膜表面核仁素对内毒素所致THP-1细胞炎症介质表达的影响

目的探讨THP-1细胞膜定位核仁素作为寡糖链受体在脂多糖所致炎症反应中的作用。方法采用间接免疫荧光、流式细胞术以及细胞膜蛋白免疫印迹等技术证实核仁素在人THP-1细胞膜表面表达。以无血清状态下脂多糖刺激THP-1细胞为炎症细胞模型，采用逆转录聚合酶链反应及酶联免疫吸附测定法等检测核仁素抗体对炎症介质肿瘤坏死因子α和白细胞介素1β的表达与分泌的影响。结果间接免疫荧光、流式细胞术以及免疫印迹证实核仁素可在人THP-1细胞膜表面表达。逆转录聚合酶链反应结果发现，在无血清条件下，500μg/L脂多糖刺激1h、2h、3h或4h后可以明显促进肿瘤坏死因子α和白细胞介素1βmRNA表达，而核仁素抗体处理1h后再用脂多糖刺激1h、2h、3h或4h，肿瘤坏死因子α和白细胞介素1βmRNA表达明显受到抑制。而先用正常IgG体处理1h后再用脂多糖刺激1h、2h、3h或4h，肿瘤坏死因子α和白细胞介素1βmRNA表达与单用脂多糖刺激水平相当。另外单用正常IgG或核仁素抗体处理1～4h，肿瘤坏死因子α和白细胞介素1βmRNA表达与对照组比较无差异。酶联免疫吸附测定法检测发现，核仁素抗体处理1h后能明显抑制脂多糖所致肿瘤坏死因子α和白细胞介素1β的分泌，而IgG则没有这种作用。结论THP-1细胞膜表面核仁素参与了脂多糖所致炎症反应，提示核仁素可能是脂多糖的一种新受体。     

大鼠压力负荷增加心肌肥厚模型中核仁素的表达

目的：探讨腹主动脉缩窄致压力负荷增加大鼠心肌肥厚模型中核仁素的表达情况。方法：采用体质量
180~220 g SD大鼠40只,随机分为假手术组和腹主动脉缩窄模型组,利用腹主动脉缩窄法制备压力负荷增加心肌肥
厚模型,分别于术后2周、4周观察心脏质量指数、左心室质量指数;采用RT-PCR检测心肌组织中-MHC mRNA的
表达;采用Western印迹检测心肌、脑、肾组织中核仁素的表达情况。结果：腹主动脉缩窄模型组4周以后心脏质量
指数、左心室质量指数较假手术组显著增加(P<0.01);4周以后心肌组织中-MHC mRNA的表达较假手术组显著升高
(P<0.05);2周以后心肌组织中核仁素蛋白的表达较假手术组显著升高(P<0.05),而在脑、肾组织中无明显升高。结论：
核仁素蛋白在大鼠压力负荷增加心肌肥厚模型中的表达上调,表明核仁素可能参与了压力负荷增加心肌肥厚的发生
发展。     

成人教育病理生理学分块讲座式教学改革初探

为了更好地激发成人医学教育的学生学习《病理生理学》的兴趣，提高他们的临床思维能力、实践能力和分析问题的能力，并增强其探索意识，中南大学基础医学院病理生理学系，在成人教育2006级专升本业余班病理生理学教学过程中实施了“分块讲座式教学”。本文就病理生理学“分块讲座式教学”的初步实践进行了调查分析，说明该项改革符合成人教育的特点，受到学生和教师的一致好评。     

靶向核仁素RNA干扰载体的构建与筛选

目的:设计靶向大鼠核仁素的RNAi序列,构建6个RNAi真核表达载体,采用转染工具细胞筛选有效靶点.方法:根据GenBank中的核仁素序列,设计特异性siRNA序列,将模板序列克隆至pGCsilencerTMU6/Neo/GFP质粒中,通过测序鉴定后,将重组质粒用脂质体转染技术导入H9C2细胞,荧光显微镜检测GFP表达以判断转染效率,Western-blot检测靶细胞中核仁素蛋白水平的表达,筛选有效干扰序列.结果:经测序鉴定,克隆的RNAi打靶序列完全正确,无碱基突变.转染H9C2细胞36 h后,荧光显微镜下可检测到GFP标记的核仁素蛋白的表达,转染效率达75%以上.Western-blot结果显示3号核仁素干扰质粒(Ncl-3)能明显下调H9C2细胞的核仁素表达.结论:成功构建靶向核仁素RNA干扰载体,并筛选出效能最优序列,为进一步相关研究奠定基础.     

核仁素对LPS诱导的白细胞介素1β释放的影响

目的: 探讨核仁素在脂多糖(LPS)所致炎症模型中的表达及其对LPS所致的白细胞介素1β(IL-1β)释放的影响。方法: 小鼠腹腔注射LPS(15 mg/kg)建立内毒素血症模型,LPS(500 μg/L)处理建立RAW264.7细胞炎症模型,采用免疫印迹观察核仁素在炎症模型中的表达。利用瞬时转染技术抑制或增加RAW264.7细胞内核仁素表达后,LPS处理,酶联免疫吸附实验(ELISA)检测细胞培养基中IL-1β的含量。结果: 在内毒素血症小鼠的肺组织和RAW264.7细胞炎症模型中,110 kD核仁素表达上调,80 kD核仁素片段表达减少。与转空载体对照组比较,核仁素过表达组LPS所致的IL-1β释放明显增加(P<0.05);与正常细胞组和随机寡核苷酸组比较,核仁素低表达组LPS所致的IL-1β释放明显减少(P<0.05)。结论: 在LPS所致的炎症模型中,110 kD核仁素表达上调, 80 kD核仁素片段表达减少;核仁素促进LPS所致的IL-1β释放。     

核仁素在糖尿病性心肌病中的表达

目的：探讨核仁素在糖尿病性心肌病中的表达情况。方法：实验分为对照组和II型糖尿病性心肌病模型组 (模型组);模型组采用高脂高糖饲料持续喂养(第5,6周于小鼠腹腔注射60 mg/kg链脲佐菌素)构建,第8周末测定小鼠 血糖,第20周末测定两组小鼠空腹血糖值并计算心脏质量与体质量的比值,观察心肌形态学病理改变,采用免疫组织 化学法和Western印迹检测心肌核仁素的表达水平。结果：糖尿病模型组小鼠较对照组空腹血糖值明显升高(P<0.05); 模型组小鼠心肌细胞肥大、排列紊乱,出现断裂及溶解;免疫组织化学染色及Western印迹显示模型组小鼠心肌核仁 素蛋白水平较对照组明显升高(P<0.05)。结论：核仁素可能在糖尿病性心肌病的发生和发展中起着一定的作用。     

稳定表达核仁素的H9C2细胞株的建立和鉴定

目的:建立稳定表达核仁素的H9C2大鼠心肌细胞株,为进一步研究核仁素在心肌细胞凋亡中的作用提供细胞模型.方法:将含有核仁素全长的质粒pCMV-Tag2B-Nuc用脂质体转染技术导入H9C2细胞,使核仁素在细胞内表达,用G418筛选出稳定表达核仁素的细胞株;用双酶切、DNA测序鉴定质粒,用RT-PCR及Western blot检测核仁素基因在靶细胞中的整合与表达.结果:经G418反复筛选的H9C2细胞株中,核仁素基因在mRNA及蛋白质水平表达均较野生型细胞及转空载体细胞升高.结论:用含核仁素全长的质粒转染H9C2大鼠心肌细胞,经筛选后可稳定表达核仁素.     

内环境系统CBL课改革后的教学效果调查分析

目的 调查内环境系统CBL课改革后的教学效果,为完善相关讨论课的教学方法并提高其教学质量提供参考依据。方法 以中南大学湘雅医学院2届八年制临床医学生190名和五年制临床医学卓越医师班学生60名为调查对象,对所实行的“课堂现场分段研读病例辩论赛式讨论”改革方案教学效果进行调查。调查表内容包括：对改革方案特点和优势的看法、学生喜爱支持这次改革的理由等。采用无记名问卷调查,运用Excel和SPSS17.0统计软件收集、处理数据,描述性分析计算各指标百分率。结果 ①学生认为这改革方案所具有的优势体现在以下几个方面：减轻学生负担78.5%、提高学生参与积极性85.4%、提高课堂讨论质量80.5%、增强学生的团结协作精神78.5%、扩大学生思考探索空间84.3%、该模式与临床诊疗过程接近84.0%;②学生喜爱支持这改革方案的主要理由有：减轻了学生负担83.4%、提高了课堂讨论质量72.4%、培养了学生挖掘临床信息的能力82.4%。结论 该讨论课改革方案,减轻了学生负担,提高了讨论课教学质量,深受学生欢迎,对其他各课程的讨论课开展也有积极的参考价值。     

热休克预处理抑制过氧化氢所致心肌细胞Smac的释放及细胞凋亡

目的 :探讨热休克预处理 (heatshockpretreatment,HS)对过氧化氢 (hydrogenperoxide ,H2 O2 )所致心肌细胞凋亡及促凋亡分子线粒体释放的第二种Caspase激活物 (thesecondmitochondria derivedactivatorofcaspases ,Smac)从线粒体释放的影响。方法 :①采用H2 O2 (0 .5mmol/L)导致心肌细胞凋亡 ;②采用热休克预处理 (4 2℃ ,1h ,恢复 12h)诱导热休克蛋白表达 ;③采用Hoechst荧光染色 ,观察细胞凋亡发生并计算凋亡核百分率 ;④采用cas pase活性定量检测及Western blotting观察caspase 3,9的活化 ;采用免疫荧光及Western blotting检测细胞成分分离后Smac从线粒体的释放。结果 :①H2 O2 处理 2h ,Smac从心肌细胞线粒体释放入胞浆 ;处理 4hcaspase 3,9活性升高 ,12h达高峰 ;处理 2 4h心肌细胞明显出现凋亡 ,凋亡核百分率明显升高 ;②热休克预处理可诱导心肌细胞中HSP90 ,HSP70及αB 晶状体蛋白的表达增高 ;抑制Smac释放、caspase 3,9的活化及细胞凋亡的发生。结论 :线粒体信号通路在H2 O2 所致的心肌细胞凋亡中发挥重要作用 ;热休克预处理通过抑制上述通路而减轻H2 O2 所致的细胞凋亡 ,其机制与其诱导热休克蛋白表达、阻断Smac从线粒体向胞浆释放、抑制caspase 3,9的活化有关。     

过氧化氢对K562细胞凋亡的影响

目的 :探讨活性氧对K5 6 2细胞凋亡的影响。方法 :用过氧化氢 (hydrogenperoxide ,H2 O2 )作用于对数生长期的K5 6 2细胞。结果 :Hoechst 332 5 8染色法观察到K5 6 2细胞明显凋亡 ;caspase活性定量测定及WesternBlotting检测显示caspase 3, 8, 9同时被激活。结论 :H2 O2 可诱导K5 6 2细胞凋亡 ,且通过同时激活线粒体途径和死亡受体途径起作用。