精子顶体小泡蛋白-1(ACRV1)在小鼠睾丸组织中的表达与定位

目的:研究精子顶体小泡蛋白-1(ACRV1)在小鼠睾丸组织发育过程中的表达特征。方法:将4 d、9 d、18 d、35 d、54 d和6月龄小鼠睾丸组织cDNA探针与Affymetrix全基因组芯片进行杂交,筛选出差异表达的ACRV1基因。采用RT-PCR方法检测ACRV1基因在小鼠不同日龄和不同组织中的表达情况,采用免疫组织化学方法检测ACRV1蛋白在小鼠睾丸组织中的定位。结果:对Affymetrix全基因组芯片杂交结果分析后,筛选得到1个差异表达杂交点,通过在NCBI网站与小鼠全基因组序列Blast分析可知该差异表达基因是ACRV1基因。RT-PCR结果表明ACRV1 mRNA呈小鼠睾丸特异性表达,在出生31 d小鼠睾丸开始高表达,在成年前达到高峰。ACRV1蛋白主要定位在睾丸圆形精子和长形精子细胞。结论:ACRV1基因存在发育的表达调控,为小鼠年龄依赖性表达基因,其表达与小鼠精子发生的过程有很强的一致性,且具有睾丸特异性表达的特征,因此推测该基因可能在精子发生中具有关键作用。     

睾丸特异性新基因T490真核荧光表达载体的构建及其表达

目的 构建含有增强型绿色荧光蛋白(EGFP)报告基因的睾丸特异性新基因T490超表达质粒pDT490-EGFP,检测其在Hela细胞中的表达情况.方法 采用RT-PCR的方法从成年Balb/c小鼠睾丸组织中扩增T490基冈,将该基凶连接克降到含有增强型绿色荧光蛋白(EGFP)报告基因的真核表达载体pEGFP-N1上,再将T490和EGFP融合基因酶切下来,克隆到pcDNA3.1(-)真核超表达载体上,以构建重组质粒pDT490EGFP.将该重组质粒通过阳性脂质体Lipofectamine 2000导入Hela细胞系中,在荧光显微镜F观察转染24h后融合基因的超表达情况,并用RT-PCR的方法进一步证实目的 基因mRNA的表达水平.结果 RT-PCR获取编码T490基因的全序列cDNA,大小为508bp;DNA测序和PCR方法证实T490和EGFP融合基因成功克隆到真核超表达载体L;在荧光显微镜下,转染24h后的Hela细胞具有很强的绿色荧光;RT.PCR显示转染后的Hela细胞T490基因mRNA的表达明显.结论 重组质粒pDT490-EGFP构建成功,并在细胞内明显表达,此质粒可应用于研究睾丸特异性新基因T490的功能,为T490的生物学研究奠定基础.     

精浆弹性硬蛋白酶、IL-6、IL-23在男性不育患者精浆中的表达及其临床意义

目的研究精浆弹性硬蛋白酶、白细胞介素(IL)-6以及IL-23在慢性生殖道炎症患者精液中的表达水平及其与精液参数的关系。方法收集男性不育患者精液标本60例,健康生育男性精液标本20例作对照组。每份标本按照世界卫生组织《人类精液检验与处理实验室手册》第五版标准进行分析处理,同时行白细胞CD45染色、精子染色质结构完整性实验以及采用酶联免疫吸附实验(ELISA)方法检测精浆弹性硬蛋白酶、IL-6和IL-23表达水平。结果精浆IL-6、IL-23与精子总数、存活率、活力具有显著负相关性,并且IL-6与精子DNA碎片化指数呈显著正相关性(r=0.645,P<0.01)。精浆IL-6、IL-23在两组之间差异具有统计学意义,且二者之间呈正相关(r=0.625,P<0.01)。精浆弹性硬蛋白酶表达水平与精液量、精子密度呈负相关性(P均<0.05)。结论精浆炎症因子弹性硬蛋白酶、IL-6和IL-23对诊断慢性生殖道炎症具有提示意义,并且精浆IL-6和IL-23可能对精液质量影响更大。     

睾丸基因表达特征和生物学功能的研究

近50年来,包括中国在内的全世界成年男性的精子数量和质量都在下降.据报道,世界卫生组织调查显示,不孕不育症的发生约为育龄夫妇的8%～12%~([1]),其中男性因素占50%~([2]).而生精障碍引起的少精子症或无精子症又是造成男性不育的常见原因.     

DNA芯片在男科学研究中的应用

本文简要回顾了芯片的发展历史,介绍了DNA芯片分析的基本过程及面临的主要挑战,并重点综述了DNA芯片在以睾丸、生精细胞、附睾和精液为研究材料的男科学研究中的最新进展,以期对采用DNA芯片技术进行男科学研究有一定的指导作用。     

精子发生相关基因VASA在正常和少精子症患者精子中的表达及意义

目的探讨生殖细胞高度特异性基因VASA和信号分子BMP-4在精子发生中的作用和相关机制。方法正常和少精子症患者精液通过Percoll梯度分离获得精子和未成熟生精细胞,采用RT-PCR、real-time PCR、Western Blot和免疫荧光方法分析基因转录产物表达。结果少精子症精子VASA基因转录产物是正常精子的1/5；两种样本精子中均检测到荧光信号,正常组信号强,与Western blot结果相一致；两种样本精子RT-PCR均未检测到BMP-4及其Ⅰ型受体Alk-3表达,但在分离的未成熟生精细胞中均表达。人正常睾丸组织可检测到BMP- 4及其Alk-3表达。结论少精子症患者精子发生过程中VASA基因及其产物发生变化；BMP-4及其受体Alk- 3并不直接上调VASA表达；睾丸组织包括精子所存在的部分转录产物,而精子转录产物并不完全等同于睾丸组织；睾丸组织内表达BMP-4和Alk-3的可能主要是精原和精母细胞。     

长链非编码RNA UCA1在膀胱癌中的研究进展

近年来,随着对长链非编码RNA(lncRNA)研究的不断深入,lncRNA在肿瘤发生发展中的作用受到越来越广泛的关注。其中,lncRNA尿路上皮癌相关抗原1(UCA1)在膀胱癌、胃癌、肝癌、卵巢癌等多种肿瘤组织中呈高表达,并参与了肿瘤的发生与发展。本文就UCA1与膀胱癌的关系作一综述。     

Pokemon基因干扰对泌乳素腺瘤细胞的影响及其分子机制

目的:探讨原癌基因pokemon干扰对泌乳素腺瘤细胞的影响及其分子机制,为可能的泌乳素腺瘤分子靶向治疗提供依据。方法:从泌乳素腺瘤患者手术切除的肿瘤组织中分离培养原代肿瘤细胞,利用siRNA技术构建pokemon稳定干扰泌乳素腺瘤细胞系(siRNA1、siRNA2和siRNA3),采用荧光定量PCR及Western blot验证pokemon的表达;同时运用CCK8检测pokemon基因干扰对泌乳素腺瘤细胞增殖的影响。采用Western blot检测在泌乳素腺瘤组织及siRNA稳定干扰细胞中pokemon对下游cyclin-A、p14ARF和p21蛋白表达的影响。结果:3株pokemon基因干扰泌乳素腺瘤细胞均构建成功。与空白质粒对照组比较,干扰组的细胞增殖能力均较对照组明显减弱(P均<0.05),且siRNA2干扰效率最高。与正常泌乳素腺组织比较,泌乳素腺瘤组织中pokemon蛋白表达明显增加(P=0.042),而其下游蛋白p14ARF、cyclin-A以及p21表达均显著降低(P均<0.05)。与空白质粒对照组比较,在siRNA2干扰组细胞中p14ARF、cyclin-A和p21蛋白表达水平均明显升高(P均<0.05)。结论:pokemon基因干扰可上调泌乳素腺瘤细胞中肿瘤相关抑制因子的表达,提示pokemon可能作为泌乳素腺瘤治疗的潜在靶位点。     

人共刺激分子B7-H3表达载体的构建及表达检测

目的：B7-H3作为B7家族的最新成员，其受体在活化的T细胞表面可被诱导表达，B7-H3对CD4＋和CD8＋细胞的生成均具有增加作用，并可选择性增加IFN-γ的生成。为将B7-H3基因转染入舌鳞癌细胞Tea8113中制备瘤苗。克隆人共刺激分子B7-H3基因，构建其真核表达载体，并检测B7-H3基因在Tea8113中的表达。方法：从淋巴细胞中提取RNA，用RT—PCR方法将B7-H3的编码序列cDNA扩增。然后将该基因的编码序列插入真核荧光蛋白载体pEGFP—C1中，构建成最终的表达载体pEGFP—C1-B7-H3。运用脂质体方法将pEGFP—C1-B7-H3转染Tea8113细胞．转染24h后．荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白的表达，RT—PCR检测B7-H3在该细胞中的表达。结果：从淋巴细胞中提取的RNA质量较好，经RT—PCR扩增出目的基因B7-H3，其全长大小为951bp。测序鉴定，该序列与GenBank中序列相同。转染pEGFP—C1-B7-H3载体的靶细胞Tea8113中，荧光显微镜下可见其表达绿色荧光蛋白，RT—PCR方法检测到目的基因B7-H3的-个215bp大小的eDNA扩增产物。结论：酶切及RT—PCR证实成功构建人B7-H3的真核表达载体pEGFP—C1-B7-H3，将该载体转染到Tea8113中，RT—PCR鉴定B7-H3基因在该细胞中表达。     

STAG2基因在肾癌的表达及功能研究

目的 研究骨髓基质抗原2(STAG2)基因在人肾癌组织和肾癌细胞中的表达水平并研究STAG2基因对肾癌细胞生物学表型的影响.方法 使用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测STAG2基因在5株肾癌细胞、1株正常肾细胞和68对肾癌及其对应的癌旁组织中的表达水平;使用 Western blot法分析STAG2蛋白在5株肾癌细胞、1株正常肾细胞的表达特点;使用慢病毒包装感染ACHN、786-0细胞并使用qRT-PCR检测感染效率;CCK8试剂盒检测STAG2过表达后对肾癌细胞增殖的影响;Transwell法检测STAG2过表达后对肾癌细胞侵袭的影响;流式细胞术检测STAG2过表达后对肾癌细胞凋亡的影响.结果 ①qRT-PCR结果显示,与正常肾细胞相比,STAG2基因在5株肾癌细胞的表达显著下降,差异有统计学意义(P＜ 0.01);②Western blot结果显示在5株肾癌细胞中STAG2蛋白表达明显低于正常肾细胞;③qRT-PCR检测肾癌及其癌旁组织的STAG2表达水平结果显示与其对应癌旁组织相比,72. 06％(49/68)肾癌组织中STAG2表达水平下降(P＜0. 01);肾癌组织中STAG2表达水平与肿瘤的临床病理分期相关(P=0.029),与患者年龄、性别、肿瘤组织学分级无明显相关性;④慢病毒感染 ACHN、786-O细胞后STAG2表达水平明显升高(P＜0. 01); ⑤体外实验中,过表达STAG2基因明显抑制肾癌细胞的增殖和迁移能力,促进肾癌细胞的早期凋亡(P＜0. 05,P＜ 0.01).结论 ①在肾癌细胞和肾癌组织中STAG2的表达水平均有明显的下降,提示STAG2可能参与肾癌的发生和发展的过程,STAG2低表达对肾癌的早期诊断可能提供一些帮助;②上调STAG2基因的表达明显抑制肾癌细胞的增殖和迁移能力、促进肾癌细胞的凋亡,提示STAG2可能成为治疗肾癌的一个潜在靶点.