特异性下调GRP78基因表达对卵巢癌细胞耐药性的影响

目的:探讨RNA干扰技术沉默葡萄糖调节蛋白78（GRP78）基因对人卵巢癌细胞耐药性的影响,阐明GRP78基因沉默逆转肿瘤细胞耐药性的生物学机制。方法：构建pSilencerTM3.0-H1-GRP78 siRNA重组质粒,脂质体介导转染至SKOV3/DDP细胞;RT-PCR和Western blotting法检测GRP78基因的蛋白的表达;Western blotting法检测caspase-4和caspase-3蛋白表达;流式细胞术检测细胞凋亡率。结果：转染GRP78 siRNA重组质粒的SKOV3/DDP细胞GRP78基因和蛋白表达较转染空质粒组明显降低(P<0.05);加用顺铂后,转染GRP78 siRNA重组质粒细胞组较未转染GRP78 siRNA重组质粒细胞组caspase-4和caspase-3表达明显增加(P<0.05),细胞凋亡率也明显增加(P<0.05)。结论：抑制GRP78基因表达能通过上调caspase-4和caspase-3表达及增加顺铂诱导的SKOV3/DDP细胞凋亡率,降低SKOV3/DDP细胞对顺铂的耐药性。     

RNA干扰抑制c-myc基因表达对D341细胞增殖的影响

目的探讨应用小干扰RNA（siRNA）技术抑制髓母细胞瘤D341细胞株的c-myc基因对D341细胞的生长、细胞周期及凋亡的变化。方法制备特异性针对c-myc基因的siRNA,转染D341细胞,实时定量RT-PCR、Western blot检测c-myc基因表达情况,流式细胞仪进行细胞周期及凋亡检测。结果siRNA转染D341细胞后,c-myc基因表达在转染后24h抑制效率最高,c-myc蛋白在48h抑制效率最高,并随siRNA浓度的增大,沉默c-myc基因效率增高。RNA干扰抑制D341细胞c-myc基因后,细胞生长停滞于G1期。结论针对c-myc基因的siRNA对D341细胞c-mycmRNA及蛋白有明显抑制作用,细胞生长受到抑制,有望成为髓母细胞瘤的新的治疗途径。     

siRNA沉默eIF4E诱导人喉癌Hep-2细胞凋亡及其机制

目的：观察真核细胞翻译起始因子4E(eIF4E)基因的靶向小干扰RNA(siRNA)对喉癌Hep-2细胞中eIF4E基因表达的影响,探讨其诱导喉癌细胞凋亡的作用机制。方法：采用脂质体LipofectamineTM 2000将siRNA-eIF4E转染入人喉癌Hep-2细胞（siRNA-eIF4E组）,同时设空白对照组和空质粒组。MTT法检测siRNA对Hep-2细胞增殖的抑制作用,罗丹明染色检测转染后细胞内线粒体膜电位的变化,TUNEL染色法检测细胞凋亡,RT-PCR和Western blotting法检测凋亡相关基因转录和蛋白表达水平的变化。结果：与空白对照组及空质粒组比较, siRNA-eIF4E组Hep-2细胞中eIF4E基因转录和表达水平明显下调（P<0.01）,Hep-2细胞生存率下降（P<0.05）,细胞线粒体膜电位降低（P<0.05）,细胞凋亡率增加（P<0.05）,凋亡相关基因Bim、Bid及Caspase-3表达上调（P<0.05）。结论：siRNA-eIF4E在体外可抑制人喉癌Hep-2细胞增殖,其机制可能是通过激活线粒体凋亡途径诱导Hep-2细胞凋亡。     

COX-2 siRNA诱导人肝癌Hep3B细胞凋亡实验研究

目的:观察COX-2在人肝癌细胞Hep3B中的表达及小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)沉默COX-2基因对COX-2 mRNA和蛋白表达、细胞增殖及凋亡的影响。方法:将siRNA-COX-2质粒载体转染Hep3B细胞,WST-8法检测细胞增殖抑制情况,透射电镜观察凋亡小体出现情况;筛选单克隆细胞株Hep3B-sh,采用RT-PCR和Western blotting检测COX-2 mRNA和蛋白情况。结果:siRNA-COX-2能抑制Hep3B细胞的增殖,稳定转染pshRNA-COX-2可使Hep3B细胞中COX-2 mRNA及蛋白的表达明显减弱(P<0.01);透射电镜下可见凋亡小体出现,发生凋亡细胞数增加。结论:COX-2siRNA能有效抑制肝癌Hep3B细胞中COX-2的表达和细胞的增殖,促进凋亡发生,为肝细胞癌基因治疗提供实验依据和治疗靶点。     

siRNA抑制人前列腺癌PC-3细胞株VEGF的表达及细胞增殖

目的:研究小干扰RNA(siRNA)对PC-3人前列腺癌细胞血管内皮生长因子(VEGF)基因表达的抑制作用及抑制癌细胞增殖和诱导凋亡的作用。方法:体外合成特异性靶向人VEGF基因的siRNA，并转染到PC-3细胞中;RT-PCR和Western blotting检测siVEGF对VEGF基因和蛋白表达的抑制作用;MTT法检测siVEGF对癌细胞增殖抑制作用，流式细胞术检测siVEGF诱导细胞凋亡的作用。结果:转染siVEGF1和siVEGF2组VEGF mRNA 表达水平与空白对照组比较分别下调了60.32%和70.73%；VEGF蛋白表达水平与空白对照组比较明显受到抑制，最高抑制率达72％；转染阴性对照质粒组VEGF基因和蛋白表达水平都无明显改变。转染siVEGF1和siVEGF2的细胞增殖受到抑制，增殖抑制率分别为49.5%和55.3 %，细胞的凋亡率分别为33.9%和42.0%。结论:构建的siRNA VEGF能特异有效下调VEGF基因的表达,瞬时转染siRNA VEGF能有效抑制人前列腺癌细胞PC-3增殖并诱导其凋亡。     

RNA干扰靶向沉默HER2/neu基因对卵巢癌细胞株SK-OV3的影响

目的：观察siRNA表达质粒稳定转染靶向沉默HER2/neu基因对SK OV 3卵巢癌细胞株的影响。方法：针对HER2/neu基因序列构建短发夹状siRNA真核表达载体(pGenesil 1 HER2/neu),转染卵巢癌细胞株SK OV 3,G418筛选出稳定转染株后,采用RT PCR和Western Blot法观察HER2/neu基因的沉默效果;CCK 8比色分析检测细胞体外增殖活力;流式细胞仪检测细胞周期。结果：测序证实成功构建HER2/neu的2个短发夹状siRNA真核表达质粒;稳定转染SK OV 3细胞后,转染了特异性HER 2/neu siRNA的细胞HER 2/neu mRNA及p185蛋白水平均明显低于亲本细胞及转染无义对照序列的细胞;CCK 8比色分析显示HER 2/neu基因沉默的细胞存活分数明显低于HER 2/neu基因高表达的细胞（P=0.000）;流式细胞仪细胞周期分析也显示,HER 2/neu基因沉默的细胞处于凋亡状态及非增殖期的比例明显增加（P均<0.01）,而处于合成期的比例却显著减少（P≤0.001）。结论：靶向HER2/neu基因的短发夹状siRNA可从转录及翻译水平有效地沉默HER 2/neu基因;HER 2/neu基因沉默的SK OV 3卵巢癌细胞增殖明显受抑制。     

下调SnoN基因表达对HepG2细胞增殖及凋亡的影响

目的通过小干扰RNA(siRNA)下调人肝癌HepG2细胞中SnoN基因的表达,探讨SnoN对HepG2细胞增殖、凋亡等生物学功能的影响及其意义。方法设计并化学合成3条靶向SnoN的siRNA序列,采用阳离子脂质体瞬时转染的方法将干扰序列转染至HepG2细胞内,采用RT-PCR和Western blot方法,检测转染后的抑制效果并筛选出一条抑制效果最好的干扰序列,然后采用CCK-8法和流式细胞术检测SnoN基因表达下调后HepG2细胞增殖、凋亡的变化。结果 3条siRNA均对SnoN的表达有抑制作用,以siRNA-C抑制效果最好。下调SnoN基因表达后,HepG2细胞的增殖受到抑制(P<0.05),细胞凋亡增加(P<0.05)。结论靶向SnoN的siRNA可有效抑制SnoN基因的表达,进而使HepG2细胞的生长受到抑制、细胞凋亡增加,表明SnoN基因可能与肝癌细胞的增殖与凋亡有关。     

小干扰RNA沉默EGFR基因对卵巢癌细胞侵袭力的影响

目的 通过小干扰RNA(siRNA)沉默表皮生长因子受体(EGFR)基因的表达,旨在探讨其对卵巢癌SKOV3细胞体外侵袭力影响.方法 体外构建靶向EGFR基因siRNA质粒和阴性对照质粒, Lipofectamin 2000介导转染到SKOV3细胞中.实验分空白对照组、非特异性转染组、特异性转染组.采用RT-PCR和免疫细胞化学法检测EGFR基因mRNA和蛋白表达水平;采用平板克隆形成法检测细胞生长增殖能力;采用Transwell侵袭实验检测细胞体外侵袭力.结果 特异性转染组细胞EGFR mRNA 的表达与其他两组相比明显减弱(F=50.45,q=12.87、11.72,P<0.01),EGFR 蛋白表达明显下调(F=61.54,q=14.58、11.46,P<0.01);细胞生长增殖能力减弱(F=130.12,q=21.12、18.15,P<0.01);体外侵袭力明显降低(F=34.09,q=11.26、8.34,P<0.01).结论 siRNA可以有效抑制SKOV3细胞EGFR基因的表达,从而抑制SKOV3细胞增殖和侵袭能力.     

靶向survivin的siRNA诱导胰腺癌细胞凋亡的实验研究

目的 采用RNA干扰技术（siRNA）阻断survivin基因的表达，观察其抑制胰腺癌细胞增殖及诱导胰腺癌细胞凋亡的作用。方法 构建靶向survivin的siRNA质粒表达载体，采用Lipofectamine^TM2000转染胰腺癌细胞PC-2，采用半定量RT-PCR、免疫组化技术检测转染前后PC-2细胞survivin基因表达的变化；采用MTT法检测对PC-2细胞增殖的抑制作用：采用流式细胞术检测其诱导PC-2细胞凋亡的作用。结果 靶向survivin的序列特异性的siRNA可以高效地抑制PC-2细胞survivin基因表达，在mRNA水平其表达抑制率为81．25％，在蛋白质水平其表达抑制率为74．24％。转染靶向survivin的siRNA质粒表达载体可以显著抑制PC-2细胞的增殖，细胞接种24、48h后其增殖抑制率分别为28．00％和33.38％：转染后24、48h可以诱导8．46％、7．53％的细胞凋亡。结论 所构建的靶向survivin的siRNA质粒表达载体可以有效地阻断PC-2细胞survivin基因表达。阻断survivin基因表达可以显著地抑制PC-2细胞的增殖并在一定程度上诱导其凋亡，靶向survivin的siRNA在胰腺癌的基因治疗中具有一定的价值。     

血红素加氧酶-1对食管癌细胞株Eca109增殖及凋亡作用的影响

目的 研究血红素加氧酶-1(heme oxygenase,HO-1)对食管癌细胞株Eca109增殖活性及凋亡作用的影响.方法 利用体外设计合成的靶向抑制HO-1的低分子RNA(siRNA)沉默食管鳞癌Eca109细胞HO-1基因的表达,应用RT-PCR、Western blot检测HO-1 mRNA和蛋白表达水平,分别以MTS法、流式细胞术检测干扰HO-1后食管鳞癌Eca109细胞增殖和凋亡水平.结果 RT-PCR、Western blot检测结果显示转染HO-1 siRNA可以成功抑制食管鳞癌Eca109细胞HO-1的表达;与空白组、阴性对照组比较,HO-1 siRNA干扰组Eca109细胞增殖能力明显减弱,细胞凋亡率显著增加.结论 HO-1siRNA可有效沉默食管癌细胞HO-1的表达,抑制细胞的增殖活性,促进细胞的凋亡.     

E2F3基因沉默载体pRNAT-U6.1-siE2F3/Neo的构建及表达

【目的】构建针对E2F3基因的shRNA表达载体,通过脂质体进行膀胱癌细胞内转染,监测转染效率。【方法】通过软件设计针对E2F3基因的寡核苷酸链,化学合成一对编码短发夹RNA序列,长度为64个碱基。核苷酸链经退火,克隆到经BamHI、HindⅢ双酶切的pRNAT-U6.1/Neo载体上,构建针对E2F3基因的RNA干扰质粒。通过双酶切、PCR鉴定及基因片段序列分析验证构建效果。通过不同浓度的Lipofectamin 2000及干扰质粒混合物进行膀胱癌细胞系5637细胞转染,通过绿色荧光的表达程度摸索出细胞最佳转染浓度及转染时间。【结果】重组构建的pRNAT-U6.1-siE2F3/Neo载体经PCR分析及插入基因片段序列分析,结果表明64个碱基成功插入到预计位点,并且序列完全一致。Lipofectamin 2000能够有效的进行pRNAT-U6.1-siE2F3/Neo质粒的转染。【结论】载体的成功构建及膀胱癌细胞系的高效转染,为进一步研究E2F3基因在膀胱肿瘤中的功能奠定基础。     

人抗肌萎缩蛋白Dp71 shRNA载体构建与检测

目的：构建有效针对人Dystrophin Dp71基因的短发夹RNA(short hairpin RNA，shRNA)真核表达载体，并验
证其干扰效果。方法：设计合成3对针对人Dystrophin Dp71基因的和1对无同源性的siRNA片段，在两端和中间加上酶
切位点和Loop环。将合成的DNA片段插入到干扰载体pRNAT-U6.1/Neo中，经过酶切和测序验证，成功构建人Dp71基
因的shRNA和空白对照载体。将各干扰载体和空白载体转染人正常胃黏膜上皮细胞(gastric epithelial cells，GES-1)和人
支气管上皮细胞(human bronchial epithelium，HBE)，Western印迹检测Dp71 shRNA真核表达载体的干扰效率。结果：酶
切和测序验证均表明各Dp71-shRNA载体构建成功。将空载体及各Dp71 shRNA载体分别转染GES-1和HBEC，和空白细
胞对照及shRNA空白载体组相比，3组Dp71-shRNA能够明显抑制Dp71蛋白表达，但是3组质粒的抑制效率有一定的差
异，以Dp71 shRNA2对Dp71表达的干扰效率最强。结论：成功构建了3个有效针对人Dystrophin Dp71基因的shRNA 干
扰载体，3组质粒都能有效地抑制Dp71在GES-1和HBEC中的表达，其中以Dp71-shRNA2的抑制效率最高。     

短发夹状干扰RNA沉默信号传导和转录激活子3基因表达对大肠癌细胞的影响

目的构建携带信号传导和转录激活子3（STAT3）基因短发夹状干扰RNA（shRNA）的真核表达载体,观察干扰STAT3表达对大肠癌细胞HT-29细胞增殖的影响。方法从GenBank STAT3mRNA上寻找到3条符合特征的靶序列,合成靶序列的DNA寡核苷酸链,合成双链DNA,并和BamHⅠ和HindⅢ酶切后的pRNAT-U6.1/Neo载体质粒连接产生重组质粒,行PCR和测序鉴定。重组质粒瞬时转染大肠癌HT-29细胞,实时定量PCR、Western blot检测STAT3的表达。筛选出最佳重组质粒,转染大肠癌细胞后,MTT检测细胞的增殖情况,流式细胞仪检测细胞周期变化。结果成功构建了携带有STAT3基因的shRNA的重组质粒,PCR和测序证实重组质粒构建正确。3种重组质粒对大肠癌HT-29细胞STAT3的表达有明显的抑制作用。筛选出的最佳重组质粒转染大肠癌细胞后,细胞增殖能力明显减弱;细胞周期分析显示,G0/G1期细胞占（74.80±1.85）%,S期细胞占（15.72±2.26）%,与对照组差异显著（P〈0.01）。结论干扰STAT3基因的表达可以有效抑制大肠癌HT-29细胞的生长。     

表达PTEN同时沉默Livin基因载体的构建和鉴定

目的 构建表达PTEN基因、同时又沉默Livin基因的复合载体,探讨调控PTEN和Livin基因对胃癌细胞的影响.方法 根据GenBank中人DNA的PTEN基因(NM_000314)和Livin(NM_139317)基因的全长序列设计,分别构建出表达PTEN基因的真核表达载体pCL-neo-PTEN和沉默Livin基因的siRNA载体pRNAT-U6.1-Livin.切下pRNAT-U6.1-siLivin中的Livin siRNA单元,将其重组入pCL-neo-PTEN;鉴定得到表达PTEN同时沉默Livin基因的重组载体pCL-neo-PTEN-siLivin.脂质体包裹3个重组载体分别转染胃癌BGC823细胞,荧光定量RT-PCR和Western印迹检测胃癌BGC823细胞PTEN和Livin基因mRNA和蛋白表达情况.结果 经过限制性酶切和测序鉴定得到重组子pCL-neo-PTEN、pRNAT-U6.1-Livin和pCL-neo-PTEN-siLivin.转染pCL-neo-PTEN-siLivin的胃癌BGC823细胞中PTEN基因mRNA(0.897±0.112)和蛋白高水平表达,与对照组细胞(0.277±0.036)比较差异有统计学意义(P<0.05),与转染pCL-neo-PTEN的比较差异无统计学意义(P>0.05);转染pCL-neo-PTEN-siLivin的胃癌BGC823细胞中Livin基因mRNA(0.071±0.009)和蛋白表达抑制,与对照组细胞(0.338±0.044)差异有统计学意义(P<0.05),与转染pRNAT-U6.1-siLivin的差异无统计学意义(P>0.05).结论 成功构建出表达PTEN基因同时又沉默Livin基因的重组载体.     

靶向核仁素RNA干扰载体的构建与筛选

目的:设计靶向大鼠核仁素的RNAi序列,构建6个RNAi真核表达载体,采用转染工具细胞筛选有效靶点.方法:根据GenBank中的核仁素序列,设计特异性siRNA序列,将模板序列克隆至pGCsilencerTMU6/Neo/GFP质粒中,通过测序鉴定后,将重组质粒用脂质体转染技术导入H9C2细胞,荧光显微镜检测GFP表达以判断转染效率,Western-blot检测靶细胞中核仁素蛋白水平的表达,筛选有效干扰序列.结果:经测序鉴定,克隆的RNAi打靶序列完全正确,无碱基突变.转染H9C2细胞36 h后,荧光显微镜下可检测到GFP标记的核仁素蛋白的表达,转染效率达75%以上.Western-blot结果显示3号核仁素干扰质粒(Ncl-3)能明显下调H9C2细胞的核仁素表达.结论:成功构建靶向核仁素RNA干扰载体,并筛选出效能最优序列,为进一步相关研究奠定基础.     

MCP-1siRNA真核表达载体的构建及其对HKCMCP-1基因沉默效应的鉴定

目的构建单核细胞趋化蛋白1(MCP-1)特异性小分子干扰RNA(siRNA)的真核表达载体,研究siRNA对人肾小管上皮细胞(HKC)MCP-1基因的沉默作用。方法采用基因克隆技术,将合成的MCP-1特异性siRNA插入真核表达载体pRNAT-U6/Neo中,构建MCP-1 siRNA真核表达载体。将pRNAT-MCP-1质粒以脂质体法转染HKC,24 h后应用实时定量RT-PCR技术检测HKC内MCP-1 mRNA水平的表达情况。结果成功构建MCP-1siRNA真核表达载体,转染MCP-1 siRNA的HKC,24 h后HKC内MCP-1 mRNA水平表达明显降低,抑制效率达90%以上。结论构建的RNA干扰真核表达载体能够高效抑制HKC的MCP-1基因表达,为肾间质纤维化的防治研究奠定了实验基础。     

Effect of Survivin gene on bladder cancer cell growth in vivo

Objective To study the inhibitory effect of RNA interference targeting Survivin on bladder cancer cell T24 growth in vivo.Methods Survivin-targeting shRNA eukaryotic expression vector pRNAT-U6.1/neosurvivin was constructed and identified.Human bladder cancer cell T24 was transfected with pRNAT-U6.1/neosurvivin and then stable monoclonal cells were selected.The inhibitory effect of siRNA targeting Survivin on ectopic human bladder cancer was observed by intratumoral injection of siR-NA/liposome complex.[第一段]     

核干细胞因子基因siRNA表达载体的构建及鉴定

目的 构建针对核干细胞因子(NS)基因的小干扰RNA(siRNA)真核表达载体.方法 根据GenBartk提供的NS基因AY825265 mRNA序列及siRNA设计原则设计siRNA,筛选得到126-144 nt,199-217 nt和487-505 nt 3个19 bp片段为靶序列;合成带有BamHI、XhoI酶切位点的发夹结构寡核苷酸序列,经过退火,将此序列克隆至载体pRNAT-U6.1中构建重组表达载体;转化DH5α,提取质粒,应用PCR技术和测序方法鉴定重组克隆.转染入食管癌EC9706细胞,检测NS基因沉默情况.结果 PCR筛选得到3个目的片段的阳性重组克隆,测序证实重组表达载体中插入序列与设计一致.RT-PCR和Western blot检测显示构建的siRNA表达载体可显著降低EC9706细胞中NS mRNA和蛋白水平的表达.结论 成功构建出一组针对NS基因的siRNA表达载体,为下一步NS基因的RNA干扰研究鉴定了基础.     

bcr-abl融合基因特异性siRNA对K562细胞生物学特性的影响

目的 应用特异性siRNA(小干涉RNA)抑制慢性粒细胞白血病bcr-abl融合基因表达,观察其对K562细胞生物学特性的影响。方法 以慢性粒细胞白血病细胞系K562为研究对象,合成并转染针对K562细胞bcr-abl融合基因融合位点的21ntsiRNA,应用Western blot法检测bcr-abl融合基因的表达;^3H-TdR掺入法检测K562细胞的增殖活性;Annexin V-FITC／PI染色法检测K562细胞的存活状况;流式细胞仪法检测K562细胞周期变化以及联苯胺染色法检测K562细胞的分化状况;应用Western blot法检测凋亡相关蛋白Bcl-xL／Bax的表达。结果 (1)RNA干涉组：K562细胞bcr-abl融合基因的表达水平明显下降;(2)RNA干涉组的CPM值(每分钟脉冲数)在siRNA转染K562细胞第24h,48h,72h和96h均明显低于对照组(下降率依次为33．06％,52．25％,57．64％,70．87％),(3)RNA干涉组转染48h时有43．2％的K562细胞发生凋亡;(4)RNA干涉组：K562细胞凋亡相关蛋白Bcl-xL的表达水平下调,但Bax的表达无明显变化;(5)RNA干涉组：K562细胞联苯胺染色阳性比例增加,部分K562细胞向红系分化;(6)RNA干涉组K562细胞出现明显的G1期阻滞。结论 特异性siRNA分子可以显著抑制bcr-abl融合基因的表达,影响：K562细胞的基本生物学特性,最终导致K562细胞分化或凋亡。