凝血因子ⅨArg327Ile突变蛋白功能缺陷机制研究

目的 研究FⅨArg327Ile (R327I)及Arg327 Ala(R327A)突变蛋白功能,探讨R327I突变导致血友病B的分子发病机制.方法 采用潮霉素筛选稳定表达细胞株,ELISA法筛选高效表达FⅨ重组蛋白细胞株,采用快流速Q琼脂糖凝胶和离子交换两步法分离纯化重组蛋白.ELISA和SDS-PAGE电泳分别检测重组蛋白含量和纯度.FⅦa/TF/Ca2+和FⅪa/Ca2+活化野生型及R327I和R327A突变FⅨ蛋白,用WB法分别检测不同时间内活化生成的FⅨa.野生型及两种突变FⅨa在不同FⅧa浓度下活化激活FX,以此计算野生型及两种突变FⅨa与FⅧa的解离常数;在含或不含FⅧa的条件下,检测野生型及两种突变FⅨa对不同浓度FX的激活能力,以此计算其催化效率.结果 表达分离纯化野生型、R327I和R327A FⅨ重组蛋白总量分别为450、210和64 μg,SDS-PAGE电泳结果显示重组蛋白纯度符合要求.两种突变蛋白均能被FⅦa/TF/Ca2+和FⅪa/Ca2+正常激活.R327I与R327A两种FⅨa突变蛋白与FⅧa的结合力分别为野生型的1/4和1/5.在含FⅧa条件下,R327I和R327I突变FⅨa对FX催化效率分别为野生型的1/6和1/8.而不含FⅧa条件下,催化效率分别为野生型的1/3和1/7.4.结论 R327I和R327A两种突变FⅨa与FⅧa结合异常,R327位点参与FⅧa结合,同时也与底物活化相关.R327I突变与FⅧa结合力降低导致重型血友病B的发生.     

同一等位基因复合杂合突变导致Ⅰ型遗传性抗凝血酶缺陷症

目的对1例遗传性抗凝血酶（AT）缺陷症先证者及其家系进行表型诊断和基因诊断。方法采用免疫比浊法和发色底物法分别检测先证者及其家系成员的AT抗原（AT：Ag）和AT活性（AT：A）,抽提外周血基因组DNA,PCR扩增AT基因（SERPINC1）7个外显子及其侧翼序列,应用直接测序法对先证者进行AT基因序列分析。针对先证者中发现的突变位点,对其家系成员进行相应基因突变检测,同时在100例正常人中筛查以排除多态性。结果先证者AT：Ag和AT：A分别为114 mg/L和54.8%。其AT基因外显子2区发现了2个杂合点突变,分别为c.134G〉A和c.342T〉G。其家系部分成员检测到相应的杂合突变。家系遗传分析表明,2个杂合突变位于同一等位基因。结论同一等位基因复合杂合突变是导致该家系Ⅰ型遗传性AT缺陷症的分子原因。     

一例GPⅡb基因突变导致血小板无力症的诊断

目的对1例血小板无力症（GT）患者进行实验诊断,分析引起血小板膜糖蛋白（GP）缺陷的突变基因。方法通过对先证者凝血常规、血小板计数、血小板聚集功能、出血时间、GPⅡb/Ⅲa（CD41/CD61）含量等项目的检测和血涂片中血小板形态及分布的观察,进行临床表型诊断。通过聚合酶链反应（PCR）扩增结合测序的方法,分析先证者GPⅡb/Ⅲa基因的所有外显子区及其侧翼序列,家系成员仅在相应突变区域进行PCR扩增和测序。同时以100名健康人作为对照进行分析,以排除基因多态性。结果先证者凝血常规检测和血小板计数正常,但出血时间延长,血小板聚集功能异常;表现为对多种生理性诱聚剂反应低下,但对瑞斯托霉素反应正常,血块退缩不良;流式细胞术检测CD41、CD61含量显著降低;血涂片中血小板散在,无聚集现象。经测序,发现先证者GPⅡb基因23号外显子存在18183A〉C杂合变异,导致GPⅡb蛋白Q778P替换。与100名健康对照者测序比较,排除基因多态性,证实其为基因突变。结论 GPⅡb基因的Q778P杂合突变是导致该先证者患GT的原因之一。     

中西医结合创新治疗运动神经元病286例报告

目的观察中西医结合创新疗法治疗运动神经元病(MND)患者的疗效。方法运动神经元病属中医"痿证"范畴。本研究在常规综合治疗基础上,采用一种用于促进神经损伤修复的药物组合物[精氨酸1. 5～5 g,异亮氨酸1. 5～5 g,亮氨酸2. 5～7. 5 g,赖氨酸1. 5～5 g,蛋氨酸0. 25～1. 5 g,苯丙氨酸0. 25～1. 5 g,苏氨酸1. 5～5 g,色氨酸0. 25～1. 5 g,缬氨酸2. 5～7. 5 g,组氨酸1. 5～4 g,甘氨酸1. 5～4 g,丙氨酸1. 5～5 g,脯氨酸1. 5～4 g,天冬酰胺0. 05～1. 5 g,半胱氨酸0. 05～1. 5 g,谷氨酸1. 5～5 g,丝氨酸0. 25～2. 5 g,酪氨酸0. 05～1. 5 g,L～鸟氨酸0. 25～4 g,天冬氨酸0. 5～2. 5 g;维生素(维生素B11～2 mg,维生素B21～2 mg,维生素B63～10 g,维生素C 1～3 g)]及中药"滋痿膏"。对2015年4月至2018年3月江苏大学附属武进医院收治的286例MND患者进行治疗,其中男性199例,女性87例;年龄26～81岁,平均年龄(53. 7±10. 7)岁。用法:将上述药物组合物配制在1个三升输液袋内进行静脉输注,1次/d,28 d为1个疗程,停药2周后行下一疗程,连续治疗≥1个疗程并持续随访至首次用药后第6个月。同时,在治疗期间每天于饭后2 h口服中药"滋痿膏",2次/d。观察治疗前后患者的肌萎缩侧索硬化症改良功能评分量表(ALSFRS-R评分)、疾病进展率及临床表现等变化情况。结果 286例患者中死亡16例(5. 6%),死亡原因均为疾病晚期呼吸衰竭。国际ALSFRS-R评分上升占20. 3%(58/286),评分维持不变占15. 0%(43/286)。仍有64. 7%(185/286)的患者在经过治疗后评分持续下降,但评分下降的速度较治疗前有所减缓。治疗后,MND患者疾病进展率[0. 583(0. 478)分/月]低于治疗前[0. 600(0. 533)分/月],差异有统计学意义(Z=-2. 088,P <0. 05),且174例(60. 8%)患者的疾病进展率在治疗后较前下降。临床症状改善情况:肌肉萎缩好转、肌力增加12例(4. 2%),舌肌萎缩、言语不清好转6例(2. 1%),流涎好转9例(3. 1%),吞咽功能改善15例(5. 2%),四肢活动度增加11例(3. 8%),3例(1. 0%)不能站立或行走的患者恢复部分行走能力,呼吸困难好转6例(2. 1%)。结论本疗法一方面通过滋痿膏起到补益脾肾、扶元起痿、益气温阳、补肾壮骨、疏肝理气、养荣生肌、扶正祛邪、强骨滋痿、双向免疫调节的作用;另一方面,通过疗法中所提供的各种氨基酸与维生素B6等,能够为患者提供充足的代谢底物及强劲的动能,促进机体酶代谢、利尿与解毒,达到保护大脑及神经系统功能、改善肝功能、提高机体免疫功能的功效。两者相辅相成,使损伤的神经细胞在一定程度上得到修复。该中西医结合创新疗法疗效确切,且无毒、无害、无副作用、重复性好。     

一种促进神经损伤修复的药物组合物治疗22例ALS患者1年后的疗效观察

目的观察一种促进神经损伤修复的药物组合物治疗肌萎缩侧索硬化症(ALS)患者的疗效。方法选取2015年4月至2017年9月江苏大学附属武进医院及苏州高新区人民医院收治的22例ALS患者为研究对象进行前瞻性自身对照研究,其中男性10例,女性12例;年龄34～68岁,平均年龄(51. 64±9. 28)岁。在常规综合治疗基础上,将一种促进神经损伤修复的药物组合物[精氨酸1. 5～5 g,异亮氨酸1. 5～5 g,亮氨酸2. 5～7. 5 g,赖氨酸1. 5～5 g,蛋氨酸0. 25～1. 5 g,苯丙氨酸0. 25～1. 5 g,苏氨酸1. 5～5 g,色氨酸0. 25～1. 5 g,缬氨酸2. 5～7. 5 g,组氨酸1. 5～4 g,甘氨酸1. 5～4 g,丙氨酸1. 5～5 g,脯氨酸1. 5～4 g,天冬酰胺0. 05～1. 5 g,半胱氨酸0. 05～1. 5 g,谷氨酸1. 5～5 g,丝氨酸0. 25～2. 5 g,酪氨酸0. 05～1. 5 g,L～鸟氨酸0. 25～4 g,天冬氨酸0. 5～2. 5 g;维生素(维生素B11～2 mg,维生素B21～2 mg,维生素B63～10 g,维生素C 1～3 g)]配制在1个三升输液袋内进行静脉输注,1次/d,28 d为1个疗程,休息2周后行第2个疗程,持续治疗时间≥4个疗程或6个月。观察患者治疗前后及随访的国际肌萎缩侧索硬化症改良功能评分量表(ALSFRS-R)评分、疾病进展率及症状体征等变化情况。结果本组22例ALS患者中死亡1例(4. 55%),为疾病晚期呼吸衰竭。肌肉萎缩好转、肌力增加3例(13. 6%),舌肌萎缩、构音障碍好转1例(4. 5%),流涎好转2例(9. 1%),吞咽功能改善1例(4. 5%),四肢活动度增加2例(9. 1%),1例(4. 5%)不能站立和行走的患者可搀扶站立。各阶段ALSFRS-R评分波动范围:首次门诊时为18. 0～44. 0分,治疗6个月时为18. 0～41. 0分,末次治疗时为12. 0～39. 0分之间,末次随访时为6. 0～38. 0分。治疗6个月时ALSFRS-R评分与治疗前比较,差异无统计学意义[24. 50(12. 3)分比27. 15(14. 7)分,Z=-1. 183,P> 0. 05],6例(27. 3%)患者的ALSFRS-R评分上升,4例(18. 2%)评分不变,12例(54. 5%)评分下降。末次治疗时ALSFRS-R评分与治疗前相比有所下降[23. 50 (6. 0)分比27. 15 (14. 7)分,Z=-2. 557,P> 0. 05],但仍有6例(27. 3%)患者的评分上升。治疗6个月和末次治疗时的疾病进展率虽与治疗前的差异无统计学意义[0. 521(0. 563)分/月比0. 673(0. 716)分/月,Z=-1. 834;(0. 702±0. 469)分/月比(0. 716±0. 440)分/月,t=0. 259。P均> 0. 05],但仍分别有72. 7%(16/22)和54. 5%(12/22)的患者疾病进展率较前下降。对所有患者随访至首次治疗后1年以上发现,其ALSFR-R评分4例(18. 2%)上升,1例(4. 5%)不变,17例(77. 3%)下降,且疾病进展率低于治疗前[(0. 584±0. 372)分/月比(0. 716±0. 440)分/月,t=2. 706,P <0. 05]。经过长期规范化治疗的患者,即使停止用药一段时间,仍然有72. 7%(16/22)患者的疾病进展速率得以减缓。结论该促进神经损伤修复的药物组合物能在整体上为ALS患者提供机体新陈代谢的底物、辅酶与强劲的动能,通过促进机体酶与氨基酸代谢以及血液循环,使受损、变性的神经系统功能得到一定程度的修复,增强了神经元的存活能力,从而延缓疾病发展,改善病情与临床症状。新疗法的确无毒无害无副作用,重复性好。     

一种促进神经损伤修复的药物组合物治疗60例MND患者6个月后的疗效观察

目的观察一种促进神经损伤修复的药物组合物治疗运动神经元病(MND)患者的疗效。方法选取2016年9月至2018年4月江苏大学附属武进医院、苏州高新区人民医院及常州华森康复医院收治的60例MND患者为研究对象进行前瞻性自身对照研究,其中男性39例,女性21例;年龄26～73岁,平均年龄(52. 87±9. 78)岁。在常规综合治疗基础上,将一种促进神经损伤修复的药物组合物[精氨酸1. 5～5 g,异亮氨酸1. 5～5 g,亮氨酸2. 5～7. 5 g,赖氨酸1. 5～5 g,蛋氨酸0. 25～1. 5 g,苯丙氨酸0. 25～1. 5 g,苏氨酸1. 5～5 g,色氨酸0. 25～1. 5 g,缬氨酸2. 5～7. 5 g,组氨酸1. 5～4 g,甘氨酸1. 5～4 g,丙氨酸1. 5～5 g,脯氨酸1. 5～4 g,天冬酰胺0. 05～1. 5 g,半胱氨酸0. 05～1. 5 g,谷氨酸1. 5～5 g,丝氨酸0. 25～2. 5 g,酪氨酸0. 05～1. 5 g,L～鸟氨酸0. 25～4 g,天冬氨酸0. 5～2. 5 g;维生素(维生素B11～2 mg,维生素B21～2 mg,维生素B63～10 g,维生素C 1～3 g)]配制在1个三升输液袋内进行静脉输注,1次/d,28 d为1个疗程,休息2周后行第2个疗程,持续治疗时间≥4个疗程(或6个月)。观察患者治疗前后及随访的肌萎缩侧索硬化症改良功能评分量表(ALSFRS-R)评分、疾病进展率及临床表现等变化情况以评估治疗效果。同时记录治疗过程中患者出现的不良反应,以评价新疗法的安全性。结果本组60例MND患者中死亡3例(5. 00%),均为疾病晚期呼吸衰竭。肌肉萎缩好转、肌力增加6例(10. 00%),舌肌萎缩、构音障碍好转1例(1. 67%),流涎好转2例(3. 33%),吞咽功能改善1例(1. 67%),四肢活动度增加4例(6. 67%),1例(1. 67%)不能独立行走的患者可辅助蹲起和独自缓慢行走。各阶段ALSFRS-R评分:首次门诊(n=60)的ALSFRS-R评分为15. 0～48. 0分,平均(32. 21±8. 70)分;治疗4个疗程(或6个月)时(n=60)的评分为3. 0～45. 0分,平均(28. 32±9. 56)分;末次治疗时(n=59)评分为3. 0～48. 0分,平均(28. 36±9. 50)分。治疗4个疗程(或6个月)时(n=60,t=-3. 950,P <0. 05)和末次治疗时(n=59,t=3. 845,P <0. 05)的ALSFRS-R评分均低于治疗前,差异均有统计学意义。但完成6个月治疗时有19例患者(31. 67%)的ALSFRS-R评分上升,2例(3. 33%)评分不变,且有61. 67%(37/60)的患者疾病进展率较前下降;延长治疗时间后,评分下降患者的占比降低至57. 63%(34/59)。对28例停药患者进行2～12月的随访发现:在完成一定疗程的规范化治疗后,即使患者停止用药,仍然可见到较为长时间的持续疗效:25. 93%(7/28)停药患者的ALSFRS-R评分较治疗前有所上升;末次随访疾病进展率仍然低于治疗前[0. 50(0. 42)分/月比0. 56(0. 60)分/月,Z=-2. 691,P <0. 05)],且74. 07%(20/27)停药患者的疾病进展率较治疗前减缓。但因为停止治疗后,疗效难以在长时间内持续维持在较好水平[74. 07%(20/27)患者的末次随访ALSFRS-R低于末次治疗],因此持续的巩固治疗是有必要的。结论该促进神经损伤修复的药物组合物能在整体上为MND患者提供机体新陈代谢的底物、辅酶与强劲的动能,从而延缓疾病发展,改善病情与临床症状。新疗法的确无毒无害无副作用,重复性好。     

小鼠尿激酶型纤溶酶原激活物与其受体结合关键氨基酸的鉴定

目的尿激酶型纤溶酶原激活物(uPA)及其受体(uPAR)在细胞表面介导多种生物学效应。本文目的是解析小鼠uPA蛋白结构中与其受体结合的关键氨基酸。方法包含小鼠uPA全长cDNA的质粒购于ATCC公司,小鼠cDNA序列进一步克隆至Puro-pMT表达载体。用定点突变法构建各类uPA突变体表达质粒。表达质粒用磷酸钙转染至S2细胞中,用10μg/ml嘌呤霉素筛选稳定表达细胞。表达的重组蛋白分别用CM sephadex柱和sephadex G75柱纯化。纯化后的蛋白分别用SDS-PAGE和免疫印迹法鉴定。用表面等离子共振技术(SPR)检测重组uPA与uPAR的结合常数。结果用定点突变法成功构建小鼠uPA S22、Y23、K24、Y25、F26、S27、I29、R31、E41、S358分别突变为丙氨酸的突变体及R28、30、31突变为N28、H30、W31的突变体M3。经阳离子交换层析和分子筛纯化,重组蛋白的纯度均大于95%并能被小鼠uPA抗体所识别。结合试验表明野生型uPA和M3型uPA的KD值分别为0.467 nM和1.64 nM,10种点突变uPA的KD值范围为0.388 nM至36.5 nM。结论小鼠uPA中至少有7个氨基酸(Y23、K24、Y25、F26、S27、I29、R31)涉及小鼠uPA-uPAR的结合;Y23、Y25和F26是其中的关键氨基酸。     

罕见ICF综合征1例临床表型和分子遗传学分析

目的探讨免疫缺陷、着丝粒不稳定和面部异常(ICF)综合征的临床特征和遗传特点。方法回顾分析1例ICF综合征患儿的临床资料和基因检测结果。结果男性患儿,4岁,有反复感染;面部特征为圆脸、眼距稍宽、下颌尖、鼻梁稍扁、内眦赘皮明显、耳位低。免疫学检测示IgA缺如。基因测序发现患儿DNMT3B基因存在一个纯合错义突变c. 2506 GA,父母为杂合携带者,确诊为ICF综合征I型。结论 DNMT3B基因突变可引发ICF综合征,基因检测有助于提高此类罕见病的诊断。     

活性氧簇调控破骨细胞分化的研究进展

破骨细胞是影响骨重塑的关键细胞,其分化过程受包括活性氧簇(reactive oxygen species, ROS)在内的多种因子调控。ROS是氧气转化为水的过程中氧化还原反应的中间产物,可通过激活RANKL/RANK信号通路下游的NF-κB、MAPK和AKT等多条信号通路来促进破骨细胞分化。近年来,众多新型抗氧化剂显现出对破骨细胞分化成熟的靶向抑制作用,有望为骨质疏松症等溶骨亢进型疾病提供治疗新思路。本文对破骨细胞中ROS的产生与清除、ROS对于破骨细胞分化的调控作用和抗氧化剂治疗溶骨性疾病的研究进展进行综述,探讨ROS作为溶骨性疾病治疗靶点的巨大潜力。