肝癌患者脂肪干细胞重编程为诱导多潜能干细胞

目的重编程肝癌患者来源的脂肪干细胞为诱导多潜能干细胞。方法包装携带Oct4、Sox2、Klf4、c-Myc基因的反转录病毒,将病毒感染脂肪干细胞并培养诱导后的细胞,采用碱性磷酸酶染色、定量PCR和原位免疫荧光实验鉴定诱导的克隆样细胞。结果诱导的克隆样细胞表达碱性磷酸酶,定量PCR证实克隆样细胞表达胚胎干细胞多能性基因,免疫荧光实验证实其表达Oct4和Sox2。结论肝癌患者来源的脂肪干细胞可高效重编程为诱导多潜能干细胞,且脂肪干细胞可作为培养诱导多潜能干细胞的滋养细胞,为提高成体细胞重编程效率和建立基于诱导多潜能干细胞的肝癌模型研究提供了平台。     

鼠星形胶质细胞重编程为诱导多潜能干细胞的研究

目的研究星形胶质细胞重编程为诱导多潜能(iPS)干细胞的可行性,为进一步研究iPS细胞诱导技术奠定基础。方法用分别含Oct4,Sox2,Klf4和c-myc因子的4种逆转录病毒载体病毒颗粒感染星形胶质细胞,获得iPS细胞并进行鉴定。结果感染后第28天具有胚胎干细胞形态的克隆出现,诱导效率为(0.015±0.005)%,且碱性磷酸酶(AP)染色及SSEA-1和Oct4免疫荧光染色均显阳性。结论星形胶质细胞可以重编程为iPS细胞,进一步证明了iPS细胞诱导技术的普遍适用性。     

Sox2、Klf4、Oct4、c-Myc基因编程脐带基质间充质细胞

目的 探讨利用Sox2、Klf4、Oct4、c-Myc基因将脐带基质间充质细胞（UMC）编程为多潜能干细胞（iPS）.方法 原代分离培养UMC细胞,包装生产逆转录病毒感染细胞,将感染后细胞接种到饲养层细胞培养,镜下观察细胞形态学变化.对编程后细胞进行碱性磷酸酶（AP）染色、检测细胞内源多能基因表达量和体内分化畸胎瘤实验.结果 原代获得UMC细胞,被编程细胞形态类似于胚胎干细胞,AP染色阳性,内源多能基因Oct4、Sox2、Nanog、Rex1表达量增高,体内分化为畸胎瘤.结论 利用Sox2、Klf4、Oct4、c-Myc基因可将UMC细胞编程为iPS细胞.     

利用piggyBac转座子构建小鼠诱导性多能干细胞及其鉴定

目的：利用 piggyBac 转座子载体携带鼠源 Oct4、Sox2、Klf4 和c-Myc 4 个核转录因子,重编程胎鼠成纤维细胞（MEFs）为诱导性多能干细胞（iPSCs）,并探讨其作用效果。方法：分离Oct4-GFP小鼠的 MEFs,将携带鼠源 Oct4、Sox2、Klf4、c-Myc等4个基因的piggyBac 转座子转入至MEFs;观察iPSCs克隆形成过程的形态表现;分析iPSCs染色体组成,评价iPSCs的核型变化。RT-PCR法检测小鼠iPSCs中胚胎干细胞（ESCs）相关基因Oct4、Nanog和FGF4的表达;免疫荧光、碱性磷酸酶染色和流式细胞术检测小鼠iPSCs中SSEA-1和Nanog蛋白表达。将iPSCs接种到NOD-SCID小鼠腹股沟进行畸胎瘤实验,4周后取畸胎瘤制备组织切片进行HE染色,观察组织分化情况。结果：通过piggyBac转座子成功构建iPSCs,其具有正常的核型,形态与小鼠ESCs相似,克隆边界清晰、呈圆形或卵圆形,克隆内细胞致密、核大。RT-PCR 和免疫荧光染色分析,iPSCs可表达多能性基因和蛋白（Oct4、Sox2、Kif4和c-Myc）。在免疫缺陷小鼠体内接种iPSCs可形成具有3个胚层组织的畸胎瘤。结论：以piggyBac转座子为载体将Oct4、Sox2、Klf4 和c-Myc 4个转录因子基因导入MEFs,可以成功诱导MEFs成为具有ESCs特征的正常核型iPSCs。     

新生鼠卵巢中卵泡膜干细胞的分离培养及鉴定

目的分离、培养、鉴定小鼠卵巢组织中的卵泡膜干细胞。方法取2～4 d新生鼠卵巢组织,胶原酶、胰蛋白酶联合消化获得单个细胞悬液,GSM-K无血清培养基培养细胞观察细胞球形成;RT-PCR法检测膜基因Ptch1和透明带基因Zp1、Zp2、Zp3的表达,免疫荧光法检测干细胞标记物碱性磷酸酶(AKP)、Oct4、膜细胞标记物Gli3与颗粒细胞标记物FSHR的表达;体外诱导分化,RT-PCR法检测分化标记物Gli2,油红O染色后观察。结果 GSM-K中培养2 d形成细胞球;Ptch1、AKP、Oct4和Gli3表达阳性,不表达Zp1、Zp2、Zp3和FSHR;诱导分化后,Gli2表达,油红O染色阳性。结论新生鼠卵巢组织中存在卵泡膜干细胞,且具有分化潜能。     

Isolation and identification of theca stem cells from neonatal mouse ovaries

目的 分离、培养、鉴定小鼠卵巢组织中的卵泡膜干细胞.方法 取2～4 d新生鼠卵巢组织,胶原酶、胰蛋白酶联合消化获得单个细胞悬液,GSM-K无血清培养基培养细胞观察细胞球形成;RT-PCR法检测膜基因Ptch1和透明带基因Zp1、Zp2、Zp3的表达,免疫荧光法检测干细胞标记物碱性磷酸酶(AKP)、Oct4、膜细胞标记物Gli3与颗粒细胞标记物FSHR的表达;体外诱导分化,RT-PCR法检测分化标记物Gli2,油红O染色后观察.结果 GSM-K中培养2 d形成细胞球;Ptch1、AKP、Oct4和Gli3表达阳性,不表达Zp1、Zp2、Zp3和FSHR;诱导分化后,Gli2表达,油红O染色阳性.结论 新生鼠卵巢组织中存在卵泡膜干细胞,且具有分化潜能.     

诱导多能干细胞研究进展

通过反转录病毒载体系统,在小鼠和人高度分化细胞中表达干细胞因子Oct4,Sox2,Klf4和(或)c-Myc等基因,再经过干细胞标志因子Nanog等的筛选,可以获得与ES细胞特性十分近似的诱导多能干细胞系(iPS).本文主要综述了诱导多能干细胞最近的研究现状,并对诱导重编程的机制和诱导多能干细胞系的临床应用前景进行了讨论.     

逆转录病毒方法建立小鼠诱导性多能干细胞的实验研究

[目的]采用逆转录病毒法转染P2代ICR的小鼠胚胎成纤维细胞(mouse embryonic fibroblast,MEF),建立小鼠诱导性多能干细胞(inducedpluripotent stem cell,iPS cell,iPS细胞)。[方法]本实验采用293T细胞进行逆转录病毒包装,将分别携带来源于人的Oct3/4、Sox2、c-Myc、Klf4转录因子的4种逆转录病毒液共转染ICR小鼠的MEF,并在转染过程中添加维生素C、丙戊酸钠来提高小鼠iPS细胞的诱导效率,通过碱性磷酸酶染色、RT-PCR方法检测建立的细胞株。[结果]转染的MEF在1周左右时间出现明显克隆,克隆传代的细胞经碱性磷酸酶染色呈紫红色,RT-PCR检测结果显示细胞株中的Oct3/4、Sox2、c-Myc、Klf4、Nanog 5种多能性相关的基因都得到明显表达。[结论]转染的MEF在1周左右时间出现明显克隆,小鼠iPS细胞的一些表面标志如碱性磷酸酶得到表达,Oct3/4、Sox2、c-Myc、Klf4、Nanog 5种多能性相关基因也都得到明显表达,表明已经建立小鼠iPS细胞。     

急性肺损伤患者诱导性多能干细胞系的建立

目的利用急性肺损伤患者皮肤成纤维细胞构建诱导性多能干细胞（induced pluripotent stem cells, iPSCs）系。方法采用
慢病毒介导逆转录的方法,将含有Oct4、Sox2、Klf4和Nanog四个因子的混合慢病毒转染人皮肤成纤维细胞,诱导出胚胎干细胞
样克隆。根据人胚胎干细胞的特性,利用AP染色、实时荧光定量PCR（RT-PCR）技术、免疫荧光、畸胎瘤形成实验对获得的iPS
细胞进行鉴定。结果获得的iPS细胞镜下观察呈典型的ES样克隆状生长,圆形或椭圆形,与饲养层细胞分界清楚;AP染色阳
性,RT-PCR及免疫荧光检测iPS细胞高表达人胚胎干细胞标志性基因及蛋白,移植到免疫缺陷鼠体内能够形成向三胚层分化的
畸胎瘤。结论成功建立了急性肺损伤患者iPS细胞系,可为急性肺损伤的发病机制研究和临床药物筛选提供良好的细胞模型。
     

Oct4介导小鼠原代肝细胞去分化研究

目的 通过Oct4 介导小鼠肝细胞去分化为Sox17 阳性细胞,探索肝胰重编程新途径。方法 构建慢病毒载体pWPTOct4,包装和浓缩病毒;改良两步胶原酶灌流法分离小鼠原代肝细胞;Oct4-慢病毒浓缩液感染小鼠原代肝细胞,RT-PCR检测肝细胞及内胚层转录因子的表达。结果 通过酶切、测序鉴定,证实成功构建包含Oct4 慢病毒表达载体。感染肝细胞后,外源性Oct4 出现表达,成熟的肝细胞转录因子（Alb、Ttr、Afp） 表达下降,并表达内胚层早期标记物Sox17,而没有Oct4、Nanog 及Sox2 等多能性基因的内源性表达。结论 Oct4 介导肝细胞去分化,并出现Sox17 阳性细胞,为进一步将Sox17 阳性细胞分化为胰岛素产生细胞奠定基础。     

4种全能性基因转入人胚胎成纤维细胞诱导多能性干细胞系的建立及其鉴定

目的：利用人类胚胎成纤维细胞（human embryonic fibroblast cells,hEFs）获得诱导性多能干细胞（induced pluripotent stem cells,iPSCs）系并对其全能性进行鉴定。方法：本研究采用慢病毒感染的方法将含有Oct4,Sox2,Nanog和Lin28全能性基因的慢病毒颗粒转导hEFs,获得iPSCs,并对其进行碱性磷酸酶（alkaline phosphatase,AKP）染色,以及检测表面标记,端粒酶活性,EB分化和畸胎瘤形成等,同时进行核型分析以及短串联重复序列（short tandem repeat,STR）分析。结果：所获得的iPSCs表达多能性细胞的表面标记,具有高的端粒酶活性,可在体内体外向内中外三胚层分化,与hESCs相似。经STR分析证实,iPSCs确实来源于hEFs而非胚胎干细胞的污染。结论：4种全能性基因转入hEFs可诱导获得与胚胎干细胞相似的iPSCs,有助于进一步的表观遗传学重编程以及干细胞多能性维持的研究。     

4种全能性基因转入人胚胎成纤维细胞诱导 多能性干细胞系的建立及其鉴定

目的：利用人类胚胎成纤维细胞(human embryonic fibroblast cells, hEFs)获得诱导性多能干细胞(induced pluripotent stem cells, iPSCs)系并对其全能性进行鉴定。方法：本研究采用慢病毒感染的方法将含有Oct4,Sox2,Nanog和Lin28全能性基因的慢病毒颗粒转导hEFs,获得iPSCs,并对其进行碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,AKP)染色,以及检测表面标记,端粒酶活性,EB分化和畸胎瘤形成等,同时进行核型分析以及短串联重复序列(short tandem repeat,STR)分析。结果：所获得的iPSCs表达多能性细胞的表面标记,具有高的端粒酶活性,可在体内体外向内中外三胚层分化,与hESCs相似。经STR分析证实,iPSCs确实来源于hEFs而非胚胎干细胞的污染。结论：4种全能性基因转入hEFs可诱导获得与胚胎干细胞相似的iPSCs,有助于进一步的表观遗传学重编程以及干细胞多能性维持的研究。     

成体细胞逆向分化的调控因子

目前成体细胞逆向分化的研究比较热。其中利用逆转录病毒载体携带诱导因子Oct4、Sox2、c-Myc、Klf4或Oct4、SOX2、Nanog、Lin28可以启动成纤维细胞发生重排逆向分化为胚胎样干细胞。成纤维细胞的逆向分化是一个很复杂的过程,这些诱导因子有的是促进成纤维细胞逆向分化的,有的是抑制成纤维细胞逆向分化的。总之在不同的时期这些诱导因子各自发挥着不同的作用,从而使成纤维细胞逆向分化。本文就成体细胞逆向分化的调控因子研究现状及展望作一综述。     

成体细胞逆向分化的调控因子

目前成体细胞逆向分化的研究比较热。其中利用逆转录病毒载体携带诱导因子Oct4、Sox2、c-Myc、Klf4或Oct4、SOX2、Nanog、Lin28可以启动成纤维细胞发生重排逆向分化为胚胎样干细胞。成纤维细胞的逆向分化是一个很复杂的过程,这些诱导因子有的是促进成纤维细胞逆向分化的,有的是抑制成纤维细胞逆向分化的。总之在不同的时期这些诱导因子各自发挥着不同的作用,从而使成纤维细胞逆向分化。本文就成体细胞逆向分化的调控因子研究现状及展望作一综述。