带SV40LT抗原基因的逆转录病毒载体的构建

目的构建带有SV40LT抗原基因的逆转录病毒载体.方法采用体外重组技术构建带SV40LT抗原基因的逆转录病毒载体,酶切、测序进行鉴定,脂质体介导转染PA317包装细胞,经G418筛选出抗性克隆,通过NIH3T3细胞测定病毒滴度.结果酶切分析、测序证明重组逆转录病毒载体含有SV40LT抗原基因,且为正向插入.NIH3T3细胞测定病毒滴度为1.3×106CFU/ml.结论成功构建了含SV40LT抗原基因的逆转录病毒载体并包装出了高滴度的假病毒颗粒.     

SV40大T抗原在人脑肿瘤中的表达

目的　探讨 SV40早期区域基因编码产物大 T抗原(Tag)的表达及与抑癌蛋白 p5 3,p Rb的相互作用在人脑肿瘤发生发展中的意义 .方法　采用免疫共沉淀结合银染色及Western印迹法检测 6 5例人脑肿瘤及 8例正常人脑组织中Tag的表达 ,并对 18例和 15例 Tag阳性瘤组织分别检测Tag- p5 3和 Tag- p Rb复合物的形成 .结果　 SV40 Tag在人脑肿瘤中广泛表达 ,阳性率为 6 6 % (4 3/ 6 5 ) ,而 8例正常人脑组织均无 Tag表达 ,二者差异显著 (P<0 .0 5 ) ;分别检测 18例和 15例 Tag阳性瘤组织 ,均发现 Tag可与 p5 3,p Rb形成特异性复合物 .结论　 SV40 Tag的表达与人脑肿瘤的发生有一定关系 ;SV40 Tag与 p5 3,p Rb形成特异性复合物并导致其失活 ,可能是 SV40致人脑肿瘤发生的一个重要机制 .     

乙肝病毒抗原基因真核表达载体的构建及表达

目的:构建乙肝病毒(Hepatitis B virus,HBV)相关抗原基因真核表达载体,检测各抗原基因在体外真核细胞中的表达情况.方法:以含有1.3倍的HBV全基因组序列的质粒PcDNA3.1-HBV为模板,PCR扩增HBV的各抗原基因片段,通过连接至中间克隆载体Peasy-T1-Simple,酶切及测序鉴定正确后,...     

SV40大T抗原对人皮肤成纤维细胞生物学行为的影响

目的：研究SV40大T抗原（LT）基因对人正常皮肤成纤维细胞体外转化作用，以及转化后细胞生物学特性的改变。方法：采用脂质体介导的方法。利用含有LTcDNA的质粒psv3-neo转染人正常皮肤成纤维细胞。G418筛选后，挑选阳性克隆扩大培养，观察基因及蛋白在细胞内的表达。以及对细胞增殖等生物学特性的改变情况。结果：分离获得转化细胞克隆，原位杂交显示LTmRNA在转染细胞质中表达。免疫组化结果显示，细胞质中有SV40大T抗原表达。细胞计数，BrdU，流式细胞仪检测表明，经过一段时间的旺盛生长，在转染后第16代，细胞即进入危机期，以一种比衰老细胞更快的速度死亡。结论：LT可以促进正常皮肤成纤维细胞增殖，但这种能力是有限的，在转染后期甚至会促进细胞死亡，所以要使人的正常皮肤成纤维细胞永生化，单纯利用LT的转染是不够的，还需要结合其它的转化方式。     

不同品系SV40T转基因小鼠血浆胃泌素水平测定

目的：检测不同品系SV40T转基因小鼠血浆胃泌素水平。方法：取已建立的8个品系SV40T转基因小鼠和B6小鼠空腹血,应用ELISA法检测血浆胃泌素水平。结果：B6小鼠、2#、4#、16#、24#、51#、57#、61#和73#品系转基因小鼠血浆胃泌素水平（μg/L）分别为（2.814±0.209）、（1.135±0.114）、（0.853±0.701）、（2.371±0.335）、（1.371±0.190）、（0.685±0.374）、（2.274±0.251）、（2.471±0.251）和（0.986±0.173）,9组相比,差异有统计学意义（F=17.449,P〈0.001）;其中2#、4#、24#、51#及73#品系转基因小鼠血浆胃泌素水平较B6小鼠明显降低（P〈0.05）。结论：筛选出了5个稳定表达的SV40T转基因小鼠品系。     

mOX40-hIgG1Fc真核表达载体的构建

目的构建mOX40-hIgG1Fc的真核表达载体。方法从正常人外周血单个核细胞中提取总RNA，应用RT—PCR法扩增获得hIgG1Fc段基因，将其插入pcDNA3.1，构建pcDNA3．1-hIgG1Fc重组质粒。进而从本室保存的pIRES2-EGFP-mOX40重组质粒中PCR扩增mOX40胞外段，再利用pcDNA3．1-hIgG1Fc重组载体构建pcDNA3．1-mOX40-hIgG1Fc真核表达载体，并经PCR、限制性酶谱分析和测序分析进行证实。结果构建的pcDNA3．1-mOX40-hIgG1Fc真核表达载体，经PCR、限制性酶谱分析和测序分析，证实获得的hIgGl1Fc段及mOX40胞外段基因均与国际生物信息资源库GenBank登录的相应基因序列完全一致。结论成功构建PCD—NA3．1-mOX40-hIgG1Fc真核表达载体，为OX40分子的进一步研究奠定良好的基础。     

LETM1基因真核表达载体的构建

[目的]构建线粒体LETM1基因真核表达载体．[方法]从肾癌细胞株293T细胞中提取mRNA及合成cDNA,设计并合成线粒体LETM1基因引物,用PCR方法扩增LETM1基因,连接到真核表达载体pCMV-3Tag-6上,构建重组质粒pCMV-3Tag—LETM1,经酶切和测定序列进行鉴定．[结果]构建了重组质粒pCMV-3Tag—LETM1．[结论]成功地构建了线粒体LETM1真核表达载体．     

小鼠CD40Ig基因真核表达质粒的构建及鉴定

目的：构建含小鼠CD40Ig基因的真核表达载体，为诱导供体特异性移植物的免疫耐受的基因治疗作准备。方法：以小鼠脾脏总RNA为模板，以RT-PCR法克隆小鼠CD40胞外段cDNA及IgG2a Fc段cDNA；另以pEGFP-N1质粒为模板获得绿色荧光蛋白（GFP）基因。将所得基因片段插入真核表达载体pDC516中得到重组质粒pDC516-CD40-IgG-GFP，测序鉴定正确后，用脂质体2000将其转染人胚肾上皮细胞（HEK293细胞），荧光显微镜下观察融合蛋白的表达。结果：成功构建了小鼠CD40Ig基因真核表达质粒pDC516-CD40-IgG-GFP，并在HEK293细胞中实现表达。结论：小鼠CD40Ig基因真核表达质粒pDC516-CD40-IgG-GFP构建成功，为诱导供体特异性移植物免疫耐受的研究奠定了基础。     

纯合子胃壁细胞特异性表达SV40T抗原转基因小鼠品系的建立

目的：建立稳定遗传的纯合子SV40T胃壁细胞定位表达转基因小鼠品系。方法：通过定量PCR法比较已知杂合子小鼠和未知阳性小鼠中外源基因的起始模板量来确定小鼠的基因型,并通过测交的方法来验证试验结果。结果：用定量PCR法选育出15只纯合子小鼠,经测交验证它们与野生型小鼠交配所生的后代均为阳性,证明了定量PCR的结果是正确的。通过纯合子之间的全同胞交配建立了6个独立的纯合子品系。结论：定量PCR具有省时、省力及高通量等优点,能够很好地应用于筛选纯合子转基因动物。     

胃黏膜特异表达JC病毒T抗原质粒构建及表达鉴定

 目的利用鼠胃黏膜上皮细胞中高活性的角蛋白19(K19)启动子构建K19-JCVT抗原表达质粒并进行鉴定。方法利用PCR方法突变JC病毒T抗原中的NdeⅠ位点,并在两端插入BclⅠ位点,通过BamHⅠ位点将DNA片段与K19启动子连接,构建K19-JCVT抗原质粒。利用酶切和DNA测序确认其DNA序列。免疫组化筛选细胞角蛋白19阳性胃癌细胞,对细胞角蛋白19表达阳性的胃癌细胞系AGS进行K19-JCVT抗原质粒转染,用Western
      blot方法检测JCVT抗原的表达情况。结果K19-JCVT抗原表达质粒成功构建,AGS胃癌细胞系高表达细胞角蛋白19并用于K19-JCVT抗原表达质粒转染,转染K19-T抗原质粒的AGS细胞系有T抗原表达。结论同义突变和相似连接在质粒构建中起到关键作用,酶切位点的甲基化也是值得注意的问题。     

Kringle 5的真核植物细胞穿梭表达载体的构建

目的：构建含有目的基因kring5的真核植物细胞穿酸表达载体。方法：应用RT－PCR方法，从正常人肝脏组织中获得kringle5基因，测序后，再通过DNA重组技术，将kringle5基因片段克隆到真核植物细胞表达载体pBI121和pCAMBIA3301上。结果：得到的kringle5基因序列测定结果与文献相符，重组载体pB1k5和pC33k5经酶切鉴定正确，含有植物高效表达CaMV35S启动子。结论：重组载体pB1k5和pC33k5不仅可以在大肠杆菌中稳定复制，而且可以在植物细胞中表达。     

An experimental study on the expression of SV40 large tumor antigen in human brain tumors

In recent years, it has become a novel hot spotof oncology that the research on the relationship between simian virus 40 (SV40) and the etiology ofhuman brain tumors as well as other types of tumors.However, the presence of SV40 and the expression ofoncoprotein large tumor antigen (Tag) in human braintumors remain a controversial issue. It is known thathuman cells are only semipermissive for SV40 infection, even if SV40 is in human brain tumors indeed,whether SV40 is associated with human …     

日本血吸虫谷胱甘肽转移酶基因在真核表达载体中的亚克隆

目的 将日本血吸虫谷胱甘肽转移酶（ＧＳＴ）基因片段克隆到真核表达载体ＰＢＫＣＭＶＫ ,以便以进行酸疫苗的研究。方法 特定核苷酸引物的设计和合成,ＴＲＩＺＯＬ试剂以日本血吸虫成虫ＲＮＡ〈ＲＴ－ＰＣＲ法扩增ＧＳＴ基因编码序列,将扩增产物连接ＰＧＥＭ－Ｔ克降体,再亚克隆到真核表达载体ＰＢＫＣＭＶ中。结果 ＲＴ－ＰＣＲ法特异性扩增出ＳｊＧＳＴ编码基因片段。其大小约为６７０ｂｐ,经双酶切、ＰＣＲ鉴定表明所构     

NY-ESO-1抗原T细胞受体基因慢病毒载体的构建及鉴定

目的构建NY-ESO-1抗原T细胞受体基因（TCellReceptor,TCR）的慢病毒载体并获得重组慢病毒。方法设计特异性NY-ESO-1TCR的引物,用聚合酶链反应（PCR）对我们前期已克隆的NY-ESO-1TCRcDNA进行体外扩增,双酶切后定向插入到pCL20c-MSCV-GFP质粒,构建NY-ESO-1抗原特异性TCR基因的重组慢病毒载体pCL20c-MSCV-ESOTCR,并经酶切、PCR及测序鉴定。用pCL20c-MSCV-ESOTCR﹑pCL20c-HIV-gp、pCAG4-RTR2和CAG-VSV-G共转染T293包装细胞,获得上清,上清浓缩后感染Hela细胞,观察ESOTCR基因及蛋白水平的表达。结果经PCR及测序证实,成功构建重组慢病毒载体pCL20c-MSCV-ESOTCR,包装产毒后感染Hela细胞,RT-PCR法及荧光显微镜均能检测及观察到基因及蛋白水平的表达。结论成功构建了表达NY-ESO-1抗原T细胞受体基因（TCellReceptor,TCR）的重组慢病毒载体。     

SV_(40)LT抗原基因肝细胞——理想的肝细胞来源

目的制备并初步评估一种理想的肝细胞来源—SV40LT抗原基因永生化肝细胞。方法将SV40LT抗原基因在逆转录病毒介导下转入原代培养的大鼠肝细胞,获得能在体外增殖的肝细胞。通过绘制生长曲线了解转染肝细胞的体外生长特性,细胞冻存复苏试验评估转染肝细胞的冻存价值并与原代肝细胞和大鼠肝癌细胞CBRH7919比较。结果SV40LT抗原基因转入原代培养的大鼠肝细胞能在体外增殖。SV40LT抗原基因转染肝细胞比原代肝细胞生长速度快(P<0.05),与肿瘤细胞相比生长曲线差异无显著性(P>0.05)。复苏后冻存的SV40LT抗原转染的肝细胞的细胞活率为(74±4)%,原代肝细胞的细胞活率为(72±6)%。两者差异无显著性(P>0.05)。结论肝细胞经SV40LT抗原基因转染后获得永生化特性,冻存复苏后获得满意的细胞活率,是一种理想的肝细胞来源。     

携带SV40T/HSV-tk基因永生化正常成人肝细胞的构建

目的构建永生化正常成人肝细胞为生物型人工肝提供安全有效的人肝细胞源。方法转染包装细胞,获得逆转录病毒;将该病毒感染正常成人肝细胞HL-7702;更昔洛韦毒性实验检测转染后肝细胞内HSV-tk基因;RT-PCR法检测转染后细胞内SV40T的mRNA;Western Blot法和免疫荧光染色检测转染后细胞内SV40T基因的蛋白表达。结果更昔洛韦检测转染后的肝细胞存活良好,而转染前的肝细胞死亡。RT-PCR法显示转染后的肝细胞内存在SV40T mRNA;Western Blot法和免疫荧光染色法显示转染后肝细胞内存在SV40T蛋白。结论转染后的正常成人肝细胞中含有SV40T和HSV-tk基因,并表达相关蛋白。     

人前列腺特异性抗原基因重组表达载体pPICZαC-m PSA的构建和表达

目的在毕赤酵母细胞中表达PSA,为临床的检测和治疗提供材料.方法经RT-PCR获得PSA全长cDNA并测序.将编码成熟PSA 237氨基酸的cDNA序列插入毕赤酵母表达载体pPICZα-C,该载体含有AOX1启动子和α-factor信号肽序列,构建表达载体体pPICZαC-m PSA.甲醇诱导X33细胞表达rPSA,ELASA试剂盒筛选高表达rPSA的细胞株.结果获得了人PSA全长序列,构建了表达载体pPICZα-m PSA.获得了高表达rPSA的酵母X33细胞株,表达产量为1.2 mg/L.结论建立了重组人前列腺特异性抗原的毕赤酵母表达体系,规模化的生产有助于PSA的生物学特性的研究和临床检测和治疗的应用.