Periodontal ligament stem cells improve peripheral blood mononuclear cells differentiation into osteoclast-like cells

目的 研究牙周组织改建过程中,牙周膜干细胞对破骨细胞形成的影响,初步探讨静压力和诱导因子对牙周膜干细胞调控破骨细胞形成的作用机制.方法 有限稀释法克隆化培养牙周膜干细胞,密度梯度离心法分离脐血,收集单个核细胞.建立直接共培养和Transwell间接共培养体系.实验分组:A组,对照组(单纯共培养);B组,静压力组,共培养后第2天即对共培养细胞施加120 KPa压力,持续作用1h后继续培养;C组,诱导因子组,培养液中加入诱导因子1,25二羟基维生素D3(1 ×10-8 mol/L)和前列腺素E2(1×10-6 mol/L).采用倒置相差显微镜及TRAP染色,骨磨片染色等方法检测破骨样细胞( osteoclast-like cells,OLC)的形成及功能.结果 各组第3、7天OLC计数比较结果显示,施加静压力后,直接共培养组OLC数量明显多于间接共培养组(P＜0.01);而诱导因子组,直接共培养组OLC少于间接共培养组(P＜0-01).结论 牙周膜干细胞能够促进脐血单个核细胞分化为破骨样细胞,且在静压力作用下,两种细胞直接接触时,这种调控作用更为明显.     

诱导法与机械法体外培养破骨细胞的比较研究

目的 探讨不同方法培养的破骨细胞(OC)在形态学及骨吸收功能的差异,为体外培养OC提供方法学实验依据.方法 采用机械分离的方法,即从1d龄SD大鼠四肢长骨机械分离获得成熟OC;诱导法,即利用RANKL(100 ng/mL)和M-CSF(100 ng/mL)诱导RAW264.7细胞形成破骨样细胞(OLC).对获得的OC和OLC进行形态学和骨吸收功能观察比较.结果 OC和OLC均为TRAP染色阳性的多核巨细胞,与细胞共培养骨片上可形成骨吸收陷窝;与机械分离法比较,诱导法培养出的OLC数目较多,但骨吸收陷窝较小而浅.结论 直接分离培养法可获得骨吸收功能较活跃的OC,但数目较少,适合骨吸收功能分析、破骨迁移黏附、凋亡研究及单细胞分子生物学研究.诱导形成的OLC数量较多,但骨吸收功能较差,适合用于OC分化发育过程的研究.     

两种不同细胞培养方法对破骨细胞分化及Notch2基因表达的影响

目的:探讨两种不同培养方法对体外破骨细胞分化的影响,分析破骨细胞分化过程中的关键信号Notch2分子的mRNA和蛋白表达水平的差异,为进一步破骨细胞功能实验奠定基础。方法:单独培养:从4周龄的小鼠腿骨骨髓腔分离骨髓细胞,巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)和破骨细胞生成因子(RANKL)诱导大鼠骨髓细胞形成破骨细胞;共培养:从4周龄的小鼠大腿骨骨髓腔分离骨髓细胞,与原代成骨细胞共培养,VitD3和前列腺素E2(PGE2)诱导。对获得的破骨细胞进行抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrate resistant acid phosphatase,TRAP)染色和细胞计数,并测定破骨细胞分化过程中的关键信号Notch2分子的mRNA和蛋白表达水平。结果:两种培养方法获得的破骨细胞均为TRAP染色阳性的多核巨细胞;共培养方法得到的破骨细胞数目为(240±36)个/孔,而单独培养法为(160±23)个/孔。共培养组Notch2分子mRNA表达水平为4.1±1.2,单独培养组为2.4±0.6,共培养组高于单独培养组(P<0.05),共培养组Notch2蛋白表达水平亦高于单独培养组。结论:与通过RANKL和M-CSF诱导破骨细胞分化的培养方法相比,利用成骨细胞和破骨前体共培养可诱导出更多的破骨细胞和高水平的Notch2表达。培养方法影响破骨细胞的数量和Notch2基因的表达水平。     

改良的成年大鼠骨髓源性破骨细胞诱导培养体系

为在短时间内获得更多的破骨细胞,在近几年国内成年大鼠骨髓源性破骨样细胞培养的基础上加以改良,以建立一个简便、有效的诱导培养体系.收集3月龄SD大鼠股骨骨髓细胞悬液,置入含有20%胎牛血清、1,25(OH)2VitD3的培养液中.将培养体系分为4组A组为对照组,未加入粒细胞/巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和地塞米松(Dexamethasone);B组加入GM-CSF;C组加入Dexamethasone;D组加入GM-CSF和Dexamethasone,观察各组破骨样细胞(osteoclast-like cell,OLC)及骨陷窝形成情况,并计数比较.培养第6 d,便可见所培养细胞衍变为形态不规则、有伪足形成的多核巨细胞,抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色(+),且具有骨吸收作用,符合破骨细胞的鉴定标准.D组所形成OLC及骨陷窝数目较其它3组明显增多(P＜0.01),且OLC出现较早.结果表明成功地建立了一个以1,25(OH)2VitD3、GM-CSF、Dexamethasone为诱导分化条件的培养体系.所获得破骨细胞数量多,特征明显,且培养所需时间短.     

脐血单核细胞向破骨细胞诱导分化的实验研究

目的　脐血单核细胞向破骨细胞诱导分化的可行性研究。方法　分离脐血中单核细胞经1×10 -8mol/L 1,2 5 (OH) 2 D3 诱导培养,采用倒置相差显微镜观察细胞形态变化、组化染色和吸收陷窝观察技术分析细胞的抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrate resistantacidphosphatase ,TRAP)表达和骨吸收活性。结果　脐血单核细胞在1,2 5 (OH) 2 D3 作用下分化加速,表现为长梭形和类圆形细胞的增多、增大,体外诱导培养13d ,有多核TRAP阳性细胞产生,但未表现出骨吸收功能。结论　脐血单核细胞经1,2 5 (OH) 2 D3 体外诱导培养后可表现骨细胞的早期特征。     

类风湿关节炎患者外周血单核细胞诱导转分化为破骨样细胞

目的 建立类风湿关节炎(RA)患者外周血单核细胞(PBMCs)转分化的培养体系,并对所培养的破骨样细胞(OLC)进行鉴定.方法 抽取RA患者外周静脉血,密度梯度离心法获得PBMCs,分别接种于玻片和骨磨片.随机分为单核细胞集落刺激因子(M-CSF)组(A组),加入25μg/L M-CSF;协同作用组(B组),分别加入不同浓度的核因子κB受体活化子配体(RANKL),5、10、20、25、50μg/L)和25μg/L M-CSF.培养至4、12和20 d时,取玻片行HE染色和抗酒石酸磷酸酶染色计数OLC,取骨磨片行甲苯胺兰染色检测OLC骨吸收活性.结果 对OLC转分化的影响:各组细胞分别于4、12、20 d染色,显示RANKL呈浓度及时间依赖性诱导OLC形成(P<0.05).对OLC骨吸收活性的影响:RANKL和M-CSF协同诱导骨磨片上吸收陷窝的形成,RANKL呈浓度及时间依赖性增强OLC的吸收活性(P<0.05);单独M-CSF刺激不能形成骨吸收陷窝.结论 RANKL和M-CSF可协同诱导RA患者PBMCs转分化为OLC,该培养方法稳定、有效,具有可重复性.     

两种不同培养方法对破骨细胞ATPase a3基因表达和骨吸收活性的影响

[目的]探讨不同方法培养下的大鼠破骨细胞（osteoclast,OC）骨吸收功能的差异,以及骨吸收关键基因ATPasea3的mR—NA表达水平的差异,为体外实验奠定基础。[方法]机械分离和诱导培养,即从新生24h的大鼠长干骨骨髓腔内壁机械分离成熟OC和1,25（OH）2D3诱导大鼠骨髓细胞形成破骨样细胞（osteoclast like cell,OLC）,对获得的OC进行形态和骨吸收功能观察,并测定OC骨吸收关键基因ATPasea3的mRNA表达水平的差异。[结果]OC和OLC均为抗酒石酸酸性磷酸酶（tartrate resistant acid phosphatase,TRAP）染色阳性的多核巨细胞,与细胞共培养骨片上可形成骨吸收陷窝;诱导法培养出的OLC数目多于机械分离法,但诱导早期陷窝较之小而浅,诱导后期基本接近OC;OC骨吸收关键基因ATPase a3的mRNA,在机械分离8h与诱导培养6天的细胞表达量无显著差异,但都远少于培养8天的表达量。[结论]诱导法可以培育出大量的OLC,优于机械分离法,但早期骨吸收功能较弱,OC骨吸收功能与其核数相关。后期的OCL与机械分离OC接近,可以用于各类实验。     

骨保护素及其配体在牙正畸中作用的研究进展

骨保护素(OPG)是生理性的抑制破骨细胞性骨吸收的因子,而骨保护素配体(OPGL)是能直接诱导破骨细胞分化发育并参与破骨细胞功能调节的细胞因子。牙周膜细胞可表达OPG和OPGL,揭示了在正畸牙移动中,牙周膜细胞可能是通过OPG/OPGL系统来调节牙槽骨代谢的。OPG和OPGL在多种骨病和牙正畸的治疗中具有很大潜力,具有良好的临床应用前景。     

RANKL联合M-CSF体外诱导人外周血单个核细胞成为破骨样细胞的研究

目的 体外诱导人外周血单个核细胞成为破骨样细胞.方法 从人外周血以密度梯度离心法分离出单个核细胞贴壁培养后分为3组.A组:使用核因子NF-κB受体激活剂配体(RANKL)联合巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)进行诱导;B组:仅使用M-CSF进行诱导;C组:仅使用RANKL进行诱导.14 d后使用抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色法以及扫描电镜观察骨片以鉴定细胞是否具有破骨细胞的特征.结果 A组14 d时出现较多的多核TRAP染色阳性的细胞,数量为(476±47)个,较B组(54±18)个明显增加(P<0.05),C组不能诱导出TRAP染色阳性细胞.A组诱导生成的细胞具有在骨片上形成骨吸收陷窝的能力,B组骨片上均没有发现明显的骨吸收陷窝.结论 从人外周血单个核细胞中可以诱导出破骨样细胞,RANKL和M-CSF是诱导过程中所需要的两个重要因子.     

颌骨骨髓基质细胞对牙周膜细胞生物学特性的影响

目的观察间接共培养犬颌骨骨髓基质细胞(canine maxillary bone marrow stromal cells, cM-BMSCs)对犬牙周膜细胞(canine periodontal ligament cells, cPDLCs)生物学特性的影响。方法 原代培养犬颌骨骨髓基质细胞和犬牙周膜细胞。MTT法检测犬牙周膜细胞增殖速率;利用Transwell结构建立犬颌骨骨髓基质细胞与犬牙周膜细胞共培养体系;qPCR法检测犬牙周膜细胞矿化相关基因核心结合因子2(Runx2)、碱性磷酸酶(ALP)、骨钙素(OCN)的变化;Western印迹法检测Runx2和OCN蛋白的表达变化。构建牙片/细胞膜片复合体植入裸鼠皮下。结果 两种细胞体外均贴壁生长,呈纺锤状外形;颌骨骨髓基质细胞间接共培养下对牙周膜细胞增殖有抑制作用;共培养组牙周膜细胞ALP活性高于对照组;qPCR和Western印迹法均能检测到牙周膜细胞Runx2、OCN的表达,共培养组牙周膜细胞的Runx2和OCN的表达均高于对照组。经过颌骨骨髓基质细胞条件培养液诱导后的牙周膜细胞与牙本质片复合形成了排列更加有序的牙周膜/牙骨质样结构,单纯的牙周膜细胞膜片不能新生类似的牙周组织复合结构。结论犬颌骨骨髓基质细胞间接共培养情况下可能会限制牙周膜细胞的增殖,促进牙周膜细胞向成骨样细胞分化。     

骨片上培养的破骨细胞样细胞及其细胞器对成骨细胞影响的实验研究

目的探讨骨片上培养的破骨细胞及其亚细胞结构对成骨细胞生长和功能的影响。方法C57雌性小鼠,经尾静脉注射5氟尿嘧啶(5FU)后,取其脾脏细胞,在白细胞介素(IL)3、6和粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GMCSF)、1α,25(OH)2D3的诱导下获得大量的破骨细胞样细胞(OLC)。OLC在牛皮质骨骨片上培养即获得骨片上的OLC。NaF、两种OLC、离心去除OLC的培养基及其亚细胞结构———细胞核、线粒体与成骨细胞共培养5d后,检测成骨细胞增殖、碱性磷酸酶和骨钙素含量以及Cbfα1的表达活性。结果两种OLC的细胞质和离心去除OLC后的培养基虽然不能促进成骨细胞数量的增多,但可显著增加骨钙素和碱性磷酸酶的比活性以及Cbfα1蛋白质水平的表达(P<0.05);并且以骨片上生长的OLC细胞质和培养基的作用更大。其中,OLC细胞质(0.1100±0.0007)、50%骨片上培养的OLC培养基(0.1200±0.0041)和骨片上培养的OLC细胞质(0.1550±0.0065)对成骨细胞骨钙素比活性的促进作用显著大于10μmol/L的NaF(0.0825±0.0025,P<0.05);OLC细胞质(1.850±0.033)、50%OLC培养基(2.074±0.065)、骨片上培养的OLC细胞质(1.246±0.037)和50%骨片上培养的OLC培养基(1.718±0.048)对成骨细胞碱性磷酸酶比活性的促进作用显著大于10μmol/L的NaF(1.027±0.024,P<0.05);50%骨片上培养的OLC培养基(54.0%±2.1%)和骨片上培养的OLC细胞质(48.7%±3.5%)对成骨细胞Cbfα1蛋白质表达的促进作用与10μmol/L的NaF(57.6%±2.6%)差异无统计学意义。结论两种OLC的亚细胞结构和离心去除OLC后的培养基对成骨细胞的功能均有促进作用,并以骨片上生长的OLC作用更大。     

不同浓度雌激素对人源性牙周膜干细胞成骨分化能力的影响

目的：对比研究不同浓度的雌激素对人源性牙周膜干细胞成骨分化的影响。方法：采用DMEM完全培养基将人牙周膜干细胞制成单细胞悬液,分别加入浓度为0、10×10^-10、10×10^-9、10×10^-8、10×10^-7、10×10^-6、10×10^-5mol/L的雌激素,以未加入雌激素的成骨诱导液组（普通DMEM培养基中加入10mMβ-甘油磷酸钠、50μM维生素C及10nM地塞米松）作为阴性对照。培养后实时定量PCR方法分别检测成骨早中晚期关键指标Runx2、ALP和OCN mRNA表达。结果：浓度为10×10^-10、10×10^-9、10×10^-8、10×10^-7、10×10^-6、10×10^-5mol/L的雌激素对人源性的牙周膜干细胞培养均无毒性;不同浓度组间差异无统计学意义（P＞0.05）;在成骨诱导7、14、21天时,Runx2、ALP及OCN mRNA表达在10×10^-7组最高（P＜0.05~0.01）。在不同浓度雌激素组中成骨相关基因的表达均高于阴性对照组（P＜0.05）。结论：当雌激素浓度＜10×10^-7mol/L时,雌激素能够以剂量依赖的方式促进人牙周膜干细胞成骨分化过程中成骨相关基因的表达。当雌激素浓度＞10×10^-7mol/L时,雌激素浓度的增加并未促进成骨相关基因的表达。     

年龄因素对牙周膜干细胞增殖和分化能力的影响

目的 评估年龄因素对牙周膜干细胞(PDLSC)增殖、分化能力的影响.方法 选取来源于12位不同的患者因阻生需要拔除的第三磨牙12颗,根据患者年龄分为A组(年龄18～20岁)、B组(年龄45～50岁).分离培养获得PDLSC.MTT检测A、B组PDLSC增殖能力;进行成骨、成脂诱导,并用茜素红染色及油红O染色评价其分化能力;SA-βG染色分析A、B组细胞衰老情况;将A、B组PDLSC成骨诱导7d后进行ALP染色并同时采用Western blotting检测OCN、ALP的表达.结果 不同年龄阶段的供体中都能分离出PDLSC,然而其增殖和成骨分化能力随年龄增加而降低,成脂分化能力和SA-βG表达随年龄增加而增加.ALP和OCN成骨诱导7d后表达水平均升高,且A组高于B组.结论 随年龄增长能在牙周膜中获取PDLSC,随年龄增加其增殖与成骨分化能力下降,但成脂分化能力和SA-β表达则增加.     

神经元特异性烯醇化酶和U266细胞株对破骨样细胞作用的研究

目的：探讨神经元特异性烯醇化酶（NSE）和人多发性骨髓瘤细胞U266对人破骨样细胞（OLC）功能的影响。方法采用正常人外周血单个核细胞加用细胞核因子κB受体激治蛋白配体（RANKL）＋巨噬细胞集落刺激因子（M‐CSF）的方法诱导培养OLC ;实验分3组,NSE组：将6孔培养板中培养14 d的OLC ,分别加入100 ng／mL重组人NSE培养24、48、72 h;共培养组：将6孔Transwell小室下室中培养14 d的OLC ,各上室分别加入1×105／孔U266细胞进行共培养24、48、72 h;对照组：单独培养的OLC。通过实时荧光定量PCR比较NSE和U266细胞株对OLC的RANKL、扩胃蛋白（OPG）、IL‐6和抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP） mRNA转录水平的影响。结果共培养组、NSE组和对照组RANKL、OPG、IL‐6 mRNA在OLC均不表达;与对照组相比,共培养组、NSE组的TRAP mRNA表达水平升高,差异有统计学意义（P＜0．01）;TRAP mRNA表达水平的升高尤其以48 h和72 h明显。结论本试验中OLC表达TRAP ,NSE是促进骨髓瘤骨病中OLC分化和成熟的因素,提示NSE能增强OLC的活性。     

维甲酸对脂肪源干细胞中生殖标记表达的影响

目的探索脂肪源干细胞(ADSCs)在维甲酸(RA)诱导下是否表达原始生殖细胞标记碱性磷酸酶(ALP)及生殖标记基因vasa。方法分离培养2个月龄SD雌性大鼠ADSCs,传至第3代进行成脂、成骨诱导和表面标记鉴定。将第3代ADSCs分别用10-5、10-6、10-7mol/L RA诱导7 d和14 d,采用ALP检测试剂盒检测各组ALP的活性水平。用RT-PCR方法检测10-5mol/L RA组Vasa mRNA表达。结果将第3代ADSCs分别用10-5、10-6、10-7mol/L RA诱导7 d的D520 nm值分别为0.59±0.04,0.27±0.07,0.15±0.03,对照组为0.07±0.01,诱导14 d的OD值分别为0.42±0.02,0.34±0.01,0.19±0.02,对照组为0.07±0.01,说明RA能显著性促进ADSCs碱性磷酸酶的表达(P<0.01)。第3代ADSCs用10-5mol/L RA诱导7 d Vasa mRNA的表达为阴性。结论第3代ADSCs在维甲酸诱导下能够表达原始生殖细胞标记碱性磷酸酶,但用10-5mol/L RA诱导7 d不能表达生殖标记基因Vasa。     

purmorphamine促进人牙周膜干细胞应力成骨

目的研究purmorphamine在动态张应力促人牙周膜干细胞(human periodontal ligament stem cells,PDLSCs)向成骨细胞分化过程中的作用。方法分离培养鉴定PDLSCs,在矿化诱导环境中加入purmorphamine,采用Flexcell FX-4000T应力加载系统对细胞加力24 h,以Real-time PCR检测成骨相关指标Runx2、alkaline phosphatase(ALP)以及Hedgehog(Hh)通路的标志物GLI1、Pathed1(PTCH1)、Smoothend(SMO)。结果动态张应力作用24 h后,成骨相关指标Runx2、ALP,Hh通路的标志物GLI1、PTCH1、SMO的表达水平明显升高(P<0.05);加入purmorphamine后,成骨相关指标Runx2、ALP,Hh通路的标志物GLI1、PTCH1、SMO的表达水平较加力组均有增强,差异有统计学意义(P<0.05)。结论 purmor-phamine可能通过激活Hh通路,进而增强人PDLSCs应力条件下向成骨细胞分化。     

人纤维环细胞与骨髓间充质干细胞Transwell共培养研究

目的探讨人的纤维环（AF）细胞与骨髓间充质干细胞（BMSCs）在Transwell共培养后,对AF细胞的细胞增殖和细胞外基质合成的影响,以及BMSCs是否具有向AF细胞分化的能力。方法分别对5例年龄在40岁以下脊柱手术患者的纤维环组织和骨髓标本进行分离、培养AF细胞和BMSCS,分别吸取第三代的AF细胞和BMSCs,按1 1的细胞比例分别植于Transwell共培养系统中,下室植入BMSCs,上室植入AF细胞。并且建立3个细胞培养组,即BMSCs与AF细胞共培养组（实验组）,BMSCs单独培养组和AF细胞单独培养组作为对照组。培养3周后,运用倒置相差显微镜观察细胞的形态变化;分别用HE染色、Ⅰ型胶原免疫组化染色和流式细胞仪对两种细胞鉴定;运用荧光定量PCR法检测各细胞培养组蛋白聚糖Aggrecan、Ⅰ型胶原蛋白mRNA及Sox9的表达变化。结果两种细胞在分离培养后经过鉴定确定为AF细胞和BMSCs。在倒置相差显微镜观察下,共培养组中AF细胞和BMSCs在细胞增殖数量和速度上均高于各自的单独培养组;共培养组中AF细胞和BMSCs的蛋白聚糖Aggrecan、Ⅰ型胶原蛋白mRNA及Sox9的表达均较各自的单独培养组高（P〈0.05）。结论通过BMSCs与AF细胞Transwell共培养,BMSCs可以促进AF细胞增值和细胞外基质的合成;同时通过共培养,BMSCs具有向AF细胞分化的可能。     

In vitro chondrogenesis of the goat bone marrow mesenchymal stem cells directed by chondrocytes in monolayer and 3-dimetional indirect co-culture system

Background  Cartilage injury has a very poor capacity for intrinsic regeneration. The cell-based treatment strategy for the cartilage repair using differentiated bone marrow mesenchymal stem cells (BMSCs) is, however, a promising approach to the chondral repair. This study was aimed to explore the chondrogenic potential of the goat BMSCs in the Transwell co-culture system and the poly-laetide-co-glycolide (PLGA) scaffolds.

Methods  The BMSCs were isolated from the goat iliac crest while the chondrocytes were obtained from the goat’s last costal cartilage. In the Transwell co-culture system, the BMSCs co-cultured with chondrocytes were designed as group A, whereas the goat’s BMSCs induced with the chondrogenic medium were group B. Both groups A and B were the experimental groups, while group C that only contained BMSCs was the control group. In the PLGA scaffolds co-culture system, BMSCs were seeded into the PLGA scaffolds, which were suspended in the 24-well plate, and the control group was established by presence or absence of chondrocytes at the bottom of the 24-well plate. Toluidine blue staining, Alcian blue staining, collagen II immunofluoresence, collagen II immunochemical staining, collagen I, collagen II, COL2a Q-PCR and osteopontin Q-PCR were used to examine the chondrogenic conditions as well as the expressions of chondrogenic and osteogenic genes.

Results  Cells isolated from the aspirates of the goat bone marrow proliferated rapidly and gained characteristics of stem cells in Passage 4. However, the differentiations of chondrocytes were not apparent in Passage 3. The results from Toluidine blue staining, collagen II immunofluoresence and PCR showed the transformation of BMSCs to chondrocytes in the Transwell co-culture system and PLGA scaffolds. Although the cartilage gene expressions were upgraded in both chondrogenesis group and co-culture system, the osteopontin gene expression, which represents osteogenic level, was also up-regulated.

Conclusions  The Transwell co-culture system and the PLGA scaffolds co-culture system can promote the chondrogenic differentiation of the goat’s BMSCs, while up-regulated osteopontin gene expression in the Transwell co-culture system implies the osteogenic potential of BMSCs.

     

活化的Mir-30a-wnt/β-catenin信号轴通过上调组织蛋白酶K的表达促进牙周膜干细胞向成牙骨质细胞分化

目的 探讨牙周膜干细胞（PDLSC）成牙骨质向分化过程中mir-30a-wnt/β-catenin信号轴调控组织蛋白酶K（CTSK）表达的功能作用。方法 极限稀释法分离培养PDLSC,釉基质蛋白衍生物（EMD）诱导细胞成牙骨质向分化。在细胞分化过程中,通过microRNA芯片筛选差异表达的microRNA。首先,给予不同分组细胞EMD诱导和/或抑制microRNA表达等处理,无干预组细胞作为对照。利用qPCR和Western blot技术首先验证差异表达的microRNA是否能够调控CTSK的表达。之后,将细胞膜片复合陶瓷支架材料植入裸鼠皮下,利用免疫组织化学方法观察成牙骨质细胞标记蛋白CAP和CEMP-1的表达变化,明确受microRNA 调控的 CTSK 表达变化是否参与了 PDLSC 成牙骨质分化。在此基础上,从蛋白学水平观察wnt信号通路在microRNA调节CTSK表达过程中是否发挥了相应功效。结果 EMD诱导PDLSC成牙骨质向分化过程中,多种microRNA表达发生变化,其中miR-30a表达出现特异性上调（P<0.05）。表达上调的miR-30a进一步调节CTSK的表达（P<0.05）,促进PDLSC异位形成类牙骨质样结构,高表达成牙骨质细胞标记蛋白CAP和CEMP-1。抑制wnt/β-catenin信号通路,miR-30a对CTSK的表达调控作用出现相应减弱。结论 EMD可能通过上调miR-30a的表达激活wnt/β-catenin信号通路从而经mir-30a-wnt/β-catenin信号轴调控CTSK诱导PDLSC向成牙骨质细胞方向分化。     

雌激素受体激动剂对人脐血内皮祖细胞增殖和迁移的影响

目的:观察选择性雌激素受体(ER)激动剂PPT(α亚型激动剂)和DPN(β亚型激动剂)对人脐带血内皮祖细胞(endothelial progenitor cells EPCs)增殖和迁移的影响,并与17β-雌二醇(17β-estradiol,E2)的作用进行比较。方法:采用密度梯度离心法分离获得脐带血单个核细胞,硫氰酸荧光素标记荆豆凝集素I(FITC-UEA-I)、DiI标记的乙酰化低密度脂蛋白(DiI-ac-LDL)双染及CD133免疫荧光鉴定EPCs。培养的EPCs分别加入不同浓度的E2、PPT和DPN(分别为1×10-10mol/L、1×10-9mol/L、1×10-8mol/L、1×10-7mol/L)进行细胞增殖实验分析(WST)、显微镜下EPCs计数及Transwell技术测定对EPCs迁移的影响。结果:E2及PPT呈浓度依赖性促进EPCs的增殖和迁移,PPT刺激作用等同于E2,DPN无刺激作用。结论:雌激素α亚型激动剂PPT明显刺激内皮祖细胞的增殖和迁移,其作用与17β-雌二醇相同。