大鼠成体肝卵圆细胞分离培养及诱导分化的初步研究

目的 通过成体大鼠肝卵圆细胞分离培养获取纯净的干细胞并观察诱导分化前后从肝卵圆细胞到肝细胞的形态变化.方法 采用AAF/PH肝干细胞刺激模型,胶原酶Ⅳ消化分离和Percoll梯度离心纯化肝卵圆细胞的方法,用地塞米松、DMSO和EGF、HGF、SCF、LIF等生长因子联合应用诱导肝卵圆细胞增殖和分化为肝实质细胞.观察肝卵圆细胞到肝细胞形态变化过程,用免疫荧光技术,Western blotting分析检测了干细胞标志c-kit和RT-PCR分析法检测肝干细胞白蛋白和CK19 mRNA表达鉴定卵圆细胞.结果 分离得到的肝卵圆细胞活度达到90%,细胞形态包括大小和颜色呈不均质,卵圆细胞直径是肝细胞直径的1/4～1/6.诱导后出现大而圆的肝细胞,可见卵圆细胞到肝细胞的中间变化过程,新分离的肝卵圆细胞在生长因子诱导下有向肝细胞分化的特性.经c-kit免疫荧光染色显黄绿色荧光,Western blotting检测肝卵圆细胞有c-kit蛋白条带,而大鼠肝细胞及胆管细胞则未出现条带.PCR分析显示卵圆细胞有CK19和白蛋白mRNA表达.结论 新分离的肝卵圆细胞同时表达c-kit,CK19和白蛋白3种抗原,诱导分化出现一系列从卵圆细胞到肝细胞的形态学变化,这种现象证明分离的肝卵圆细胞就是肝干细胞,经诱导分化可以产生成熟的肝细胞,成为进一步研究肝干细胞生物学特性的基础.     

2-乙酰氨基芴对大鼠肝卵圆细胞增殖模型的影响

目的 在建立大鼠肝卵圆细胞增殖模型的基础上，进一步研究2—乙酰氨基芴(AAF)对大鼠肝卵圆细胞增殖的影响。方法 按本室建立和改进的方案建立大鼠肝卵圆细胞增殖模型，AAF剂量分别按10、20及25mg/kg给予，同时设单纯切肝对照组、假手术对照组及生理盐水对照组，重点观察大鼠肝组织结构变化及不同剂量下肝卵圆细胞增殖情况。结果 3个对照组大鼠肝组织内均未见到肝卵圆细胞，而3个实验组均见肝卵圆细胞增生；与10mg/kg剂量组比较，20mg/kg及25mg/kg两个剂量组大鼠肝组织内的肝卵圆细胞增殖更加明显，但25mg/kg剂量组大鼠死亡率较高，存活大鼠健康状况差。结论 AAF可诱导大鼠肝卵圆细胞增殖，剂量以20mg/kg较为理想。     

化学致癌剂3''''-甲基-4-DAB影响巢蛋白Nestin在SD大鼠肝卵圆细胞中的表达

目的：采用免疫组化方法标记大鼠肝卵圆细胞中巢蛋白Nesin的表达，探讨肝卵圆细胞新的表面标记蛋白。方法：用化学致癌剂3’-甲基4-二甲基氨偶氮苯(3’-Methy-4-dimethylaminoazobenzen，3’-me-DAB)喂养SD大鼠4周，取大鼠肝脏，用免疫组化法标记神经前体细胞的特异性表面标记物巢蛋白Nestin在大鼠肝卵圆细胞中的表达。结果：汇管区靠近界板处卵圆细胞表达Nestin阳性，Nestin阳性细胞成簇状分布或呈双层排列成管状，主要集中在赫令氏管周围并见Nestin阳性细胞向肝小叶内迁移，散在分布于肝细胞索。结论：大鼠肝内存在Nestin表达阳性的卵圆细胞，Nestin可能是肝卵圆细胞新的标记蛋白。     

三七总皂甙对大鼠肝卵圆细胞增殖肝脏CX/GJIC的影响

目的研究三七总皂甙（Panax notoginoside，PNS）对大鼠肝卵圆细胞增殖模型肝脏缝隙连接蛋白（connexin，CX）表达及其介导的缝隙连接细胞间通讯（gap junction intercellular communication，GJIC）的影响。方法选择体重150g左右的雄性Wistar大鼠，随机分为对照组、模型组和PNS组。采用2-AAF／PH方法（2-acetylamin-ofluorene＋two thirds partial hepatectomy）建立肝卵圆细胞增殖模型，切开标记／染料示踪技术（incision loading／dye transfer，IL／DT）检测肝脏GJIC，免疫组织化学法检测CX32、43的表达和计数肝卵圆细胞，并观察PNS腹内注射后的表达变化。结果（1）对照组未见肝卵圆细胞，PNS组、模型组肝卵圆细胞增殖明显；PNS组与模型组相比，卵圆细胞增殖高峰低、持续时间长。（2）各组CX32和GJIC的表达：模型组与PNS组均低于对照组，表达峰呈先下调后逐渐恢复趋势，PNS组高于模型组。（3）各组CX43的表达：模型组与PNS组均高于对照组，表达峰呈先升高后逐渐恢复与肝卵圆细胞的增殖趋势一致，PNS组与模型组相比表达高峰滞后。结论2-AAF／PH是理想的肝卵圆细胞增殖模型；CX32和GJIC的下调可动员肝卵圆细胞，CX43可促进其增殖，CX／GJIC对肝卵圆细胞增殖有重要的调控作用；PNS可通过影响CX／GJIC的表达，调节肝卵圆细胞的增殖过程。     

肝卵圆细胞与原发性肝癌的相关性研究

目的:探讨肝卵圆细胞与原发性肝癌的相关性,为原发性肝癌发生的"癌干细胞"假说提供临床病理学依据。方法:运用免疫组化方法检测不同肝病组(检测对照组、肝血管瘤组、良性肝病合并肝硬化组、肝癌组、肝癌合并肝硬化组)肝脏组织中表达Ck-7、Ck-8/18、Ck-19、C-kit、AFP肝卵圆细胞数。结果:Ck-7、Ck-8/18、Ck-19阳性的肝卵圆细胞在上述各检测组中均有表达,AFP阳性的肝卵圆细胞仅在肝癌组中表达。各组间表达的Ck-7、Ck-8/18、Ck-19、C-kit、AFP阳性的肝卵圆细胞数目随病变由良性疾病向恶性疾病变化而增加。肝癌组、肝癌合并肝硬化组间表达的C-kit阳性的肝卵圆细胞数有显著性差异(P<0.05)。结论:肝卵圆细胞参与了原发性肝癌的生长、细胞分化调控。     

大鼠肝卵圆细胞增殖模型建立及其纯化鉴定

为建立大鼠卵圆细胞增殖模型，分离纯化卵圆细胞并对其特性进行研究，SD大鼠喂饲2-乙酰氨基芴(2-acetyailamif1uorene，2-AAF)，剂量分别为5、10、15、20mg／kg，连续给药6d，于第7天行三分之二部分肝切除，术后继续给药1周，每隔3d取肝组织行常规组织学观察，作细胞增殖试验及免疫组化染色。通过免疫磁珠标记C-kit阳性细胞以纯化卵圆细胞(Magnetic activated cell sorting，MACS)，用免疫细胞化学及RT-PCR对纯化细胞进行鉴定。结果：10、15、20mg／kg三种剂量2-AAF均可成功建立卵圆细胞增殖模型，卵圆细胞增殖于第8天较明显，至第11天达高峰，第14天有所减少。卵圆细胞胞核Brdu染色阳性，其除表达卵圆细胞特异性抗原OV6外，尚表达肝细胞标记白蛋白及胆管细胞标记CKl9。胚胎期肝细胞抗原AFP、连接蛋白43在卵圆细胞中亦有高表达，同时还表达造血干细胞标记C-kit。以MACS纯化的C-kit阳性卵圆细胞，90％以上为OV6阳性，并有AFP、白蛋白、CK19 mRNA转录。结论：2-AAF剂量为10～20mg／kg时可获得满意的大鼠卵圆细胞增殖模型，增生的卵圆细胞为具有双向分化潜能的肝干细胞／前体细胞，利用C-kit标记通过MACS可纯化这种肝干细胞／前体细胞。     

大鼠肝卵圆细胞的增殖模型建立和体外分离培养、诱导分化研究

目的 建立大鼠肝卵圆细胞(HOC)的增殖模型,探讨分离培养及鉴定HOC的方法.方法 采用2-乙酰氨基芴/部分肝切除术刺激建立成体大鼠肝卵圆细胞增殖模型,于肝切除术后第12天切取剩余肝脏,使用胶原酶Ⅳ消化分离和Percoll梯度离心纯化肝卵圆细胞,免疫荧光技术和KT-PCK分析法检测肝卵圆细胞标志物mRNA表达.行体外培养并添加干细胞生长因子(SCF)、肝细胞生长因子(HGF)和表皮生长因子(EGF)诱导其分化.结果 分离得到的肝卵圆细胞存活率达到90%,经c-kit免疫荧光显色,PCR 分析显示有CK19和白蛋白mRNA表达.生长因子诱导下有向胆管细胞和肝细胞分化的特性.结论 肝卵圆细胞分离纯化及鉴定方法和肝卵圆细胞成功培养,为进一步研究肝干细胞生物学特性和与肝癌的关系提供了物质基础.     

HBV所致终末期肝病患者肝组织胆管增生的免疫组织化学研究

目的在乙型肝炎病毒（HBV）所致的终末期肝病患者肝组织内，常可见大量的胆管增生，但其发生机制及临床意义尚不清楚。为阐明该类患者胆管增生的发生机制及其与卵圆细胞增生及肝细胞再生的关系，我们对8例HBV相关的终末期肝病患者及2例正常人肝组织进行了免疫组化染色及图像分析。方法肝组织连续切片后进行免疫组化染色。观察指标为细胞角蛋白（CK）7、CK8、CK19、OV6、增殖细胞核抗原（PC—NA）、甲胎蛋白（AFP）及白蛋白（ALB）。结果在所有8例惠者肝组织汇管区内均可见典型增生的胆管及非典型增生的胆管，且对CK7、CKB、CK19、OV6及PCNA染色呈阳性反应，但两种类型的胆管在染色强度上存在明显差异。一些非典型增生的胆管细胞表现出肝卵圆细胞的形态学及免疫组化特征。某些小型肝细胞样细胞在形态及免疫组化特征方面介于肝卵圆细胞及成熟肝细胞之间。结论在t-IBV相关的终末期肝病患者肝组织内，胆管增生可能存在不同起源。某些非典型增生的胆管细胞实际上就是活化的肝卵圆细胞。非典型增生的胆管细胞与肝细胞再生密切相关。小型肝细胞样细胞可能是肝卵圆细胞与成熟肝细胞之间的中间过渡细胞。     

肝干细胞的研究进展

肝干细胞研究近年来已取得重要进展 ,肝干细胞的存在目前趋于肯定。肝干细胞分为肝源性和非肝源性两类。前者包括胆管源性卵圆细胞和分化肝细胞 ;后者包括胚胎干细胞 (ＥＳ细胞 )、骨髓 /血液干细胞及胰腺上皮细胞等。1　肝干细胞与肝脏生长、发育及再生成熟肝细胞和肝内胆小管细胞均系原始肝细胞(ｐｒｉｍｉｔｉｖｅｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓ)生成。目前认为 ,肝再生通常通过处于增生静止期的分化肝细胞进入细胞周期完成。如果这一途径出现缺陷 ,胆管上皮细胞可从门脉汇管区移出并分化成肝细胞。这种胆管上皮细胞被称为卵圆细胞 (ｏｖａｌｃ…     

大鼠肝卵圆细胞向肝癌细胞分化过程中microRNA的变化

目的利用生物芯片技术分析大鼠肝卵圆细胞分化为肝癌细胞过程中微小RNA(microRNA,miRNA)的表达变化,筛选调控分化的microRNAs,探讨肝癌发生的起源机制。方法用化学致癌剂3’-Me-DAB诱发SD大鼠肝卵圆细胞增生,采用密度梯度离心法分离、纯化肝卵圆细胞,行体外培养使其恶性分化并进行鉴定。提取分化过程中的microRNA进行microRNA基因芯片杂交,获得卵原细胞恶性分化过程中microRNA表达谱。同时利用种植模型及大鼠Y染色体特异性PCR技术,验证卵圆细胞可恶性分化为肝癌细胞。结果①激光扫描共聚焦显微镜显示,肝卵圆细胞胞浆和胞膜表达干细胞标志Thy-1及C-kit;②通过基因微阵列分析,卵原细胞恶性分化过程中有22个miRNA的改变显著,其中19个表达上调,3个表达下调;③卵原细胞种植模型的大鼠肝癌组织具有SRY基因的电泳条带。结论特定microRNA可能对大鼠肝卵圆细胞分化为肝癌细胞过程起到关键作用。     

大鼠肝脏卵圆细胞干细胞特性的研究

目的探讨大鼠肝脏卵圆细胞体外培养扩增及其干细胞特征。方法采用2-乙酰氨基芴/四氯化碳方法建模,胶原酶灌流和流式细胞术分选纯化卵圆细胞,进行培养和扩增。透射电子显微镜观察肝脏卵圆细胞的超微结构,免疫细胞化学法检测干细胞标志物OV-6、c-kit和Thy-1.1的表达;RT-PCR法检测卵圆细胞内c-kit、肝细胞标志物(HNF-4α、AFP)和胆管细胞标志物(CK-7、CK-19)的基因表达;Western blotting法检测OV-6和AFP蛋白的表达。结果大鼠肝脏组织可见明显的卵圆细胞增生,成簇分布,逐渐向肝实质内延伸。细胞体外培养可达40 d以上,细胞体积较小,多呈圆形和卵圆形。透射电子显微镜下可见细胞直径5～10μm,细胞核大,胞质少,核/质比例大,细胞器少,仅见少量线粒体和内质网。免疫细胞化学检测显示,细胞表面OV-6、c-kit和Thy-1.1染色阳性;RT-PCR检测显示,卵圆细胞内有c-kit、HNF-4α、AFP、CK-7和CK-19基因表达;Western blotting检测显示,OV-6蛋白持续表达,AFP蛋白表达逐渐增强。结论大鼠肝脏卵圆细胞体外可大量扩增并且保留其干细胞和双向分化潜...     

神经中间丝蛋白Nestin在胎肝中的表达

目的 采用免疫组织化学方法标记不同发育时期人胚胎肝干细胞中巢蛋白(Nestin)的表达,探讨肝干细胞新的表面标志蛋白。方法 取材不同发育时期胎儿肝脏,固定并制成石蜡切片,ABC法标记神经前体细胞的特异性表面标记Nestin在胎肝干细胞中的表达。结果 汇管区周边界板处卵圆样干细胞表达Nestin阳性,Nestin阳性细胞呈单层紧密排列成管,呈鞘样包绕着早期汇管区,部分包绕着初级汇管区,随着次级汇管区的成熟,Nestin阳性卵圆样干细胞逐渐局限于赫令管周围;此外胚胎发育不同时期可见Nestin阳性单个核样细胞散布在肝实质内。结论 肝脏内有Nestin表达阳性的干细胞存在,其功能、来源需要进一步深入研究。     

肝卵圆细胞及其定向诱导分化为胰岛细胞的相关研究

胰岛细胞移植是治愈糖尿病的可能方法,但胰岛细胞数量有限,不能满足临床需要。肝卵圆细胞可以在体外诱导分化为胰岛细胞,因此可以作为胰岛细胞潜在的替代资源。文章就肝卵圆细胞及其定向诱导分化为胰岛细胞的相关研究作一综述。     

肝卵圆细胞及其定向诱导分化为胰岛细胞的相关研究

胰岛细胞移植是治愈糖尿病的可能方法 ,但胰岛细胞数量有限,不能满足临床需要. 肝卵圆细胞可以在体外诱导分化为胰岛细胞,因此可以作为胰岛细胞潜在的替代资源.文章就肝卵圆细胞及其定向诱导分化为胰岛细胞的相关研究作一综述.     

不同品系大鼠肝脏卵圆细胞增殖模型的比较研究

目的 对不同品系大鼠肝卵圆细胞增殖模型进行比较,筛选建模效率较高的大鼠品系.方法 选择F344、Wistar和SD大鼠各10只,经2-乙酰氨基芴灌胃和四氯化碳腹腔注射建立肝脏卵圆细胞增殖模型,组织学和免疫组织化学检测鉴定.荧光激活细胞筛选法分选并纯化各品系大鼠肝脏卵圆细胞,分析Thy-1.1~+细胞百分率,观察Thy-1.1~+细胞培养结果.结果 成功建立三种品系大鼠肝脏卵圆细胞增殖模型.流式细胞仪分选结果显示,F344、wistar和SD大鼠Thy-1.1~+细胞百分率分别为(9.46±0.99)%、(2.46±0.37)%和(1.46±0.12)%;各品系大鼠间Thy-1.1~+细胞百分率比较,差异有统计学意义(P<0.05).细胞培养观察发现,与Wistar和SD大鼠比较,F344大鼠分选得到的肝脏卵圆细胞生长状态好且纯度较高.结论 在用于建立肝脏卵圆细胞增殖模型最为常见的三种品系大鼠中,F344大鼠所建模型的肝脏卵圆细胞活化效率最高.     

不同品系大鼠肝脏卵圆细胞增殖模型的比较研究

目的 对不同品系大鼠肝卵圆细胞增殖模型进行比较,筛选建模效率较高的大鼠品系.方法 选择F344、Wistar和SD大鼠各10只,经2-乙酰氨基芴灌胃和四氯化碳腹腔注射建立肝脏卵圆细胞增殖模型,组织学和免疫组织化学检测鉴定.荧光激活细胞筛选法分选并纯化各品系大鼠肝脏卵圆细胞,分析Thy-1.1~＋细胞百分率,观察Thy-1.1~＋细胞培养结果.结果 成功建立三种品系大鼠肝脏卵圆细胞增殖模型.流式细胞仪分选结果显示,F344、wistar和SD大鼠Thy-1.1~＋细胞百分率分别为（9.46±0.99）%、（2.46±0.37）%和（1.46±0.12）%;各品系大鼠间Thy-1.1~＋细胞百分率比较,差异有统计学意义（P〈0.05）.细胞培养观察发现,与Wistar和SD大鼠比较,F344大鼠分选得到的肝脏卵圆细胞生长状态好且纯度较高.结论 在用于建立肝脏卵圆细胞增殖模型最为常见的三种品系大鼠中,F344大鼠所建模型的肝脏卵圆细胞活化效率最高.     

Mouse A6-positive Hepatic Oval Cells Derived from Embryonic Stem Cells简

Summary： Oval cells have a potential to differentiate into a variety of cell lineages including hepatocytes and biliary epithelia. Several models have been established to activate the oval cells by incorporating a variety of toxins and carcinogens, alone or combined with surgical treatment. Those models are obviously not suitable for the study on human hepatic oval cells. It is necessary to establish a new and efficient model to study the human hepatic oval cells. In this study, the hepatocyte growth factor（HGF） and epidermal growth factor（EGF） were used to induce differentiation of mouse embryonic stem（ES） cells into hepatic oval cells. We first confirmed that hepatic oval cells derived from ES cells, which are bipotential, do exist during the course of mouse ES cells＇ differentiation into hepatic parenchymal cells. RT-PCR and transmission electron microscopy were applied in this study. The ratio of Sca-1＋/CD34＋ cells sorted by FACS in the induction group was increased from day 4 and reached the maximum on the day 8, whereas that in the control group remained at a low level. The differentiation ratio of Sca-1＋/CD34＋ cells in the induction group was significantly higher than that in the control group. About 92.48% of the sorted Sca-1＋/CD34＋ cells on the day 8 were A6 positive. Highly purified A6＋/Sca-1＋/CD34＋ hepatic oval cells derived from ES cells could be obtained by FACS. The differentiation ratio of hepatic oval cells in the induction group（up to 4.46%） was significantly higher than that in the control group. The number of hepatic oval cells could be increased significantly by HGF and EGF. The study also examined the ultrastructures of ES-derived hepatic oval cells＇ membrane surface by atomic force microscopy. The ES-derived hepatic oval cells cultured and sorted by our protocols may be available for the future clinical application.     

神经中间丝蛋白Nestin在胎肝中的表达

目的 采用免疫组织化学方法标记不同发育时期人胚胎肝干细胞中巢蛋白(Nestin)的表达，探讨肝干细胞新的表面标志蛋白。方法 取材不同发育时期胎儿肝脏，固定并制成石蜡切片，ABC法标记神经前体细胞的特异性表面标记Nestin在胎肝干细胞中的表达。结果 汇管区周边界板处卵圆样干细胞表达Nestin阳性，Nestin阳性细胞呈单层紧密排列成管，呈鞘样包绕着早期汇管区，部分包绕着初级汇管区，随着次级汇管区的成熟，Nestin阳性卵圆样干细胞逐渐局限于赫令管周围；此外胚胎发育不同时期可见Nestin阳性单个核样细胞散布在肝实质内。结论 肝脏内有Nestin表达阳性的干细胞存在，其功能、来源需要进一步深入研究。