外周血造血干细胞体外定向诱导树突状细胞及功能鉴定

目的：以实体瘤患外周造血干细胞（PBSC）为来源，建立体外诱导扩增树突状细胞（DC）的方法，工进行表型鉴定及功能检测。方法：以血细胞分离机分离经动员的外周造血干细胞，加入rhGM-CSF,rhIL-4和nrhTfNF-α培养7－9d成为树突状细胞，进行细胞形态学、表型及刺激T细胞增殖能力分析。结果：PBSC经诱导培养后，倒置显微镜和电镜显示典型的树突状细胞形态和超微结构；流式细胞术分析显示细胞表面抗原高表达，其中CD1a 38.28%,CD11c 66.77%,共刺激分子CD80和CD86分别为51．05％，67．58％，MHCⅡ类分子HLA－DR为72．09％，为典型的DC表型特征，同种混合淋巴细胞反应结果显示DC具有高效的刺激T淋巴细胞活化增殖的能力。结论：实体瘤患PBSC可成功诱导为具有典型形态特征及功能的树突状细胞。     

大鼠树突状细胞的体外分离、纯化、扩增及鉴定

目的 探讨诱导及纯化大鼠树突状细胞（Dendritic cells,DC）的方法，为进一步研究树突状细胞的功能、特性及临床应用提供技术方法。方法 应用重组大鼠rGM-CSF、IL－4在体外培养大鼠骨髓前体细胞获得大量DCs，经标抗大鼠OX62单抗免疫磁株分离纯化后的DCs经形态学观察、表型检测、功能学实验鉴定。结果 大鼠骨髓来源的DC在体外培养12－14d后完全成熟，99．36％培养纯化后DC表达大鼠特异性表面标志OX62；典型的成熟大鼠DC形态上类似于小鼠和人类的DC，表型为MHCⅡ＋＋，OX62＋＋，FcγR（CD32）＋／－，CD80＋／－，CD86＋＋，体外功能分析显示该DC能够强烈刺激MLR并有效递呈可溶性抗原OVA刺激初始型T细胞的增殖。结论 成功地建立了体外大量扩增大鼠骨髓DC的方法，为研究其在异种移植及诱导免疫耐受的作用打下基础。     

大鼠髓系来源的树突状细胞的体外诱导及功能鉴定

目的探讨建立合适的大鼠骨髓源性未成熟树突状细胞(imDC)的培养方法,并对其生物学特性进行评价。方法分别以不同剂量的粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和白介素(IL)-4诱导分化获得大鼠骨髓源性树突状细胞(DC),比较收获率及特异性标记蛋白(OX62)阳性的DC数量,获得最佳细胞因子浓度。并用流式细胞仪分析DC表型,混合淋巴细胞反应(MLR)检测其刺激同种T细胞增殖能力,ELISA法测定MLR上清IL-12、γ-免疫反应性纤维结合素(IFN-γ)水平。结果 GM-CSF 5 ng/ml可诱导出更高的收获率及OX62的阳性率。GM-CSF 5 ng/ml培养7 d的DC,表达中等水平的主要组织相容性(抗原)复合物Ⅱ类(MHC II)和低水平的CD86;其分泌少量IL-12;刺激同种T细胞增殖能力极低。脂多糖(LPS)刺激后MHCⅡ、CD86表达明显增加;分泌IL-12和IFN-γ增加;刺激同种T细胞增殖能力增强。结论 GM-CSF 5 ng/ml为诱导大鼠骨髓源性imDC的最佳剂量,培养7～9 d可以获得足够数量和纯度的imDC。     

大鼠OX-62+树突状细胞的体外诱导及生物学特性

目的 :从大鼠骨髓中有效地诱导、培养OX 6 2 + 树突状细胞 (dendriticcells,DC) ,观察其表型及功能特征。方法 :大鼠骨髓细胞培养 3h ,贴壁细胞加入含重组大鼠GM CSF和IL 4 ,继续培养 6～ 12d ,淘洗法去非粘附细胞中的Fc受体阳性细胞 ,流式细胞仪分析细胞表型及抗原摄取能力 ,混合淋巴细胞反应检测其刺激同种T细胞增殖能力 ,ELISA测定分泌IL 12水平。结果 :培养DC90 %以上表达OX 6 2。培养 6d的OX 6 2 + DCs具有不成熟表型 ,表达中等水平的MHCII抗原和低水平的CD80、CD86、ICAM 1;分泌少量IL 12 ;具有较强的摄取抗原能力 ,但刺激同种T细胞增殖能力极低。培养 12d的OX 6 2 + DC已经成熟 ,MHCII、CD8、CD86、ICAM 1表达明显增加 ;分泌IL 12增加 ;摄取抗原能力下降 ;刺激同种T细胞增殖能力明显增强。结论 :成功建立了体外大量扩增大鼠骨髓OX 6 2 + DC的新方法。     

Wistar大鼠树突状细胞的体外培养、扩增与鉴定

目的：探讨体外分离、培养和扩增大鼠骨髓来源树突状细胞（DC）的有效方法。方法：采用改良的Chen－WoanDC培养方法，梯度离心提取骨髓单核细胞中的非粘附细胞，加入GM CSF 5?ng/ml、IL 4 5?ng/ml进行诱导扩增，对培养的目的细胞进行形态学、OX62－FITC免疫荧光检查以及功能学鉴定。结果：DC前体细胞培养10?d呈典型树突状结构，表面标志物染色阳性，流式细胞学检查OX62单抗阳性率86％，不同培养时段的DC诱发混合淋巴细胞反应以培养10?d的DC最强，培养10?d的DC诱发混合淋巴细胞反应对同源淋巴细胞有更好的活性。结论：改良的Chen－Woan法为体外诱导扩增大鼠骨髓来源DC的有效方法。     

猪苓多糖经TLR4刺激小鼠骨髓来源的树突状细胞成熟

目的：研究猪苓多糖（polyporus polysaccharides,PPS）诱导小鼠骨髓树突状细胞（dendriticcell,DC）表型及功能成熟的分子机制。方法：从小鼠骨髓中分离单个核细胞（MNC）,用rmGM-CSF、IL-4培养5 d后将其分为三组：实验组中加入50μg/mL PPS;阳性对照组中加1μg/mL LPS;加等量RPMI 1640培养基作为阴性对照组,继续培养48 h。苏木精-伊红（HE）染色观察细胞形态;流式细胞仪（FACS）分析DC表面CD80、CD86及MHC II（I-A/I-E）表达情况;经20μg/mL Toll-like receptor（TLR）4、TLR2单抗作用1 h后,ELISA法检测培养上清中IL-12 p40含量;混合淋巴细胞反应（MLR）检测DC对T淋巴细胞的刺激能力。结果：PPS处理的DC具有毛刺状突起,呈典型的DC形态;细胞表达MHC II、CD80及CD86增加;对T淋巴细胞刺激能力增强;分泌IL-12增加且可被抗TLR4单抗所阻断。结论：PPS通过TLR4促进体外培养的小鼠骨髓DC表型与功能成熟。     

IFN-γ刺激培养未成熟树突状细胞免疫耐受效应机制研究

目的通过γ-干扰素(IFN-γ)刺激培养未成熟树突状细胞,研究在体外IFN-γ诱导未成熟树突状细胞免疫耐受的效应机制。方法采用经典的GM-CSF+IL-4诱导方案,以获得细胞表面缺乏共刺激分子的大鼠骨髓来源的未成熟树突状细胞,经IFN-γ刺激培养后,通过外源性抗原T细胞表位pCol(28-40)多肽培养,流式细胞仪检测表面MHCⅡ类分子及共刺激分子CD80、CD86,DC表面相对特异性标记OX62的情况,将脾脏分离淋巴细胞分为3组,即对照组、imDC组和imDCIFN-γ组,采用MTT法检测各组淋巴细胞增殖情况,Anneix-V-Flous检测各组淋巴细胞凋亡,ELISA法检测体外培养脾细胞上清液Th1/Th2型细胞因子,观察体外CD4+T细胞Th亚群的分化情况。结果 IFN-γ刺激培养的未成熟树突细胞通过外源性抗原T细胞表位pCol(28-40)多肽培养后低表达表面MHCⅡ类分子(14.01%)及共刺激分子CD80(4.78%)、CD86(19.79%),同样低表达DC表面相对特异性标记OX62(15.31%,P<0.05,n=4);MTT法检测共培养的脾淋巴细胞imDC组i、mDCIFN-γ组与对照组增殖...     

大鼠骨髓来源树突状细胞的分离、培养及鉴定

目的 探讨大鼠树突状细胞(dendritic cells, DC)分享、培养、鉴定的方法.方法 重组大鼠rGM-CSF、 rIL-4在体外培养大鼠骨髓前体细胞获得大量DCs, DCs经形态学观察、表型检测、功能学鉴定.结果 大鼠骨髓来源的DC在体外9d后完全成熟,90%以上培养纯化后DC表达大鼠特异性表面标志OX62,高表达MHCII、 CD80、 CD86成熟的DC具有明显刺激同种异体T细胞增殖的能力.结论 成功地建立了体外大鼠骨髓DC扩增的方法.     

白血病细胞源树突状细胞功能测定

目的：观察体外诱导的白血病细胞源树突状细胞（DC）的抗原递呈功能。方法：分离初诊8例急性髓细胞性白血病（AML）、9例慢性髓细胞性白血病（CML）患者和6例正常人的骨髓单个核细胞,用rhGM-CSF、rhIL-4和TNF-α诱导培养。分别于培养第1、6、14天用倒置显微镜进行形态学观察,流式细胞术检测免疫学表型,用混合淋巴细胞反应检测抗原递呈功能。结果：经诱导培养,AML,CML和正常组骨髓单个核细胞均出现DC典型形态的细胞,而且免疫标记差异无统计学意义（P〉0.05）。混合淋巴细胞反应结果显示,AML-DC、CML-DC和正常DC诱导生成的细胞毒T淋巴细胞（CTL）能够杀灭白血病细胞,AML-DC、CML-DC之间刺激T细胞增殖的能力相似（P〉0.05）,但2者刺激T细胞增殖的能力均低于正常DC（P〈0.05）。结论：急性和慢性白血病细胞均能诱导分化成DC,但其抗原递呈功能较弱。     

大鼠骨髓来源树突状细胞的分离与免疫学特征

目的：探讨大鼠骨髓来源树突状细胞（DC）的体外分离培养方法，为DC的免疫学研究及临床应用提供技术参考。方法：取大鼠四肢骨髓细胞悬液，经密度梯度离心得到大鼠骨髓单个核细胞（BMMNC）；应用 大鼠重组粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(rrGM-CSF)、大鼠重组白细胞介素-4（rrIL-4）及大鼠重组肿瘤坏死因子-α(rrTNF-α)进行体外培养；肿瘤抗原（TAA）/DC组于诱导分化的第3天加入大鼠卵巢癌细胞株NuTu-19的冻融抗原，获得负载TAA的成熟DC；DC组为对照组，未加入NuTu-19。对两组进行形态学观察、流式细胞学表型鉴定及体外淋巴细胞增殖反应测定。结果：大鼠骨髓来源的BMMNC在相关细胞因子的作用下可以培养出成熟的DC，ＴＡＡ／ＤＣ组高表达表面抗原，其OX62、CD86和MHC-Ⅱ表达高于对照组（P<0.01）；在效靶比（SC∶RC）为1∶3、1∶10、1∶30和1∶100时,淋巴细胞刺激指数(SI)ＴＡＡ／ＤＣ组均高于对照组（P<0.01）。结论：成功地建立了大鼠骨髓DC的培养方法，大鼠骨髓来源的BMMNC可以培养出成熟的DC。     

鼠胶质瘤细胞上清液诱导人骨髓间充质干细胞向神经元样细胞的分化

目的：分离培养人骨髓间充质干细胞(MSCs),探讨鼠胶质瘤细胞上清液对其向神经元样细胞的诱导分化。方法：利用Percoll梯度分离法,培养人MSCs。采用鼠胶质瘤细胞上清液对MSCs进行诱导分化。观察人MSCs经诱导后细胞的形态变化,采用免疫细胞化学方法检测神经元烯醇化酶(NSE)、神经丝蛋白(NF)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的表达。 结果：诱导24 h后,细胞胞体收缩呈锥形或球形,有突起长出,细胞间突起相互连接,交错成网,为典型的神经元样形态。免疫细胞化学结果显示,经诱导培养后的神经元样细胞的胞体及部分突起NSE和NF染色呈强阳性表达,而GFAP 染色呈阴性。诱导组出现NSE阳性的细胞率为(79.5±3.2)%,而对照组出现NSE阳性的细胞率为(12.1±2.0)%,两组之间比较差异有显著性 (P<0.01)。诱导组出现NF阳性的细胞率为(41.2±2.4)%,而对照组为阴性。结论：鼠胶质瘤细胞上清液可以诱导MSCs向神经元样细胞分化。     

Expansive effects of aorta-gonad-mesonephros-derived stromal cells on hematopoietic stem cells from embryonic stem cells

Background Hematopoietic stem cells (HSCs) give rise to all blood and immune cells and are used in clinical transplantation protocols to treat a wide variety of refractory diseases, but the amplification of HSCs has been difficult to achieve in vitro. In the present study, the expansive effects of aorta-gonad-mesonephros (AGM) region derived stromal cells on HSCs were explored, attempting to improve the efficiency of HSC transplantation in clinical practice.Methods The murine stromal cells were isolated from the AGM region of 12 days postcoitum (dpc) murine embryos and bone marrow（BM）of 6 weeks old mice, respectively. After identification with flow cytometry and immunocytochemistry, the stromal cells were co-cultured with ESCs-derived, cytokines-induced HSCs. The maintenance and expansion of ESCs-derived HSCs were evaluated by detecting the population of CD34+ and CD34+Sca-1+cells with flow cytometry and the blast colony-forming cells (BL-CFCs), high proliferative potential colony-forming cells (HPP-CFCs) by using semi-solid medium colonial culture. Finally, the homing and hematopoietic reconstruction abilities of HSCs were evaluated using a murine model of HSC transplantation in vivo.Results AGM and BM-derived stromal cells were morphologically and phenotypically similar, and had the features of stromal cells. When co-cultured with AGM or BM stromal cells, more primitive progenitor cells (HPP-CFCs ) could be detected in ESCs derived hematopoietic precursor cells, but BL-CFC’s expansion could be detected only when co-cultured with AGM-derived stromal cells. The population of CD34+ hematopoietic stem/progenitor cells were expanded 3 times,but no significant expansion in the population of CD34+Sca-1+ cells was noted when co-cultured with BM stromal cells. While both CD34+ hematopoietic stem/progenitor cells and CD34+Sca-1+ cells were expanded 4 to 5 times respectively when co-cultured with AGM stromal cells. AGM region-derived stromal cells, like BM-derived stromal cells, could promote hematopoietic reconstruction and HSCs’ homing to BM in vivo.Conclusions AGM-derived stromal cells in comparison with the BM-derived stromal cells could not only support the expansion of HSCs but also maintain the self-renewal and multi-lineage differentiation more effectively. They are promising in HSC transplantation. Chin Med J 2005; 118(23):1979-1986     

动员人外周造血祖细胞定向诱导树突状细胞

目的 探讨由动员人外周造血祖细胞体外培养扩增获得的树突状细胞（DC）的生物学特性, 为临床应用肿瘤树突状细胞疫苗建立制备方法。方法 用CS-3000血细胞分离机分离预经干细胞动员的患者外周血单个核细胞（PBMC）,去除淋巴细胞和单核细胞,阴性选择得到外周造血祖细胞,加入rhGM-CSF和rhIL-4培养10~14 d成为树突状细胞,然后进行形态学检测、细胞表型和T细胞刺激能力分析。结果 由外周造血祖细胞来源的树突状细胞可以达到(0.5~1.0)×108数量级;高倍镜和电镜照片显示典型的树突状细胞形态和超微结构;流式细胞仪分析显示细胞高表达HLA-Ⅰ、Ⅱ类抗原和共刺激分子CD80、CD86;同种混合淋巴细胞反应显示细胞具有高效的刺激静止T淋巴细胞活化增殖的能力。结论 用血细胞分离机分离动员外周造血祖细胞体外定向诱导制备树突状细胞可以作为制备肿瘤疫苗的新途径。     

SNL细胞作为饲养层细胞培养人胚胎干细胞

目的为便于人胚胎干细胞(ES细胞)的培养和研究,寻找一种建系细胞作为人ES细胞的饲养层细胞。方法以小鼠成纤维细胞系SNL细胞作为饲养层细胞培养人ES细胞株hES1。传代17代后,检测hES细胞表面特异性标志,包括碱性磷酸酶(AKP)、Oct-4、阶段特异性胚胎抗原(SSEA)-3和SSEA-4的表达;同时观察细胞的多向分化潜能。结果hES1细胞在SNL细胞饲养层上能持续生长。经多次传代后持续表达人ES细胞表面特异性标志,其注射于重症联合免疫缺陷小鼠皮下仍能形成畸胎瘤组织。结论SNL细胞能够作为饲养层细胞用于人ES细胞的培养,且操作更方便;该细胞已转染了耐受新霉素的基因,为将来对人ES细胞基因操作时进行药物筛选提供了可能。     

牙周膜干细胞对脐血单个核细胞分化为破骨样细胞的影响

目的研究牙周组织改建过程中,牙周膜干细胞对破骨细胞形成的影响,初步探讨静压力和诱导因子对牙周膜干细胞调控破骨细胞形成的作用机制。方法有限稀释法克隆化培养牙周膜干细胞,密度梯度离心法分离脐血,收集单个核细胞。建立直接共培养和Transwell间接共培养体系。实验分组:A组,对照组(单纯共培养);B组,静压力组,共培养后第2天即对共培养细胞施加120 KPa压力,持续作用1 h后继续培养;C组,诱导因子组,培养液中加入诱导因子1,25二羟基维生素D3(1×10-8mol/L)和前列腺素E2(1×10-6mol/L)。采用倒置相差显微镜及TRAP染色,骨磨片染色等方法检测破骨样细胞(osteoclast-like cells,OLC)的形成及功能。结果各组第3、7天OLC计数比较结果显示,施加静压力后,直接共培养组OLC数量明显多于间接共培养组(P<0.01);而诱导因子组,直接共培养组OLC少于间接共培养组(P<0.01)。结论牙周膜干细胞能够促进脐血单个核细胞分化为破骨样细胞,且在静压力作用下,两种细胞直接接触时,这种调控作用更为明显。     

体外定向诱导胚胎干细胞分化为内皮细胞及其与脐静脉内皮细胞的比较

目的：研究干细胞定向分化为内皮细胞的效率,并与人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)比较。方法：用两步法诱导干细胞HUES9分化为内皮细胞,前3 d在N2B27培养基中加入骨形态发生蛋白4 (25 ng/mL)和肝糖原合成激酶3β受体的选择性抑制剂CHIR99021(10 μmol/L)使细胞分化到中胚层状态,第4天开始用 VEGF165(200 ng/mL)和Forskolin(2 μmol/L)将细胞诱导为内皮细胞。观察分化第6天细胞形态,并与HUVECs比较。用 CD144作为内皮细胞表面标志物,流式细胞术检测分化效率及分化后细胞的身份。比较两种内皮细胞迁移和成管能 力。结果：分化后的内皮细胞与HUVECs在显微镜下形态一致。分化细胞表面标志物阳性率达到73.4%,重新培养后 的内皮细胞表面CD144阳性率达到86.6%,HUVECs为94.4%。分化后的内皮细胞与HUVECs均具有良好的迁移和成管 能力,但分化后的内皮细胞能力不如HUVECs强。运用SB431542后,能够提高分化后内皮细胞的迁移和成管能力。 结论：此两步法将干细胞分化为内皮细胞有较高的分化效率,可作为理想的分化方法。     

肝干细胞--肝卵圆细胞的研究进展

对于肝卵圆细胞的研究已有一定时间，但近几年才明确其属于干细胞范畴，笔者简要综述了肝卵圆细胞的特征、来源、调控分化及与肝病的关系。     

以表皮干细胞与HaCaT细胞为种子细胞构建组织工程皮肤的比较研究

目的 比较人表皮干细胞(epidermal stem cells,ESCs)与人永生化角质细胞HaCaT作为种子细胞构建组织工程皮肤的差异.方法 Ⅳ型胶原快速黏附法分选表皮干细胞,无血清培养基DK-SFM培养,取第2代备用;应用DK-SFM培养HacaT细胞,取对数生长期的细胞备用;利用组织工程技术构建真皮等价物(dermal equivalent);将上述备用的两种种子细胞分别接种在真皮替代物的表面,构建组织工程皮肤,先后进行浸没培养和气-液面器官型培养,从形态学、物理特性、HE染色等方面观察比较培养物的差异.结果 以ESCs构建的组织工程皮肤收缩快,分层分化近似于正常皮肤,具有较好的张力和韧性.以HaCaT细胞构建的组织工程皮肤分层少,生长慢,张力韧性较差.两种皮肤的直径都随培养时间的增加而缩短,且在3～7 d各检测时相点间有显著性差异(P＜0.05).结论 ESCs比永生化的HaCaT细胞更适合作为种子细胞构建组织工程皮肤.     

人胚胎原生殖细胞中胚胎干细胞的分离培养

目的：探讨人胚胎原生殖细胞分离培养的条件及在体内、外的分化能力．方法：从5～9wk人胚胎生殖嵴中消化分离原生殖细胞(PGC），将其置于饲养层上培养，采用大鼠心肌细胞条件培养基(RH-CM)，改变了常规使用添加白血病抑制因子(LIF)的培养液．结果：成功地完成了对PGC的第4代培养；经过培养形成的克隆以及克隆的生长方式基本符合胚胎干细胞(ES)的特性：AP染色呈阳性；体外分化实验显示此细胞具有发育多能性；悬浮培养时能够自然分化成类胚体(EB)．结论：离散生殖嵴和增殖的。PGC克隆的时机和方法是影响建系的关键；PMEF和HEF对人PGC克隆的影响无显差异；添加RH-CM可有效抑制PGC的分化。     

特异性抗原致敏的DC-CIK与DC-CTL细胞对黑色素瘤抑瘤作用的比较

目的：比较特异性抗原致敏的树突状细胞（DC）诱导的杀伤细胞（CIK）和细胞毒性T淋巴细胞（CTL）对B16黑色素瘤的抑瘤作用。方法：采用特异性肿瘤抗原致敏的DC与CIK和CTL细胞共同培养,分析其免疫表型,流式细胞检测癌细胞增殖周期中G0/G1期、S期、G2/M期细胞比率和细胞凋亡指数（AI）、细胞增殖指数（PI）的变化;并用MTT法检测其对肿瘤细胞的抑瘤作用。结果：DC-CIK及DC-CTL均可以影响肿瘤细胞的细胞周期,并具有诱导细胞凋亡的作用,但DC-CIK与DC-CTL之间无显著性差异;DC-CTL细胞组抑瘤作用较DC-CIK明显升高。结论：特异性抗原致敏的DC-CIK与DC-CTL细胞对B16黑色素瘤均有抑瘤作用,但DC-CTL更高效而特异。