肝癌患者脂肪干细胞重编程为诱导多潜能干细胞

目的重编程肝癌患者来源的脂肪干细胞为诱导多潜能干细胞。方法包装携带Oct4、Sox2、Klf4、c-Myc基因的反转录病毒,将病毒感染脂肪干细胞并培养诱导后的细胞,采用碱性磷酸酶染色、定量PCR和原位免疫荧光实验鉴定诱导的克隆样细胞。结果诱导的克隆样细胞表达碱性磷酸酶,定量PCR证实克隆样细胞表达胚胎干细胞多能性基因,免疫荧光实验证实其表达Oct4和Sox2。结论肝癌患者来源的脂肪干细胞可高效重编程为诱导多潜能干细胞,且脂肪干细胞可作为培养诱导多潜能干细胞的滋养细胞,为提高成体细胞重编程效率和建立基于诱导多潜能干细胞的肝癌模型研究提供了平台。     

重编程肝癌细胞系Huh7为多潜能干细胞样细胞

[摘要] 目的 重编程肝癌细胞系Huh7细胞为多潜能干细胞。方法 包装携带有Oct4、Sox2、Nanog、Lin28基因的慢病毒,将包装好的病毒共感染Huh7细胞,采用碱性磷酸酶染色、免疫荧光、实时定量PCR,免疫组织化学等方法对诱导出的多潜能干细胞样克隆细胞进行鉴定。结果 Huh7细胞被重编程为多潜能干细胞样细胞,碱性磷酸酶染色呈阳性,免疫荧光实验证明其表达多潜能因子,Oct4与TRA-1-60,qPCR实验证明其高水平表达内源性的多潜能相关基因及干细胞特异的microRNAs,体内分化实验结果表明iHuh7可以形成畸胎瘤。结论 通过携带四种多潜能因子的慢病毒介导的重编程, Huh7细胞可以被诱导为多潜能干细胞样细胞。     

星形胶质细胞诱导神经干细胞定向分化试验研究

目的 研究新生SD大鼠星形胶质细胞培养上清液对神经干细胞(neural stem cells，NSCS)体外定向分化的影响，探讨神经干细胞分化条件。方法 收集新生和成年SD大鼠星形胶质细胞培养的上清液，以1：3比例同DMEM／F12培基混合，分别对胎鼠来源的神经干细胞进行诱导分化，倒置相差显微境下观察细胞的生长情况。并采用免疫荧光检测方法对分化细胞鉴定和计数。结果 新生鼠星形胶质细胞培养上清液与DMEM／F12的混合培基诱导神经干细胞分化为神经元的比例明显提高。结论 新生鼠星形神经胶质细胞能促使神经干细胞向神经元方向分化。     

两种重编程系统诱导人牙源性多潜能干细胞的对比研究

目的：对比研究两种人牙源性多潜能干细胞重编程体系的特点。方法分别利用 STEMCCA 慢病毒／饲养层和仙台病毒／基质胶两种重编程系统,将人根尖乳头干细胞重编程为 iPS 细胞,比较两种方法的诱导效率、诱导工作量、iPS 细胞非整倍体核型比例、外源性基因消除难易程度等情况。结果 STEMCCA 重编程体系需要制备饲养层细胞 MEF,重编程效率约为0．1％,后期经 Cre-Loxp 酶切技术可得到无外源性转录基因的 iPS 细胞。仙台病毒重编程体系为无饲养层培养,基质胶制备方便、标准统一,重编程效率约为0．7％,明显高于 STEMCCA 系统（P ＜0．05）,外源性病毒和转录基因经自然传代后逐渐消除。结论与 STEMCCA 系统相比,仙台病毒／基质胶体系更适于人牙源性 iPS 细胞的诱导。     

多基因修饰小鼠诱导多潜能干细胞分化为胰岛素分泌细胞

目的观测胰岛素转录关键调控因子胰腺十二指肠同源框蛋白1(PDX-1)、神经分化因子1(NeuroD1)及肌腱膜纤维肉瘤癌基因同系物A(MafA)对小鼠诱导多潜能干细胞(iPS细胞)分化为胰岛素分泌细胞的作用。方法筛选鉴定小鼠胚胎成纤维细胞(MEFs)重编程的iPS细胞。以重组腺病毒Ad-mPDX-1-IRES-GFP、Ad-mNeuroD1-IRES-GFP、Ad-mMafA-IRES-GFP联合感染小鼠iPS细胞,体外培养后以RT-PCR检测胰岛B细胞功能基因表达;免疫荧光检测胰岛素蛋白表达及定位;ELISA检测不同糖浓度(0、5、10、20、30、40mmol/L)下胰岛素的分泌量。结果起源于MEFs的iPS细胞能形成边缘光整的致密克隆,表达干性基因Nanog、Rex-1、SSEA-1,并能在体内外分化为三胚层组织,显示MEFs被成功地重编程为iPS细胞。Ad-PDX-1-IRES-GFP、Ad-mNeuroD-IRES-GFP、Ad-mMafA-IRES-GFP感染的小鼠iPS细胞能分化为胰岛类B细胞,RT-PCR结果显示其胰岛B细胞功能基因的表达与小鼠胰岛B细胞株MIN6相似。免疫荧光检测可见胰岛类B细胞内有胰岛素表达。ELISA检测结果显示胰岛类B细胞对不同浓度葡萄糖有较好的反应性。结论胰岛素转录关键调控因子PDX-1、NeuroD1和MafA三者能协同作用,使小鼠iPS细胞分化为具有显著胰岛素合成和分泌能力的胰岛素分泌细胞。     

星形胶质细胞-神经元转化体内诱导研究进展

星形胶质细胞-神经元转化（星元转化）是21世纪神经科学的重要发现。星形胶质细胞在胶质细胞中数量最多，与神经元起源于相同的前体细胞，其向神经元转化的潜能为以神经元受损或丢失为特征的各类神经系统疾病的治疗带来新的希望。体外星元转化已有众多成功的实验，而体内星元转化的探索刚刚起步。现已发现可用转录因子、药物、MicroRNA等在模型动物体内诱导星元转化，阿尔茨海默病、脊髓损伤、局灶性中风、帕金森病等病理情况可诱发星元转化。对星形胶质细胞在正常及有关疾病模型动物体内转化为神经元的研究现状进行系统阐述，对星形胶质细胞重编程、向神经元转化并补充整合到受损的神经环路中的可能机制进行梳理。     

星形胶质细胞-神经元转化体内诱导研究进展

星形胶质细胞-神经元转化(星元转化)是21世纪神经科学的重要发现.星形胶质细胞在胶质细胞中数量最多,与神经元起源于相同的前体细胞,其向神经元转化的潜能为以神经元受损或丢失为特征的各类神经系统疾病的治疗带来新的希望.体外星元转化已有众多成功的实验,而体内星元转化的探索刚刚起步.现己发现可用转录因子、药物、MicroRNA...     

诱导多潜能干细胞及在神经系统病变中细胞治疗研究进展

<正>选择合适的种子细胞一直是组织工程及细胞治疗中困扰人们的难题。目前已能得到并进行研究的干细胞主要包括胚胎干细胞(embryonic stem cells,ESCs)和成体干细胞。成体干细胞又按种类不同分为神经干细胞、骨髓间充质干细胞、造血干细胞、表皮     

bFGF对神经干细胞分化为星形胶质细胞的影响

 目的 观察碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)对大鼠脊髓来源神经干细胞分化形成星形胶质细胞亚型的影响。方法：悬浮培养法培养大鼠脊髓来源的神经干细胞,形成神经球后,以免疫荧光法鉴定神经干细胞。把神经干细胞分为A、B两组,A组加入血清,B组加入血清和bFGF,分化培养7 d后,GFAP抗体标记星形胶质细胞,观察其各亚型的比率和形态特点。结果：神经干细胞分化第7d,A组和B组均形成4种亚型星形胶质细胞,分别为胞体延长型,扁平多角形,星形和双极型。B组中双极型星形胶质细胞的突起长度明显超过A组。结论：bFGF可以显著促进脊髓来源神经干细胞分化成的双极型星形胶质细胞的突起生长。     

瘦素对STAT3信号的调节在小鼠神经干细胞向星形胶质细胞分化中的作用

目的 研究瘦素（Leptin）对神经干细胞的诱导分化作用并分析其分子机制。 方法 将胚胎小鼠神经干细胞与Leptin共培养,设立Leptin浓度梯度（0、0.05、0.2、0.5、1、2 mg/L）,分析Leptin对神经干细胞的诱导分化作用,并用Janus蛋白酪氨酸激酶2/信号转导和转录激活子3（Jak-STAT3）信号通路与磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B (PI3k-Akt)信号通路抑制剂（10 μmol/L）处理细胞,利用Western blot及免疫荧光检测下游蛋白分子非磷酸化STAT3、磷酸化STAT3、非磷酸化Akt、磷酸化Akt及星形胶质细胞标记物胶质纤维酸性蛋白（GFAP）的表达。 结果 荧光免疫显示2 mg/L Leptin组80%表达GFAP,Western blot分析发现0.5、1、2 mg/L Leptin组GFAP的表达较0 mg/L Leptin组增加（P<0.05）。与0 h相比,2 mg/L Leptin共培养后24 h后GFAP表达开始随时间增长而增加,7 d达高峰（P<0.05）。加入STAT3抑制剂的神经干细胞磷酸化STAT3表达减少,GFAP表达减少;加入Akt抑制剂的神经干细胞,磷酸化Akt表达量减少,但GFAP表达量未减少。 结论 Leptin或可通过激活STAT3而非活化PI3k-Akt信号通路,诱导神经干细胞向星形胶质细胞分化。     

Generation of Transgene-free Induced Pluripotent Stem Cells with Non-viral Methods

Induced pluripotent stem(iPS) cells were originally generated from mouse fibroblasts by enforced expression of Yamanaka factors(Oct3/4,Sox2,Klf4,and c-Myc).The technique was quickly reproduced with human fibroblasts or mesenchymal stem cells.Although having been showed therapeutic potential in animal models of sickle cell anemia and Parkinson’s disease,iPS cells generated by viral methods do not suit all the clinical applications.Various non-viral methods have appeared in recent years for application of iPS cells in cell transplantation therapy.These methods mainly include DNA vector-based approaches,transfection of mRNA,and transduction of reprogramming proteins.This review summarized these non-viral methods and compare the advantages,disadvantages,efficiency,and safety of these methods.     

诱导性多能干细胞技术的研究进展

诱导鼠成纤维细胞转变为多能干细胞的成功掀起了世界范围内诱导性多能干细胞(iPS)研究的热潮。iPS来源广泛,具有干细胞的分化全能性,避开了取材和应用的伦理问题,在医学领域具有广阔的应用前景,如构建人类疾病模型,用于特定细胞治疗,培育转基因动物用于器官移植以及生物制药等领域。目前iPS结合基因治疗和细胞移植疗法的成果已经应用到了动物疾病模型上。此外,该技术也为研究细胞重编程机制和人类疾病的病理过程提供了新平台。     

诱导性多能干细胞研究进展及应用前景

将体细胞或成体干细胞重编程转变为诱导性多能干细胞(iPSCs)技术是近年来再生医学领域的重大进展。它是通过人工方法将适当的外源性转录因子导入体细胞或成体干细胞,使体细胞或成体干细胞转化为具有无限增殖潜能和定向分化能力、类似于胚胎干细胞的一类"人造干细胞"。来源于特定患者体细胞的iPSCs为医学研究提供了强有力的工具,并有可能为损伤修复的替代治疗提供细胞来源。现重点讨论iPSCs在重编程过程中最新研究进展并概述了iPSCs的临床应用前景。     

人诱导多能干细胞向血管内皮细胞分化方法的建立

目的:建立一种新的促进人诱导多能干细胞(iPSc)向血管内皮细胞(VEC)分化的方法.方法:将未分化的人iPSc制备成拟胚体(EBs),分为常氧组(A组)、常氧加血管内皮生长因子(VEGF)组(B组)、常氧加甲基乙二酰氨基乙酸(DMOG)组(C组)、缺氧组(D组)、缺氧加VEGF组(E组)及缺氧加DMOG组(F组),分别给予相应处理;观察各组iPS-EBs分化的VEC形态结构,应用逆转录PCR(RT-PCR)法检测VEC特异基因CD31、CD34、VE-cad、KDR、vWF的表达,免疫荧光细胞法检测以mRNA表达最强组的VEC特异基因在细胞定位情况判断VEC分化情况.结果:RT-PCR结果显示未经诱导iPSc不表达任何VEC相关基因,A组EBs细胞仅表达微弱的VE-cad和KDR;经条件诱导后iPS-EBs细胞表达CD31、CD34、VE-cad、KDR、vWF,C组表达最强,与其他各组比较差异有统计学意义(P＜0.05);免疫荧光结果显示C组中CD31、CD34为膜表达,KDR、vWF为胞浆表达.结论:常氧状态下加入DMOG培养能成功促进人iPSc向VEC分化.     

诱导性多能干细胞形成过程中转录因子的研究进展

诱导性多能干细胞(iPS)是以反转录病毒为载体将胚胎特异性转录因子导入体细胞,使其诱导分化为具有胚胎干细胞(ESCs)特性的细胞。这种多能干细胞在细胞形态、增殖速率、致瘤性、基因表达以及形成嵌合小鼠的能力上与ESCs有许多相似之处,将来可能成为ESCs在临床应用中的替代。现对iPS细胞相关的几种转录因子及其在重编程过程中的作用,以及转导基因的选择予以综述。     

Genetic Correction and Hepatic Differentiation of Hemophilia B-specific Human Induced Pluripotent Stem Cells

Objective To genetically correct a disease-causing point mutation in human induced pluripotent stem cells (iPSCs) derived from a hemophilia B patient. Methods First, the disease-causing mutation was detected by sequencing the encoding area of human coagulation factor IX (F IX) gene. Genomic DNA was extracted from the iPSCs, and the primers were designed to amplify the eight exons ofF IX. Next, the point mutation in those iPSCs was genetically corrected using CRISPR/Cas9 technology in the presence of a 129-nucleotide homologous repair template that contained two synonymous mutations. Then, top 8 potential off-target sites were subsequently analyzed using Sanger sequencing. Finally, the corrected clones were differentiated into hepatocyte-like cells, and the secretion of F IX was validated by immunocytochemistry and ELISA assay.Results The cell line bore a missense mutation in the 6th coding exon (c.676 C>T) ofF IX gene. Correction of the point mutation was achievedvia CRISPR/Cas9 technologyin situwith a high efficacy at about 22% (10/45) and no off-target effects detected in the corrected iPSC clones. F IX secretion, which was further visualized by immunocytochemistry and quantified by ELISAin vitro,reached about 6 ng/ml on day 21 of differentiation procedure. Conclusions Mutations in human disease-specific iPSCs could be precisely corrected by CRISPR/Cas9 technology, and corrected cells still maintained hepatic differentiation capability. Our findings might throw a light on iPSC-based personalized therapies in the clinical application, especially for hemophilia B.     

Reprogramming of adult human neural stem cells into induced pluripotent stem cells

Background Since an effective method for generating induced pluripotent stem cells (iPSCs) from human neural stem cells (hNSCs) can offer us a promising tool for studying brain diseases,here we reporte...     

诱导多能干细胞在心血管疾病中的应用研究进展

干细胞以其自我更新和多向分化的能力得到了医学界广泛关注,成体干细胞移植治疗缺血性心脏病已成为现实。诱导多能干细胞(iPSC)是通过对多种终末分化的体细胞进行外源性重编程而获得,因其来源方便、不存在免疫排斥和伦理问题,立即成为细胞重建和组织修复领域的研究热点。该文就iPSC的研究现状以及其在心血管疾病再生医学的应用前景进行综述。     

哺乳动物诱导多功能干细胞（iPSc）的技术研究进展

诱导型多能干细胞（iPSc）具备胚胎干细胞的分化潜能,同时又回避了伦理问题,因此具有广泛且重要的临床应用价值。然而,目前iPS技术仍然存在致癌性、效率低等一系列问题。针对这些亟待解决的问题,本文综述了最近几年国内外在iPS细胞研究领域中的发展现状及研究方法,并探讨该领域中急需解决的问题和发展前景,以为诱导性多功能干细胞的研究提供一定的借鉴。