘ,将之转入细胞后,经Ｇ４１８筛选３０ｄ获得了稳定的细胞克隆,即ＳＧＣ７９０１／ＶＣＲ－ｂａｘｃｅｌｓ．Ｗｅｓｔｅｒｎ印迹证实了ｂａｘ基因转导株具有明显的Ｂａｘ蛋白表达．结论：ｂａｘ真核表达载体的构建,为胃癌耐药的临床治疗打下了基础．     

人Endostatin cDNA的克隆及其在HT1080细胞中的表达

目的 :构建能表达人Endostatin的真核表达质粒。方法 :设计引物从成人肝cDNA文库中通过PCR扩增到EndostatincDNA ,并在 5′端融合编码人胰岛素信号肽序列 ,经测序证实后连接到真核表达载体pcDNA3.1(- )中。将携带基因的真核表达载体质粒pcDNA3.1(- ) SEND转染HT10 80细胞后用G4 18筛选获得克隆 ,采用RT PCR和West ern blot检测Endostatin的表达。结果 :测序结果表明克隆的人EndostatincDNA完全正确 ,并且在其 5′端融合编码人胰岛素信号肽序列 ;RT PCR显示转染后的HT10 80细胞可以有效地转录EndostatinmRNA ;Western blot检测到转染后的HT10 80细胞上清有相应的蛋白质 ,大小为 2 0kD左右。结论 :含有人胰岛素信号肽序列的人EndostatincDNA重组质粒pcDNA3.1(- ) SEND转染HT10 80细胞后可以有效的表达目的蛋白并能分泌到细胞外 ,本研究为Endostatin的功能研究及应用于基因治疗提供基础     

日本血吸虫P14钙结合蛋白样蛋白基因真核表达载体的构建、表达和鉴定

目的 从日本血吸虫成虫cDNA中扩增出钙结合蛋白样蛋白SjP14编码基因,并亚克隆至真核表达载体pcDNA3.1(+),制备重组分子疫苗.方法 提取日本血吸虫成虫总RNA,逆转录cDNA,设计引物常规PCR法扩增出SjP14编码基因,通过线性T克隆载体pGEM-T连接,亚克隆至真核表达载体pcDNA3.1(+),经转染...     

人类TSLC1基因克隆及真核表达载体的构建

目的:克隆人类TSLC1基因并构建其真核表达载体pcDNA3.1( )/TSLC1.方法:从正常皮肤组织中提取总RNA,采用RT-PCR方法扩增TSLC1基因全长cDNA,克隆入pMD18-T载体并转化大肠杆菌JM109,经PCR、酶切鉴定均为阳性的克隆,进行核苷酸测序分析,再将TSLC1基因定向克隆入pcDNA3.1( )载体中构建表达载体.结果:RT-PCR扩增后的产物在约1413 bp处出现明显的特异性条带,TSLC1基因的cDNA片段被成功插入真核表达载体pcDNA3.1( )质粒的多克隆位点,经鉴定与GenBank收录的TSLC1 cDNA 序列一致.结论:TSLC1基因的cDNA片段被成功克隆,为以后的研究奠定了基础.     

新基因PCIA1真核表达载体的构建及HeLa细胞稳定转染株的建立与鉴定

目的构建人的新基因（PCIA1）的真核表达载体，并将其载体稳定转染到HeLa细胞株中。方法以人脐静脉内皮细胞（HUVEC）总RNA为模板，通过RT—PCR扩增PCIA1基因编码区eDNA，并将扩增的eDNA片段插入peDNA3．1（＋）真核表达质粒，构建重组质粒peDNA—PCIA1，重组子经酶切分析及测序鉴定后，用脂质体转染技术将该表达载体导人到HeLa细胞中，经G418筛选并建立稳定的转染细胞株，用RT-PCR和Westernblot检测PCIA1基因在HeLa细胞中的表达。结果经RT—PCR及Westernblot检测，证实真核表达重组质粒peDNA-PCIA1构建成功，PCIA1基因已经稳定转染到了HeLa细胞中并表达PCIA1蛋白。结论成功建立了人新基因PCIA1的稳定转染细胞株，为进一步研究PCIA1的功能奠定了基础。     

重组小鼠血管抑素基因转染抗血管生成治疗胆囊癌的实验研究

目的:研究重组小鼠血管抑素基因真核表达质粒转染的胆囊癌细胞表达具有抑制血管内皮细胞生长活性的血管抑素蛋白,以及对裸鼠种植性胆囊癌生长的抑制作用. 方法:应用脂质体lipofectamine2000将重组小鼠血管抑素基因的真核表达质粒pcDNA3.1( )-angiostatin转染胆囊癌细胞株GBC-SD,G418抗性筛选;以Western blot检测血管抑素的表达,以血管内皮细胞增殖分析检测其生物学活性,接种裸鼠并比较肿瘤体积和肿瘤微血管密度(MVD). 结果:得到表达血管抑素的胆囊癌细胞克隆,其培养上清能有效抑制bFGF刺激的血管内皮细胞增殖(P＜0.01);血管抑素组裸鼠肿瘤体积小于野生细胞对照组(P＜0.01),免疫组化检测显示血管抑素组裸鼠肿瘤微血管密度(MVD)低于野生细胞对照组(P＜0.05). 结论:血管抑素基因转染对裸鼠种植性胆囊癌的生长有抑制作用,这是血管抑素组肿瘤组织内新生血管形成受到抑制而减少所致.     

cdx2真核表达质粒的构建

目的：构建含有cdx2全长基因的真核表达质粒并在人胃上皮细胞系中表达。方法：从人结肠上皮组织中提取总RNA,RT-PCR获得全长人cdx2基因的cDNA,测序证实序列正确后亚克隆入pcDNA3.1来构建重组真核表达载体pcDNA3.1/cdx2。使用脂质体将该重组质粒转染入人胃上皮细胞GES-1中,RT-PCR证明该细胞中出现人cdx2基因的表达。结果：酶切鉴定和测序显示靶基因cdx2克隆到pcDNA3.1质粒中,RT-PCR证实转染的人胃上皮细胞中有人cdx2基因的表达。结论：成功构建含有人cdx2基因的真核表达质粒。并在人胃上皮细胞中表达。