广西巴马小型猪PGC-1α基因克隆与组织表达分析

目的 克隆广西巴马小型猪PGC-1α基因编码区（CDS）序列，利用RT-PCR和QRT-PCR方法分析PGC-1α mRNA组织表达情况。方法 本实验以广西巴马小型猪背最长肌cDNA为模版，PCR扩增PGC-1α基因CDS序列，将其连接至pEASY-T5载体，转染细菌、验证和序列测定；通过RT-PCR半定量和QRT-PCR实时荧光定量检测PGC-1α基因在小型猪多个组织中的表达情况。 结果 克隆获得广西巴马小型猪PGC-1α基因CDS序列，全长2391bp，编码796个氨基酸，与参考序列的同源性为99.9%，两处碱基发生同义突变，分别C-A1105和G-A1524；PGC-1α基因在广西巴马小型猪心脏和肾脏中的表达丰度最高，其次是肝脏、皮下脂肪和背最长肌，而在胰腺中未检测到其表达。 结论 成功克隆了广西巴马小型猪PGC-1α基因编码区序列并进行了多种组织表达分析，为后续研究PGC-1α在小型猪2型糖尿病发生过程中作用途径打下基础。     

猪内源性反转录病毒在中国实验小型猪中的存在与表达

目的对中国实验小型猪中内源性反转录病毒的存在与mRNA的表达进行检测,摸清中国实验小型猪中内源性反转录病毒的携带情况.方法根据已发表的PERV的序列设计并合成了三对引物,分别用于检测PERV核心蛋白基因(gag)、多聚酶基因(pol)及囊膜基因(env)的存在与表达;同时,根据目前通用的env基因分型方法合成了三对用于分型检测的引物env-A、env-B、env-C.应用PCR、RT-PCR扩增的方法,对来自于中国实验小型猪外周血淋巴细胞的DNA和RNA样品进行了检测.结果在6个被检DNA样品中均检出了PERV特异性DNA的存在;同样,在被检RNA样品中均有PERV特异性RNA的表达,且所表达的PERV均为A型和B型,在所有样品中均未检出C型PERV的表达.结论初步表明中国实验小型猪中存在内源性反转录病毒序列,且能以mRNA的形式表达,这一结果为我国特有小型猪的开发、利用及其病毒安全性评价奠定了基础.     

广西巴马小型猪α-1,3半乳糖转移酶基因真核表达载体的构建及鉴定

目的 通过RT-PCR扩增巴马小型猪GGTA1基因,分析其序列的结构特点并构建真核表达载体,为生产GGTA1基因沉默的广西巴马小型猪奠定基础.方法 根据NCBI上发布的猪α-1,3半乳糖转移酶基因cDNA序列(AF221508),设计合成一对含有 HindⅢ和BamHI酶切位点的特异性引物,以广西巴马小型猪肝脏组织总 RNA为模板进行RT-PCR,所得目的片段经纯化、克隆、鉴定和测序;将目的基因与pEGFP-N 1进行双酶切后连接构建真核表达载体pEGFP-GGTA1,通过测序,双酶切鉴定.结果 所克隆的广西巴马小型猪GGTA1基因存在缺失第五外显子(81-116) 的GGTA1序列,序列全长1 080 bp和未缺失第五外显子的GGTA1序列,全序列为1 116 bp.构建两个表达载体(缺失第五外显子 pEGFP-GGTA1-1、未缺失第五外显子pEGFP-GGTA1-2).结论 广西巴马小型猪GGTA1基因存在第五外显子缺失的现象,通过对GGTA1基因克隆序列进行分析以及构建两个真核表达载体,为后面在猪源PK-15细胞中对其进行表达鉴定以及巴马小型猪 α-1,3半乳糖转移酶基因的沉默实验奠定基础.     

湖南大围子猪内源性逆转录病毒的研究

目的：研究湖南大围子猪携带的内源性逆转录病毒（porcine endogenous retrovirus，PERV），为评价从猪到人异种移植的生物安全性提供依据。方法：从湖南大围子猪的保种群内随机采集42头个体的耳样组织，应用PCR和RT-PCR技术分别检测这些组织中PERV前病毒DNA和mRNA，并对PCR扩增的灵敏性进行评估。扩增、测序大围子猪的PERV env基因，结果用美国生物信息中心（National Center for Biotechnology Information）的BLAST软件进行分析。结果：所检测的42头大围子猪均带有PERV前病毒DNA，耳样组织中均有PERV mRNA表达，所有个体携带env-A，env-B和env-C3种囊膜蛋白基因。测序结果表明，大围子猪env-A和env-C与GenBank登录其他猪种序列（AY288779，AY534304）相比分别存在1和8个碱基的差异，而env-B基因没有碱基差异。结论：大围子猪种群携带PERV，而且均具有转录活性，亚型主要为PERV-ABC；大围子猪的PERVenv-A，env-C存在基因多态性，从生物安全性方面考虑，该猪种不宜作为异种移植供体。     

我国小型猪品系胰岛素受体底物1基因外显子1的多态性分析

目的 探讨我国特有的三个小型猪品系-中国农大小型猪、五指山小型猪、广西巴马小型猪胰岛素受体底物1基因多态性分布,为这些小型猪在代谢性疾病和2型糖尿病研究中的应用提供基础资料.方法 提取三个品系小型猪血液基因组DNA,针对胰岛素受体底物1基因外显子1的部分序列进行PCR扩增,对产物进行鉴定和测序,分析基因多态性.结果 在所扩增的片段中共检测出2个SNPs,第2 853位,T转换为C;第2 870位,C颠换为G,导致第956位的氨基酸由丙氨酸(A1a)变为甘氨酸(Gly).结论 本实验检测出的两个SNPs均发生在中国农大小型猪中,所检测的五指山小型猪和广西巴马小型猪未发现SNPs,这可能是因为小型猪品系之间存在遗传差异所致.     

Hpd基因修饰制备高酪氨酸血症Ⅲ型巴马小型猪模型

目的利用CRISPR/Cas9技术敲除巴马小型猪4-羟基苯丙酮酸氧化酶(4-OH phenylpyruvate dioxygenase,4HPPD/HPD)制备高酪氨酸血症Ⅲ型巴马小型猪模型。方法分别从质粒pGL3-U6-gRNA-PGK-puromycin和pST1374-NLS-flag-linker-Cas9中通过PCR扩增sgRNA-Hpd和Cas9体外转录用模板,接着体外转录出Cas9 mRNA和sgRNA-Hpd,最后将Cas9 mRNA和sgRNA-Hpd共注射入巴马小型猪受精卵的胞质内,以制备Hpd基因敲除巴马小型猪。结果胞质内共注射后,共移植20枚受精卵至2只代孕母猪。获得子代Hpd基因敲除巴马小型猪共4只。结论本研究成功制备了高酪氨酸血症Ⅲ型巴马小型猪模型,将为研究酪氨酸代谢通路提供更好的模型。     

广西巴马小型猪2型糖尿病模型骨骼肌糖代谢及能量代谢相关基因的表达差异

目的 本实验通过比较T2DM猪、非T2DM猪的糖代谢及能量代谢等关键调控基因（PGC-1α、Glut-4、ERRα、NRF-1、TFAM和线粒体基因）,探讨这些基因在T2DM发生中所起到的作用。方法 以广西巴马小型猪T2DM模型建立的发病组和未发病组的背最长肌为实验材料,利用QRT-PCR实时荧光定量的方法对糖代谢及能量代谢相关基因mRNA和线粒体基因的表达情况进行检测。结果 在广西巴马小型猪背最长肌中,T2DM组PGC-1α、Glut-4、ERRα和NRF-1的相对表达量均显著高于非T2DM组,TFAM和线粒体基因的相对表达量则稍低于非T2DM组。结论 在T2DM巴马小型猪骨骼肌中,上调PGC-1α及其下游基因Glut-4、ERRα和NRF-1的表达水平,有利于改善葡萄糖代谢;而线粒体合成不足,致使ATP合成量不够,或引起胰岛素抵抗,进而导致2型糖尿病的发生。     

我国特有三个小型猪品系胰岛素受体底物1基因外显子1的多态性分析

目的探讨我国三个特有的小型猪品系——中国农大小型猪,五指山小型猪,广西巴马小型猪--胰岛素受体底物1基因多态性分布,为这些小型猪在代谢性疾病和2型糖尿病研究中的应用提供基础资料。方法提取三个品系小型猪血液基因组DNA,针对胰岛素受体底物1基因外显子1的部分序列进行PCR扩增,对产物进行鉴定和测序,分析基因多态性。结果在所扩增的片段中共检测出2个SNPs,均发生在中国农大小型猪中,其中第2870位置上的C到G的颠换引起了第956位上的丙氨酸（Ala）转变为甘氨酸（Gly）,     

版纳微型猪近交系AQP3克隆、序列分析及组织表达

目的 克隆版纳微型猪近交系aquaporin 3(AQP3)基因,并利用生物信息学方法分析其序列特征,研究其在猪各组织中的表达情况.方法 从版纳微型猪近交系脾脏中提取总RNA,利用RT-PCR方法扩增猪AQP3编码区序列,将纯化的片段与pMD18-T载体连接,转化宿主菌DH 5α,筛选阳性克隆进行测序.并采用半定量RT-PCR方法分析版纳微型猪近交系不同组织中AQP3基因的表达情况.结果 成功克隆出AQP3基因编码区全长873 bp的序列,GenBank登录号为HQ888860,其编码290个氨基酸.氨基酸序列同源性分析表明,与牛的AQP3基因同源性最大,达99％.多组织半定量RT-PCR研究表明AQP3 mRNA在BMI猪的脾脏、肾脏、肺、小肠中均有表达,其中脾脏中表达最高.结论 成功克隆出了版纳微型猪近交系AQP3基因全长编码区,并对其编码的蛋白质功能进行了预测,为进一步的功能研究奠定了基础.     

多肽:N-乙酰氨基半乳糖转移酶-2在不同肿瘤组织中mRNA的表达差异

目的：观察三种不同肿瘤组织中PPGalNAc-T2的表达差异；方法：本文采用RT-PCR方法从mRNA水平上研究其表达，同时在同一反应管中进行内对照β-微球蛋白的扩增以进行半定量分析；结果：ppGalNAc-T2在不同肿瘤组织中，其在肿瘤部分、癌旁部分与正常部分的表达水平不具有一致性；结论：PPGalNAc-T2具有组织特异性；不同肿瘤组织的糖基转移酶作为肿瘤标志基因有待进一步的研究。     

蕨麻小型猪与巴马小型猪高原多脏器功能障碍综合征模型的比较研究

目的比较不同海拔地区两种小型猪高原多脏器功能障碍综合征(H-MODS)模型存在的差异,探讨建立H-MODS模型的理想动物。方法利用高原土生蕨麻小型猪与平原巴马小型猪,以内毒素(LPS)建立HMODS模型。检测不同时点血液生理生化指标的变化,并观察肺脏组织病理学变化。结果巴马小型猪模型的死亡率明显高于蕨麻小型猪;生理生化各指标的变化基本相同,但蕨麻小型猪的变化较平缓。在24 h与48 h肺脏均出现严重病理改变,但巴马小型猪较蕨麻小型猪更严重。结论不同海拔地区的两种小型猪均可成功建立HMODS模型,同时蕨麻小型猪由于自身高原生物特性对H-MODS模型的复制更加准确安全,避免高原环境的外在因素的影响。     

两种小型猪代谢综合征相关指标比较研究

目的 探讨两种小型猪作为代谢综合征模型动物的可行性。方法 选择巴马小型猪和西藏小型猪,测量体重、体尺以及与代谢综合征有关指标-血脂、血糖、自由基水平,在不同种和性别之间进行比较分析。结果 与西藏小型猪比较,巴马小型猪体重大,体长度短,颈围大,腹围大,肥胖指数高,而且差异在雌性巴马小型猪中更加显著。TC、HDL-C、LDL-C、TC水平在雌性小型猪高于雄性小型猪。GLU水平在巴马小型猪高于西藏小型猪,并与雌性西藏小型猪的差异显著,而FRA和HbAlc水平在西藏小型猪高于巴马小型猪,Insulin水平在雌性巴马小型猪和雄性西藏小型猪中分别高于雄性巴马小型猪和雌性西藏小型猪。MDA水平在雌性巴马小型猪中显著高于雄性巴马小型猪和西藏小型猪,SOD和GSH-Px水平在巴马小型猪中高于西藏小型猪。结论 通过体重、体尺、血脂、血糖和自由基水平等正常生理指标的分析,巴马小型猪倾向于肥胖;两种小型猪血脂雌性高于雄性;巴马小型猪空腹血糖高于西藏小型猪,但巴马小型猪的血糖控制能力优于西藏小型猪;巴马小型猪抗氧化能力优于西藏小型猪。总之,在代谢综合征相关研究中根据具体需求进行选择不同种、不同性别的小型猪并以具体造模实践来加以验证。     

荧光定量PCR与半定量PCR检测猕猴不同器官组织中黄嘌呤脱氢酶/氧化酶基因的mRNA表达差异的比较

目的 比较荧光定量PCR与半定量PCR检测猕猴体内肝脏组织、上皮组织、睾丸组织、心肌组织,肾脏组织中黄嘌呤脱氢酶氧化酶(XDH/XO)的mRNA的相对表达量的差异,为改进实验研究方法学提供参考依据。方法 提取健康猕猴新鲜肝脏组织、上皮组织、睾丸组织、心肌组织,肾脏组织中总RNA,使用相同的引物序列及内参基因,分别用荧光定量PCR与半定量PCR进行相对定量检测,结果做比对分析。结果 两种检测方法均能检测到健康猕猴新鲜肝脏组织、上皮组织、睾丸组织、心肌组织,肾脏组织中XDH/XO的mRNA表达,荧光定量PCR灵敏度可检测到肝脏组织0.4ng总RNA中的XDH/XO的mRNA表达,半定量PCR灵敏度可检测到肝脏组织15.625 ng总RNA中的XDH/XO的mRNA表达,荧光定量PCR较半定量灵敏度高39倍。两种方法检测结果均显示猕猴不同组织XDH/XO的mRNA表达在肝脏组织中表达水平最高,对于表达量较低的其他组织,荧光定量PCR与半定量PCR检测结果存在有一定差异。结论 两种方法均可用于检测猕猴体内肝脏组织、上皮组织、睾丸组织、心肌组织,肾脏组织中黄嘌呤氧化脱氢酶(XDH/XO)的mRNA的相对表达量,荧光实时定量PCR灵敏度较高于半定量PCR法。     

不同品系小型猪对高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒的敏感性筛选

目的 筛选对高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(HP-PRRSV)敏感的小型猪品系, 以用于HP-PRRS活疫苗的评价。方法 本研究选择蓝塘猪、蕨麻小型猪、巴马小型猪、五指山小型猪(白系)接种PRRSV NVDC-JXA1株强毒, 并以本地二元杂猪作为对照。攻毒后每天观察动物精神、食欲、死亡等情况, 死亡动物进行剖检, 并采取肺组织做RT-PCR检测病毒, 连续观察5周, 试验结束时采取存活动物血清分别检测PRRSV抗体。结果 攻毒后各组都有动物出现精神沉郁、食欲下降、死亡等现象, 死亡动物RT-PCR检测都显示为阳性, 存活动物PRRSV抗体检测阳性。从死亡率看, 巴马小型猪和五指山小型猪白系对PRRSV NVDC-JXA1株强毒的敏感性最高, 并且敏感性超过了对照组二元杂猪。结论 巴马小型猪和五指山小型猪白系对HP-PRRSV敏感, 可用于HP-PRRS活疫苗的检验。     

小型猪慢性心肌缺血模型的建立与无创遥测技术的应用

为建立小型猪慢性心肌缺血模型和应用无创遥测技术的评价方法,本研究采用维生素D3和异丙肾上腺素复合高脂饮食的方法建立了小型猪慢性心肌缺血模型;并利用无创遥测技术对小型猪慢性心肌缺血模型的症状进行检测与评价,同时对五指山小型猪、巴马小型猪和西藏小型猪的运输应激和高脂诱导发生动脉粥样硬化(AS)的危险因素进行评估。建立了巴马小型猪慢性心肌缺血模型与评价技术规范,明确了无创遥测技术可用于心肌缺血模型的症状检测和评价,界定了小型猪运输应激后需4周以上的适应恢复期。并发现了高脂环境下五指山小型猪、巴马小型猪和西藏小型猪发生高血脂、高血压、高胰岛素血症等AS危险因素的不同特征,这为小型猪在心血管疾病研究中的选择和应用提供参考。     

广东省实验用小型猪主要病原微生物学及寄生虫学调查

目的调查广东省实验用小型猪主要病原微生物和寄生虫的感染情况。方法从广东省4家生产单位随机抽取小型猪154头,包括巴马小型猪、蕨麻小型猪、西藏小型猪和五指山小型猪4种品系,采集皮毛、鳞屑、血清、肛拭子、粪便等样品检测20种病原,对结果进行生产单位和品系间的差异性分析。结果所检4家单位的所有品系小型猪均存在多种病原复合感染,猪链球菌2型(50.7%)、胸膜肺炎放线杆菌(40.3%)、肺炎支原体(100.0%)、乙型脑炎病毒(41.3%)、猪圆环病毒2型(74.8%)、猪传染性胃肠炎病毒(73.8%)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(44.7%)7种病原的检出率相对较高,猪细小病毒(26.0%)、猪伪狂犬病病毒(15.6%)、肠道中蠕虫(3.2%)有一定检出率;要求强免的猪瘟病毒(62.8%)、口蹄疫病毒(35.8%)免疫合格率较低,猪伪狂犬病病毒免疫合格率高达98.4%。本次调查未检出沙门氏菌、布鲁氏菌、猪痢疾蛇样螺旋体、皮肤病原真菌、甲型流感病毒、弓形虫、体外寄生虫和粪便球虫。结论广东地区存栏实验用小型猪存在多种病原复合感染,需加强免疫和质量控制,逐步建立高等级群体;同时也为实验用小型猪地方标准乃至国家标准的制/修订提供了依据。     

巴马小型猪在医学研究中的应用进展

广西巴马小型猪作为国内小型猪主要品种之一,具有遗传性稳定、多产、体重较小、体表多覆白毛等特征,组织器官及生化指标与人类相似,已越来越广泛地应用于医学研究领域：猪的心脏解剖与生理特点与人类高度相似,已被广泛应用于心血管系统研究中,在我国,巴马小型猪被用来构建心肌缺血、卵圆孔未闭等心血管疾病模型;猪具有杂食性及与人相似的脂质代谢,可用于研究内分泌疾病,巴马小型猪已用于糖尿病动物模型建立及其遗传易感性、并发症的防治研究等;巴马小型猪的消化系统与人类相似,利用此特点已建立阻塞性慢性胰腺炎、结肠穿孔、胆肠吻合等消化系统疾病模型;巴马小型猪除头、尾外,体表覆以白毛,这一特点使其成为研究皮肤创伤、烧伤修复等的理想动物;小型猪的牙齿解剖结构与人类相似,口裂大,可作为口腔医学研究中的理想动物,巴马小型猪已用来建立牙髓坏死模型及对上颌扩弓方式的研究;类似人的解剖、生理、病理使其成为较为适合的异种移植供体。在中医药研究方面,已用巴马小型猪分别建立了肝脏、脾脏、股动、静脉出血及头颈恶性肿瘤放疗后的腮腺损伤动物模型以研究中药制剂的疗效及机制。     

巴马小型猪头颈部动脉的磁共振血管成像研究

目的 利用三维时间飞跃法（3D TOF）和时间分辨对比剂动态显像（TRICKS）磁共振血管成像显示巴马小型猪的头颈部血管结构,并比较分析两种技术的动脉成像指标,为大动物脑血管病模型的研究提供参考。方法 应用3.0 T磁共振仪依次对3只健康巴马小型猪行头颈部血管的3D TOF和TRICKS磁共振血管成像,比较两种磁共振血管成像方法的血管清晰度评分,定量分析主要动脉的对比度（CR）、信噪比（SNR）以及对比噪声比（CNR）。结果 在血管清晰度方面,两种方法对巴马小型猪颈总动脉和颈外动脉系显示较好,对后循环的显示欠佳,而3D TOF磁共振血管成像对颅内动脉系的显示优于TRICKS磁共振血管成像[（1.60±0.50）分vs（1.37±0.49）分,P=0.019 8]。定量分析发现,TRICKS磁共振血管成像可不同程度提高动脉的CR,但两种方法所得动脉的SNR和CNR差异均无统计学意义（P>0.05）。结论 3D TOF和TRICKS磁共振血管成像均可较好地显示巴马小型猪的颈总动脉及其主要分支结构,并各有优势和局限。     

基于遥测技术对巴马小型猪部分生理指标的观测

目的应用遥测技术观察巴马小型猪在清醒自由状态下心电、血压、呼吸、活动等指标昼夜波动变化。方法取雄性6月龄巴马小型猪6只,行浅表股动脉VAP血管通路植入手术,恢复7 d后,用EMAK遥测系统进行24 h连续清醒自由状态下心电、血压、呼吸、活动指标监测,并用EMAK分析软件对上述指标进行分析。结果6月龄巴马小型猪心电、血压、呼吸、活动都有昼夜节律变化,白昼心率显著高于黑夜心率(P0.01),且白昼PR间期、QRS间期与QT间期均显著低于黑夜(P0.05,P0.01),白昼平均心率为76.22次/分,黑夜平均心率为67.03次/分,白昼平均PR间期、QRS间期和QT间期分别为109.97 ms、42.72 ms、380.37 ms,黑夜平均PR间期、QRS间期和QT间期为112.32 ms、44.01 ms、389.24 ms。巴马小型猪白昼收缩压、舒张压、平均压都显著高于夜间(P0.01),白昼平均收缩压、舒张压、平均压分别为129.57 mmHg、96.75 mmHg、111.73 mmHg,夜间平均收缩压、舒张压、平均压分别为122.81 mmHg、92.65 mmHg、106.19 mmHg,且黑夜收缩压、舒张压、平均压下降率分别为19.89%、19.05%、19.35%。另外,巴马小型猪在白昼的活动情况与呼吸频率都要显著高于夜间(P0.01)。结论利用遥测技术可以对清醒自由状态下巴马小型猪心电、血压、呼吸、活动等进行连续监测,能真实的反应小型猪在24 h内上述生理指标的变化规律,为巴马小型猪在药理毒理研究中的应用提供参考。     

高脂诱导五指山小型猪动脉粥样硬化模型的建立及Lp-PLA2的表达调控

目的 高脂诱导建立五指山小型猪动脉粥样硬化（AS）模型,观察脂蛋白相关磷脂酶A₂（Lp-PLA₂）在AS模型血浆和斑块中的表达变化。方法 将10只五指山小型猪随机分为正常对照（Ctr）组4只饲喂普通饲料、AS模型（AS model）组6只饲喂高脂饲料,连续造模24周。造模24周时,空腹取前腔静脉血测定总胆固醇（TC）、低密度脂蛋白（LDL-C）、高密度脂蛋白（HDL-C）、甘油三酯（TG）、C-反应蛋白（CRP）、Lp-PLA₂活性和成分的变化,并取主动脉进行油红O染色以及取腹主动脉血管行HE染色和IL-6免疫组化染色,观察血管脂质沉积和斑块病理以及IL-6蛋白表达变化。采用RT-PCR和Western Blot法观察腹主动脉组织中Lp-PLA₂mRNA和蛋白的表达情况。结果 与正常对照组比,AS模型组体重、体质量指数（BMI）、TC、LDL-C、HDL-C、CRP、Lp-PLA₂活性和成分均显著升高（P < 0.05,P < 0.01）,同时主动脉脂质沉积明显（P < 0.01）和AS斑块形成,腹主动脉组织中Lp-PLA₂mRNA和蛋白表达以及IL-6蛋白表达均显著升高（P < 0.05）。结论 长期高脂饮食24周能诱发五指山小型猪AS,且Lp-PLA₂在参与血管炎症和AS斑块形成中发挥了关键作用。