2个遗传性凝血因子Ⅺ缺陷症家系的表型与基因型分析

  目的  对2个遗传性凝血因子Ⅺ（FⅪ）缺陷症家系进行表型诊断和基因突变分析,探讨其分子发病机制。  方法  对2014年11月及2018年1月潮州中心医院收治的2例遗传性凝血因子FⅪ缺陷症患者及家系进行分析。采用血浆凝血酶原时间（PT）、活化部分凝血活酶时间（APTT）、FⅪ活性（FⅪ∶C）和FⅪ抗原（FⅪ∶Ag）等凝血指标进行表型诊断;对2个先证者FⅪ基因所有的外显子及其侧翼序列进行扩增,PCR产物纯化后直接测序,检测其基因突变。针对先证者的突变位点,分别对其家系成员进行相应的基因突变检测。应用逆转录PCR (RT-PCR)检测先证者-1 FⅪ mRNA的水平,分析突变对FⅪ mRNA剪切造成的影响。  结果  先证者-1男性,7岁。PT为10.7 s,APTT为 97.4 s（参考值9～12.8 s和24～40 s）,FⅪ∶C为0.6%,FⅪ∶Ag<1%（参考值65%～150%和72.1%～122.3%）;先证者-2女性,30岁。PT为11.7 s,APTT为71.3 s,FⅪ∶C为0.7%,FⅪ∶Ag<1%。2例先证者因子Ⅷ活性（FⅧ∶C）、因子Ⅸ活性（FⅨ∶C）和因子Ⅻ活性（FⅫ∶C）均在正常范围内。先证者-1基因测序发现FⅪ基因内含子4的3′端剪切受位存在c.326-1G>A剪接突变及10号外显子c.1107C>A（p.Tyr351X） 复合杂合突变;家系分析表明,先证者-1外婆、母亲及哥哥存在c.326-1G>A杂合剪接突变,奶奶及父亲存在c.1107C>A杂合无义突变。在先证者-1外周血中未能检测到FⅪ mRNA。先证者-2 FⅪ基因测序发现8号外显子存在c.841C>T（p.Gln263X）纯合无义突变;家系分析表明先证者-2父亲、母亲、女儿及儿子存在c.841C>T杂合突变。  结论  FⅪ基因c.326-1G>A剪接突变、p.Tyr351X和p.Gln263X是导致2个遗传性FⅪ缺陷症先证者FⅪ缺乏的原因。     

错义突变Gly400Val导致的凝血因子Ⅺ缺陷症

目的 检测一个中国汉族人凝血因子Ⅺ(FⅪ)缺陷家系中的基因突变。方法 测定先证及家系成员凝血因子活性(FⅪ：C)；抽取外周血单个核细胞中的基因组DNA，采用PCR扩增FⅪ基因所有外显子及其侧翼序列，直接测序；针对突变位点进行等位基因特异性PCR(ASPCR)扩增。结果 先证者部分凝血活酶时间(APTT)延长94．15s，FⅪ：C为正常的2．1％。家系成员杂合子的FⅪ：C均下降，为正常对照的27．0％～48．4％。先证者FⅪ基因外显子11第1296位苷酸G突变为T，导致其所编码的甘氨酸残基为缬氨酸残基替代((Gly400Val)。部分家系成员该位点呈杂合性改变。结论 Gly400Val为FⅪ缺陷的原因，杂合子的FⅪ水平可能由于显性负机制的存在而进一步降低。     

His348Gln杂合突变伴hrg353Gln杂合多态性导致的遗传性凝血因子Ⅶ缺陷症家系分析

目的：对1例遗传性凝血因子Ⅶ（FVH）缺陷患者进行基因分析和家系调查,初步探讨其发病的分子机制。方法：检测先证者及其家系成员凝血酶原时间（PT）、活化部分凝血活酶时间（APTT）、纤维蛋白原（FIB）、凝血酶原活性（FII：C）、凝血因子V活性（FV：C）、FVII活性（FVII：C）和凝血因子x活性（FX：C）及FVII抗原（FVII：Ag）等进行表型诊断;用DNA直接测序法分析先证者Ⅳ基因的全部外显子、侧翼、5’和3’非翻译区及家系成员相应的突变位点区域,用反向测序证实所发生的突变。结果：先证者PT延长为22．4s,FVII：C和FVII：Ag明显降低,分别为7％和10％;父亲、母亲、姐姐及儿子的PT正常或稍延长,FVII：c分别为63％、54％、57％和46％,FVH：Ag分别为67％、53％、61％和49％;先证者和所有家系成员的APTT及其他凝血指标均在正常参考范围内。测序发现先证者Ⅳ基因第8号外显子存在g．11482T〉G（His348Gln）杂合突变和g．11496G〉A（Arg353Gln）杂合多态性;其母亲、姐姐、儿子均存在F7基因g．11482T〉G杂合突变;父亲存在,7基因g．11496G〉A杂合多态性。结论：肜基因His348Gln杂合突变协同Arg353Gln杂合多态性是导致该先证者FVII缺陷症的分子机制。     

复合杂合突变导致的遗传性凝血因子XI缺陷症家系分析

目的 寻找复合杂合突变导致的遗传性凝血因子XI(FXI)缺陷症患者家系的致病基因并初步探讨其分子致病机制。方法 检测先证者及家系成员(共13人)血浆凝血酶原时间(PT)、活化部分凝血活酶时间(APTT)、纤维蛋白原(FIB)、血浆FXI活性(FXI:C)及FXI抗原(FXI:Ag)等指标;提取基因组DNA,用Sanger测序法分析先证者F11基因的全部外显子和侧翼序列,发现突变位点后反向测序予以证实,并检测家系成员相应的突变位点区域。ClustalX软件分析突变位点的保守性;用MutationTaster和PROXIEAN在线生物信息学软件预测突变位点对蛋白质功能的影响。用Swiss-PdbViewer软件构建突变蛋白模型。结果 先证者APTT明显延长,为85.9 s,其FXI:C和FXI:Ag均降低,分别为2%和4.8%;其母亲、二哥、二姐、侄子、外甥女和儿子FXI:C和FXI Ag也有不同程度下降。先证者F11基因第8外显子存在c.841C> T(p.Gln263stop)杂合突变及第10内含子3’端剪切位点突变(IVSJ-4del gttg);其母亲、二哥、侄子携带p.Gl...     

蛋白S基因突变导致深静脉血栓形成的研究

摘要：目的了解1例青少年起病的复发性深静脉血栓形成（DVT）患者蛋白S（PS）缺乏的分子发病机制。方法收集患者
及其家系成员的血标本,进行凝血和抗凝指标的检测。凝血功能的检测采用一步凝固法,蛋白C、蛋白S的活性检测采用
发色底物法,蛋白S抗原检测采用ELISA方法。对患者及其家系成员的PS基因各外显子片段及外显子内含子侧翼序列
进行PCR扩增和产物送测序分析。结果患者及其父亲为遗传性PS缺乏患者,其PS基因第10号外显子发生了C82792T
杂合点突变,导致PS蛋白氨基酸肽链第314个精氨酸残基（R）被半胱氨酸残基（C）所替换,发生R314C杂合突变。结论
患者反复发作DVT系由PS基因错义杂合突变导致的遗传性PS缺乏所致,该基因突变为国际上首次报道。     

移码突变L442Cfs*8导致的凝血因子XI缺陷症家系表型及基因型分析

目的研究一个遗传性凝血因子XI（FXI）缺陷症家系的表型和基因型,探讨其分子致病机制。方法抽取先证者及家系,共3代5人外周血,上层血浆检测凝血相关指标;PCR扩增F11的15个外显子,进行测序分析,发现突变位点后,反向测序验证;采用3种生物信息学软件（PolyPhen-2、MutationTaster和SIFT）分析突变位点对蛋白质的影响。结果先证者及其父亲活化部分凝血活酶时间分别为92.9s、44.7s,FXI活性分别为2%、23%,FXI抗原分别为3.6%、5%,其他家系成员各项凝血指标均在正常参考范围内。先证者以及父亲F11的11号外显子发生了c.1677_1677delT杂合突变,导致L442Cfs*8杂合突变。生物信息学软件预测表明,该突变可影响蛋白质功能并导致相应疾病的发生。结论F11存在L442Cfs*8杂合突变,可能是导致患者FXI活性下降的原因,该突变在国际上也为首次发现。     

一个新的双重杂合突变Met306Val和Thr181Asn导致的遗传性凝血因子Ⅶ缺乏症

目的 对1例遗传性凝血因子Ⅶ（FⅦ）缺乏症患者及其家系成员进行凝血因子Ⅶ（FⅦ）基因分析,揭示其发病的分子机制。方法提取先证者及其家系成员外周血基因组DNA,聚合酶链反应（PCR）法扩增FV0基因8个外显子及其侧翼序列,核苷酸序列分析检测FV0基因异常;将先证者突变序列、家系成员和100名正常人相应序列的PCR产物用限制性内切酶EC091I消化,以进一步确定基因突变位点并排除基因多态性;用蛋白质分子模型模拟软件对基因突变的分子结构病理学进行分析。结果先证者FV0基因8号外显子的10833位核苷酸发生A→G杂合突变,导致Met306Val;先证者7号外显子的9643位核苷酸发生C→A杂合突变,导致Thr181Asn。家系分析前者遗传于母亲,后者遗传于父亲,先证者胞妹为A10833G（Met306Val）杂合子。蛋白质空间构型模拟分析发现,Met306Val突变位于FⅦ分子的表面,产生空间位阻影响蛋白的结构和功能。结论FⅦ基因Met306Val和m18lAsn双重杂合突变是导致该遗传性凝血因子Ⅶ缺乏症的分子机制;推测Met306Val突变改变了蛋白质分子的空间构型,从而影响FⅦ蛋白的功能。Met306Val突变是一种国际上尚未报道的新的突变类型。     

一个遗传性抗凝血酶缺陷症家系的表型与基因突变分析

目的：对一例遗传性抗凝血酶（AT）缺陷症患者及其家系成员进行凝血指标和基因表型分析,初步探讨其分子发病机制。方法：在Stago仪器上检测家系各成员外周血的血浆AT活性（AT:A）、AT抗原（AT:Ag）等凝血指标;提取外周血DNA并测序,定位基因突变位点;利用生物信息学软件分析突变对蛋白功能的影响。结果：先证者及其外祖母、父亲、母亲和弟弟的AT:A均有不同程度降低,且AT:Ag同步下降,所有家系成员蛋白S活性（PS:A）和蛋白C活性（PC:A）指标均无明显异常,表现为I型AT缺陷症。基因分析显示：先证者SERPINC1 基因存在第1号外显子c.1A＞G杂合错义突变（p.Tyr2stop）以及第5号外显子c.1005G＞A杂合同义突变;其父亲携带c.1A＞G杂合错义突变,其外婆、母亲和弟弟携带c.1005G＞A杂合同义突变。保守性分析显示,Tyr2在同源物种间高度保守;MutationTaster、PolyPhen-2和LRT三个在线生物信息学软件分析均显示p.Tyr2stop突变为“致病的、有害的”;蛋白模型分析显示,p.Tyr2stop突变会引起AT基因翻译过程提前终止,产生截短蛋白。结论：该先证者及家系成员AT:A和AT:Ag不同程度降低与SERPINC1 基因上存在的c.1A＞G杂合错义突变和c.1005G＞A杂合同义突变有关。     

两例遗传性凝血因子Ⅺ缺乏症患者的基因分析

目的对两例遗传性凝血因子Ⅺ缺陷症的患者进行FⅪ基因突变分析,探讨其分子发病机制。方法两例患者在常规凝血检查时发现活化部分凝血活酶时间(aPTT)明显延长,进行aPTT纠正试验和凝血因子活性检测,发现均为凝血因子Ⅺ活性(FⅪ:C)降低。收集患者外周血,分别提取DNA,使用聚合酶链式反应分别扩增两例患者FⅪ的所有外显子及其侧翼序列,并将扩增产物进行测序。测序结果应用Chromas软件与FⅪ正常序列(NG_008832.1)进行比对;有突变的片段进行反向测序并比对。结果病例1:aPTT 109.6 s,FⅪ:C 0.4%;病例2:aPTT 50.1 s,FⅪ:C6.7%;两例患者aPTT纠正试验和其余凝血因子活性均正常。FⅪ基因测序结果显示:病例1在Exon2上发生18 del A纯合缺失,导致移码突变(Val-13 Trpfs X15),该突变为新发现的突变点;病例2在Exon7上发生738 GA杂合突变、导致Trp228 stop,同时在Exon9上发生1021 GA杂合突变、导致Glu323 Lys。结论上述突变可能分别是导致两例患者FⅪ缺乏的分子致病机制。     

一个纤维蛋白原α链Arg19 Gly突变导致的遗传性异常纤维蛋白原血症家系

目的对一个遗传性异常纤维蛋白原血症家系进行表型和基因型分析。方法采集先证者及其父母外周血进行常规出凝血检查,用Clauss法和免疫比浊法分别检测纤维蛋白原（Fbg）活性和抗原。抽提DNA,PCR扩增纤维蛋白原基因FGA、FGB和FGG所有外显子及其侧翼序列,DNA测序并与基因文库比对确定基因异常。结果先证者活化部分凝血酶原时间（aPTT）、凝血酶原时间（PT）正常,凝血酶时间（TT）为28．10S,Fbg活性明显下降,抗原在正常范围内,活性显著低于抗原;其父表型检测结果与之相似。基因分析发现,先证者及其父亲F魄、FGA基因第2外显子均存在A1211G杂合碱基置换,导致Arg19Gly错义突变。结论鉴定该病例为遗传性异常纤维蛋白原血症,Fbgd链Arg19Gly杂合错义突变是致病原因。     

非肌性肌球蛋白重链9基因突变相关疾病:一个家系报告

目的:提高对非肌性肌球蛋白重链9基因(myosin heavy chain 9, nonmuscle,MYH9)突变相关疾病的认识.方法:报告一个MYH9相关疾病家系的临床及实验室检查资料,包括外周血和骨髓涂片的细胞形态学检查(瑞姬染色),外周血超微结构检查,流式细胞术分析血小板膜糖蛋白,应用逆转录-聚合酶链反应和直接测序的方法分析MYH9 mRNA,应用聚合酶链反应和直接测序方法分析MYH9基因.结果:患儿及其父亲均有巨大血小板、血小板减少和粒细胞内包涵体(D(o)hle样小体).患儿及其父亲血小板膜糖蛋白GPIb均轻度降低.mRNA和基因组DNA分析均证实,患儿存在杂合的碱基替代突变(5797C＞T),使第1933位密码子CGA转为终止密码子TGA.基因组DNA分析显示,其父亲携带有与患儿相同的突变.结论:本例患儿及其父亲具有巨大血小板、血小板减少、粒细胞内包涵体和MYH9基因点突变,MYH9相关疾病的诊断成立.     

一例TSC2基因低比例突变嵌合体基因学分析

目的: 对一例临床表现不典型的结节性硬化症（TSC）患者进行基因突变分析以明确诊断。方法: 收集一例临床上拟诊TSC的患者及其父母的外周血,通过全外显子组测序技术对先证者TSC1和TSC2基因的全部外显子及其侧翼序列进行测序,确定候选致病突变位点,同时对先证者及其父母的外周血DNA进行Sanger测序验证,并用液滴数字PCR技术确定先证者体细胞中该突变嵌合比例。结果: 先证者的TSC2基因第11号外显子存在c.1096G>T（p.E366*）杂合无义突变,为微小突变峰,突变比例未高于其突变阈值,不排除嵌合体的可能。液滴数字PCR结果提示,先证者为c.1096G>T点突变嵌合体,嵌合比例为14%。结论: 先证者TSC2基因发生体细胞镶嵌突变,c.1096G>T可能是该TSC患者的致病原因。液滴数字PCR有助于体细胞镶嵌突变嵌合体的确诊。     

甲状腺激素抵抗综合征患儿及其家庭的基因研究并文献回顾

目的研究甲状腺激素抵抗综合征（THRS）患儿的临床表现及其家庭甲状腺激素受体β（TRβ）的基因型。方法采集THRS患儿及其父母外周血标本,用PCR技术和直接测序法测定TRβ基因。结果患儿和其父亲检测到TRβ基因有突变,在第3号染色体第3外显子剪切点有一碱基插入,其母亲TRβ基因正常。结论 THRS是甲状腺受体基因突变相关性疾病,基因检测是诊断该病的根本手段。     

多发性内分泌肿瘤1型6例及其家系研究

目的:分析6例多发性内分泌肿瘤1型(MEN1)患者及其家系成员的临床特点,研究MEN1基因突变特征?方法:收集患者及家系成员的临床资料,提取6例患者及其各自家系成员(共13例)外周血DNA,对MEN1基因编码区9个外显子进行PCR扩增,产物直接测序?结果:家系1中2例患者和2例家系成员MEN1基因第10外显子存在杂合突变c.1378C>T,家系2中1例患者MEN1基因第2外显子存在杂合突变c.80C>G,家系3中先证者及其母亲MEN1基因第9外显子存在杂合突变c.1225T>C,其余人员均未发现突变?其中MEN1基因突变c.80C>G和c.1225T>C为新发现的突变类型,c.1378C>T为已知突变类型?结论:MEN1基因突变分析有助于MEN 1患者早期诊断及其亲属的筛查?本研究发现2种新的MEN1突变类型能增加研究者对于MEN1遗传学特征的认识?     

一个纯合子Tyr503Cys突变导致的遗传性凝血因子Ⅺ缺陷症家系分析

目的：对一个纯合子Tyr503Cys错义突变导致的遗传性凝血因子XI（FXI）缺陷症家系进行表型和基因检测,寻找致病基因并初步探讨其分子致病机制。方法：检测先证者及其家系成员（共3代5人）的血浆凝血酶原时间（PT）、活化部分凝血活酶时间（APTT）、凝血因子Ⅷ促凝活性（FVIII:C）、凝血因子IX促凝活性（FIX:C）、FXI促凝活性（FXI:C）、凝血因子XII促凝活性（FXII:C）和FXI抗原（FXI:Ag）含量等指标以明确诊断。采用PCR直接测序法分析先证者F11基因所有外显子和侧翼序列,发现突变位点后用反向测序予以证实,并检测家系成员相应的突变位点区域。使用ClustalX-2.1-win软件分析氨基酸突变位点的保守性;用PolyPhen-2、PROVEAN和Mutation Taster软件分析突变对蛋白质功能的影响;用Swiss-PdbViewer软件对突变位点进行蛋白模型和氨基酸相互作用分析。结果：先证者APTT为59.3 s,明显延长,FXI:C降低至13%;其母亲、女儿和儿子的APTT均有不同程度延长,FXI:C降至37%～42%,该家系5人FXI:Ag均在参考值范围。基因分析发现先证者F11基因第13号外显子存在c.1562A＞G纯合错义突变,导致Tyr503Cys突变;其母亲、女儿和儿子存在Tyr503Cys突变杂合子。保守性分析结果表明,Tyr503在同源物种间高度保守。3种生物信息学软件对该突变的预测结果一致,均预示此突变很可能是有害突变,可引起相关疾病。突变蛋白模型分析显示,野生型Tyr503与Ile370、Lys554形成2个氢键;突变型Cys503与Lys554之间新增了一个氢键。结论：该先证者F11基因第13号外显子存在c.1562A＞G纯合错义突变,导致Tyr503Cys突变;推测该纯合突变遗传自具有血缘关系且均存在Tyr503Cys杂合子的父母,并与该家系FXI水平减低有关。     

一个遗传性纤溶酶原缺陷症家系的表型与基因突变分析

目的：对一个遗传性纤溶酶原（PLG）缺陷症家系进行表型和基因变异分析,探讨其发病的分子机制。方法：检测先证者及其家系成员（共3代4人）的凝血酶原时间（PT）、活化部分凝血活酶时间（APTT）、凝血酶时间（TT）、纤维蛋白原（FIB）、D-二聚体（D-D）、纤维蛋白（原）降解产物（FDP）、纤溶酶原活性（PLG:A）、纤溶酶原抗原（PLG:Ag）、抗凝血酶活性（AT:A）、蛋白C活性（PC:A）及蛋白S活性（PS:A）等指标以明确诊断。用DNA直接测序法分析先证者PLG基因的所有外显子及侧翼序列、5’和3’非翻译区及家系成员相应的突变位点区域,用反向测序予以证实。应用ClustalX-2.1-win软件将突变氨基酸进行同源物种序列保守性分析;利用PolyPhen-2、PROVEAN、SIFT和MutationTaster 4个在线生物信息学软件分析突变氨基酸对蛋白质功能的影响;用Swiss-PdbViewer软件对突变位点进行蛋白质模型和氨基酸相互作用分析。结果：先证者和其祖父、父亲PLG:A均降低为正常值的50%左右,PLG:Ag含量正常,结果分别为45%、95%,64%、94%和64%、104%;基因分析发现先证者PLG基因第15号外显子存在c.1858G＞A杂合错义突变导致p.Ala601Thr;其祖父和父亲具有同样的基因突变。Ala601在其11个同源物种间高度保守;4个在线生物信息学软件预测结果一致,均为有害突变,可引起相应疾病。结论：该先证者的PLG基因第15号外显子存在c.1858G＞A（p.Ala601Thr）杂合错义突变;祖孙三代均为Ala601Thr杂合子,突变符合孟德尔遗传规律,且与该家系PLG活性降低有关。     

全外显子组测序发现FUT6基因在1例糖尿病肾病中的终止突变

目的:检测与糖尿病肾病相关的致病基因。方法: 应用外显子捕获技术和高通量测序技术对1例临床病理确诊的DN患者的全基因组外显子进行测序,将测序数据筛选出的可能对基因功能有影响的非同义突变和剪切位点突变,与公共数据库YH、dbSNP129、8HapMapexome和dbSNP thousands genome进行对比过滤,然后对筛选出的候选基因进行免疫组化染色研究其表达量的变化。结果:通过数据的对比过滤,共发现509个突变位点,其中包括497个错义突变和12个无义突变。发生无义突变并且在肾脏高表达的基因有ANKRD35、ACSM2A、 FUT6和HAAO。其中FUT6基因的315TAC>TAA,氨基酸残基由酪氨酸突变为终止密码子,免疫组化证实FUT6在该患者的肾活检组织中表达量减少。结论: 糖尿病肾病患者中发现FUT6基因终止突变及其表达的显著降低,提示FUT6可能与DN的发病有关。     

微创内镜保胆取息肉术治疗胆囊息肉64例临床分析

目的：：探讨微创内镜保胆取息肉术与腹腔镜胆囊切除术治疗胆囊息肉的疗效。方法：128例胆囊息肉患者随机分为观察组和对照组,每组64例,观察组行微创内镜保胆取息肉术治疗,对照组行腹腔镜胆囊切除术治疗。对比分析两组患者术中出血量、手术时间、术后第1次排气时间、术后不良反应和并发症等。结果：观察组患者术中出血量、手术时间、第1次排气时间、不良反应发生率、并发症发生率均明显低(短)于对照组,组间比较差异具有统计学意义(P＜0.05)。结论：微创内镜保胆取息肉术治疗胆囊息肉具有操作简单、手术时间短、创伤小、出血少、术后排气早及恢复快、并发症少等优点。     

一例17-α羟化酶缺陷症患者临床和CYP17A1基因突变分析

目的 分析1例17-α羟化酶缺陷症患者的临床和CYP17A1基因突变特点.方法 以1例17-α羟化酶缺陷症患者为研究对象,观察其临床表现和辅助检查结果,并对患者及其父母进行CYP17A1基因检测.结果 患者就诊时血压高于正常值,第二性征发育不良;血钾低于正常值.CYP17A1基因检测显示,患者第8外显子9个碱基（TCGACTCTT）缺失,导致第487～489位氨基酸缺失,其母为该部位氨基酸杂合缺失,其父未有异常发现.结论 高血压伴低血钾患者如同时存在性发育不良,应考虑17-α羟化酶缺陷症的可能,CYP17A1基因检测有助于早期诊断.