重编程肝癌细胞系Huh7为多潜能干细胞样细胞

[摘要] 目的 重编程肝癌细胞系Huh7细胞为多潜能干细胞。方法 包装携带有Oct4、Sox2、Nanog、Lin28基因的慢病毒,将包装好的病毒共感染Huh7细胞,采用碱性磷酸酶染色、免疫荧光、实时定量PCR,免疫组织化学等方法对诱导出的多潜能干细胞样克隆细胞进行鉴定。结果 Huh7细胞被重编程为多潜能干细胞样细胞,碱性磷酸酶染色呈阳性,免疫荧光实验证明其表达多潜能因子,Oct4与TRA-1-60,qPCR实验证明其高水平表达内源性的多潜能相关基因及干细胞特异的microRNAs,体内分化实验结果表明iHuh7可以形成畸胎瘤。结论 通过携带四种多潜能因子的慢病毒介导的重编程, Huh7细胞可以被诱导为多潜能干细胞样细胞。     

鼠星形胶质细胞重编程为诱导多潜能干细胞的研究

目的研究星形胶质细胞重编程为诱导多潜能(iPS)干细胞的可行性,为进一步研究iPS细胞诱导技术奠定基础。方法用分别含Oct4,Sox2,Klf4和c-myc因子的4种逆转录病毒载体病毒颗粒感染星形胶质细胞,获得iPS细胞并进行鉴定。结果感染后第28天具有胚胎干细胞形态的克隆出现,诱导效率为(0.015±0.005)%,且碱性磷酸酶(AP)染色及SSEA-1和Oct4免疫荧光染色均显阳性。结论星形胶质细胞可以重编程为iPS细胞,进一步证明了iPS细胞诱导技术的普遍适用性。     

Sox2、Klf4、Oct4、c-Myc基因编程脐带基质间充质细胞

目的 探讨利用Sox2、Klf4、Oct4、c-Myc基因将脐带基质间充质细胞（UMC）编程为多潜能干细胞（iPS）.方法 原代分离培养UMC细胞,包装生产逆转录病毒感染细胞,将感染后细胞接种到饲养层细胞培养,镜下观察细胞形态学变化.对编程后细胞进行碱性磷酸酶（AP）染色、检测细胞内源多能基因表达量和体内分化畸胎瘤实验.结果 原代获得UMC细胞,被编程细胞形态类似于胚胎干细胞,AP染色阳性,内源多能基因Oct4、Sox2、Nanog、Rex1表达量增高,体内分化为畸胎瘤.结论 利用Sox2、Klf4、Oct4、c-Myc基因可将UMC细胞编程为iPS细胞.     

利用piggyBac转座子构建小鼠诱导性多能干细胞及其鉴定

目的：利用 piggyBac 转座子载体携带鼠源 Oct4、Sox2、Klf4 和c-Myc 4 个核转录因子,重编程胎鼠成纤维细胞（MEFs）为诱导性多能干细胞（iPSCs）,并探讨其作用效果。方法：分离Oct4-GFP小鼠的 MEFs,将携带鼠源 Oct4、Sox2、Klf4、c-Myc等4个基因的piggyBac 转座子转入至MEFs;观察iPSCs克隆形成过程的形态表现;分析iPSCs染色体组成,评价iPSCs的核型变化。RT-PCR法检测小鼠iPSCs中胚胎干细胞（ESCs）相关基因Oct4、Nanog和FGF4的表达;免疫荧光、碱性磷酸酶染色和流式细胞术检测小鼠iPSCs中SSEA-1和Nanog蛋白表达。将iPSCs接种到NOD-SCID小鼠腹股沟进行畸胎瘤实验,4周后取畸胎瘤制备组织切片进行HE染色,观察组织分化情况。结果：通过piggyBac转座子成功构建iPSCs,其具有正常的核型,形态与小鼠ESCs相似,克隆边界清晰、呈圆形或卵圆形,克隆内细胞致密、核大。RT-PCR 和免疫荧光染色分析,iPSCs可表达多能性基因和蛋白（Oct4、Sox2、Kif4和c-Myc）。在免疫缺陷小鼠体内接种iPSCs可形成具有3个胚层组织的畸胎瘤。结论：以piggyBac转座子为载体将Oct4、Sox2、Klf4 和c-Myc 4个转录因子基因导入MEFs,可以成功诱导MEFs成为具有ESCs特征的正常核型iPSCs。     

不同迁移能力肝癌细胞中干细胞相关基因Nanog、Sox2和Oct4的表达

目的:观察Nanog、Sox2和Oct4干细胞相关基因在四株不同迁移能力肝癌细胞系中的表达.方法:常规细胞培养无迁移能力的HepG2细胞、低迁移能力的MHCC97-L细胞、中迁移能力的LM3细胞及高迁移能力的MHCC97-H细胞,采用免疫荧光组织化学方法观察四株肝癌细胞系中肝癌干细胞相关基因Nanog、Sox2和Oct4的表达.结果:干细胞相关基因Nanog、Oct4和Sox2在四株迁移能力不同的肝癌细胞系中不同程度表达,且在细胞膜、细胞核、细胞浆中的表达量亦不同;Nanog在细胞核表达,并随着细胞迁移能力增强而呈递增趋势;Sox2在不同迁移能力肿瘤细胞中表达无明显规律,而Oct4在高迁移能力肝癌细胞的细胞浆及核中高表达.结论:Nanog、Sox2和Oct4在不同迁移能力肝癌细胞系中均有表达,但无明显规律,推测肝癌干细胞与肝癌的发生可能有密切关系.     

诱导多能干细胞研究进展

通过反转录病毒载体系统,在小鼠和人高度分化细胞中表达干细胞因子Oct4,Sox2,Klf4和(或)c-Myc等基因,再经过干细胞标志因子Nanog等的筛选,可以获得与ES细胞特性十分近似的诱导多能干细胞系(iPS).本文主要综述了诱导多能干细胞最近的研究现状,并对诱导重编程的机制和诱导多能干细胞系的临床应用前景进行了讨论.     

小鼠骨髓间充质干细胞、骨髓单核细胞和胚胎成纤维细胞重编程为诱导性多能干细胞的效率比较

目的比较小鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)、小鼠骨髓单核细胞(BM-MNCs)和小鼠胚胎成纤维细胞(MEFs)重编程为诱导性多能干细胞(iPS细胞)的效率。方法用慢病毒LV-ef1a-mOct4-IRES-EGFP、LV-ef1a-mSox2-IRES-EGFP、LV-ef1a-mKlf4-IRES-EGFP和LV-ef1a-mc-Myc-IRES-EGFP感染BMSCs、BM-MNCs和MEFs,通过计算碱性磷酸酶染色阳性克隆数比较这3种细胞重编程为iPS细胞的效率。用胚胎干细胞表面标记检测、胚胎干细胞内源基因检测、拟胚体形成实验和畸胎瘤形成实验验证重编程获得的iPS细胞的多能性。结果起源于小鼠BMSCs、BM-MNCs及MEFs的3种iPS细胞均能形成边缘光整的致密克隆,可表达干性基因Nanog、Rex-1、SSEA-1,并能在体内外分化为三胚层组织。但是BMSCs来源的碱性磷酸酶阳性克隆数低于BM-MNCs和MEFs来源的克隆数。结论小鼠BMSCs、BM-MNCs及MEFs均可重编程为iPS细胞,但BMSCs重编程为iPS细胞的效率低于BM-MNCs和MEFs。     

新生鼠卵巢中卵泡膜干细胞的分离培养及鉴定

目的分离、培养、鉴定小鼠卵巢组织中的卵泡膜干细胞。方法取2～4 d新生鼠卵巢组织,胶原酶、胰蛋白酶联合消化获得单个细胞悬液,GSM-K无血清培养基培养细胞观察细胞球形成;RT-PCR法检测膜基因Ptch1和透明带基因Zp1、Zp2、Zp3的表达,免疫荧光法检测干细胞标记物碱性磷酸酶(AKP)、Oct4、膜细胞标记物Gli3与颗粒细胞标记物FSHR的表达;体外诱导分化,RT-PCR法检测分化标记物Gli2,油红O染色后观察。结果 GSM-K中培养2 d形成细胞球;Ptch1、AKP、Oct4和Gli3表达阳性,不表达Zp1、Zp2、Zp3和FSHR;诱导分化后,Gli2表达,油红O染色阳性。结论新生鼠卵巢组织中存在卵泡膜干细胞,且具有分化潜能。     

Oct4及Wnt/β-Catenin在肝癌中的表达及相互作用

目的 探讨干细胞相关基因Oct4与Wnt/β-Catenin信号转导通路在人肝癌组织及肝癌细胞系中的表达及相互作用.方法 选取肝癌组织、癌旁组织及正常肝组织,采用免疫组化SP法检测其Oct4的表达;RT-PCR法及实时荧光定量PCR检测Oct4、Wnt5b、β-Catenin的mRNA表达.SiRNA-Oct4 沉默人肝癌HepG2细胞Oct4的表达后,以实时荧光定量PCR检测Oct4、Sox2、Nanog、β-Catenin等干细胞相关基因的表达变化.结果 Oct4在肝癌组织和癌旁组织中均有表达,正常肝脏组织几乎未发现明显的Oct4表达;实时荧光定量PCR发现Oct4和β-Catenin在癌组织内表达最高,癌旁次之,正常肝最低,而Wnt5b却相反.使用SiRNA-Oct4 沉默人肝癌HepG2细胞Oct4后,Oct4表达明显下调,β-Catenin、Sox2、Nanog表达亦下调,与Oct4呈正相关关系,而Wnt5b表达却上调,与Oct4呈负相关关系.结论 Oct4在肝癌组织中高表达,且为肝癌发生过程的早期事件;Oct4及Wnt/β-Catenin在肝癌中存在一定的相互作用.     

逆转录病毒方法建立小鼠诱导性多能干细胞的实验研究

[目的]采用逆转录病毒法转染P2代ICR的小鼠胚胎成纤维细胞(mouse embryonic fibroblast,MEF),建立小鼠诱导性多能干细胞(inducedpluripotent stem cell,iPS cell,iPS细胞)。[方法]本实验采用293T细胞进行逆转录病毒包装,将分别携带来源于人的Oct3/4、Sox2、c-Myc、Klf4转录因子的4种逆转录病毒液共转染ICR小鼠的MEF,并在转染过程中添加维生素C、丙戊酸钠来提高小鼠iPS细胞的诱导效率,通过碱性磷酸酶染色、RT-PCR方法检测建立的细胞株。[结果]转染的MEF在1周左右时间出现明显克隆,克隆传代的细胞经碱性磷酸酶染色呈紫红色,RT-PCR检测结果显示细胞株中的Oct3/4、Sox2、c-Myc、Klf4、Nanog 5种多能性相关的基因都得到明显表达。[结论]转染的MEF在1周左右时间出现明显克隆,小鼠iPS细胞的一些表面标志如碱性磷酸酶得到表达,Oct3/4、Sox2、c-Myc、Klf4、Nanog 5种多能性相关基因也都得到明显表达,表明已经建立小鼠iPS细胞。     

急性肺损伤患者诱导性多能干细胞系的建立

目的利用急性肺损伤患者皮肤成纤维细胞构建诱导性多能干细胞（induced pluripotent stem cells, iPSCs）系。方法采用
慢病毒介导逆转录的方法,将含有Oct4、Sox2、Klf4和Nanog四个因子的混合慢病毒转染人皮肤成纤维细胞,诱导出胚胎干细胞
样克隆。根据人胚胎干细胞的特性,利用AP染色、实时荧光定量PCR（RT-PCR）技术、免疫荧光、畸胎瘤形成实验对获得的iPS
细胞进行鉴定。结果获得的iPS细胞镜下观察呈典型的ES样克隆状生长,圆形或椭圆形,与饲养层细胞分界清楚;AP染色阳
性,RT-PCR及免疫荧光检测iPS细胞高表达人胚胎干细胞标志性基因及蛋白,移植到免疫缺陷鼠体内能够形成向三胚层分化的
畸胎瘤。结论成功建立了急性肺损伤患者iPS细胞系,可为急性肺损伤的发病机制研究和临床药物筛选提供良好的细胞模型。
     

将成人神经祖细胞重编程为诱导多能干细胞

Since an effective method for generating human neural precursor (NP) cells induced iPS cells can offer us a promising tool for studying human brain diseases, here we report direct reprogramming of adult human NP cells into iPS cells by retroviral transduction using four defined factors. NP cells were successfully isolated and cultured from the hippocampus tissue of epilepsy patients. When combined with four factors (Oct3/4, Sox2, Klf4, and c-Myc), iPS cell colonies were successfully obtained. Morphology, gene expression, and epigenetic status confirmed that these hNP-derived iPS cells exhibited ESC-like properties, including the ability to differentiate into all three germ layers both in vitro and in teratomas. Hence, our optimized method would be useful for generating human iPS cells from hNP cells and provide an important tool for studying neural system diseases.     

诱导性建立多能干细胞系

目的建立多能干细胞系,并鉴定其是否具有正常于细胞的特性。方法将原代皮肤标本用胶原酶消化处理,利用成纤维细胞培养基进行培养,然后感染病毒。对挑选的人成体细胞来源的iPS克隆进行扩大培养,并对克隆进行免疫荧光检测和lit-PCR检测,确定表达的分子标志,采用体外三胚层分化来鉴定其生物学特性。结果所获得的iPS细胞经鉴定具有碱性磷酸酶活性。并表达Nanog、SSEA-4、Sox2、TRA-1-60等干细胞特异标记物,可形成拟胚体并在体内外可以分化为三胚层的细胞类型。结论成功建立了iPS细胞系,为今后的研究提供了良好的细胞模型。     

兔子宫内膜干细胞的鉴定

目的:研究兔子宫内膜是否存在干细胞?方法:流式细胞术检测兔子宫内膜中上皮细胞及间质细胞的特异性标记分子,干细胞培养基培养出富含干细胞的集落,运用RT-PCR方法检测分化前后相关分子的表达,MTT法检测集落细胞分化前后增殖能力变化,流式细胞术检测分化前后的相关分子表达变化及细胞的凋亡情况?结果:兔子宫内膜存在上皮细胞及间质细胞两种细胞,干细胞培养基可培养出富含干细胞的集落,且分化前的细胞具有更高的增殖潜能,表现出更多的干细胞源性,具有更低的细胞凋亡比例?结论:兔子宫内膜存在富含干细胞的集落,提示存在子宫内膜干细胞?     

胚胎干细胞或诱导性全能干细胞自我更新和分化机制研究进展

“211工程”三期建设遗传发育与生殖医学重点学科建设的子项目——胚胎干细胞或诱导性全能干细胞定向分化机制的研究,在2008-2011年建立了着床后人胚胎早期发育的全基因组表达谱式;揭示了calcineurin/NFAT信号通路对细胞谱系决定的调控机制;揭示以Oct4为核心的胚胎干细胞命运决定的分子调控机制,其中包括发现并系统研究了对胚胎干细胞自我更新起重要作用的转录因子Oct4的蛋白质翻译后修饰;揭示Oct4的重要合作蛋白Sox2的蛋白质翻译后修饰及在胚胎干细胞中的作用;发现共激活因子p300直接调控胚胎干细胞中Nanog的表达及调控机制;发现Oct4新的下游基因Stk40并揭示Stk40在胚胎干细胞中的功能及作用机制;首次提出核仁蛋白在胚胎干细胞自我更新维持中的重要作用.2011年“胚胎干细胞及早期胚胎发育的分子调控机制研究”项目获得教育部高等学校科学研究优秀成果奖——自然科学奖二等奖.