绿色荧光蛋白-小鼠纤维介素蛋白融合基因表达载体的构建和表达

目的：构建绿色荧光蛋白(GFP)和小鼠纤维介素蛋白(mfgl2)的融合蛋白表达载体，在仓鼠卵巢(CHO)细胞中表达，为mfgl2的RNA干扰体外研究提供简便的判断手段。方法：用PCR从mfgl2cDNA文库中扩增出mfgl2cDNA片段，插入到GFP表达载体pEGFP—N2中GFP基因序列的上游，构建成GFP—mfgl2融合基因表达载体pEGFP—mfgl2，将该载体转染到CHO细胞后24—48h，通过荧光显微镜观察并摄片。结果：扩增出长约1．3kb的基因片段，经双酶切鉴定和测序鉴定无误；重组载体转染CHO细胞后，在荧光显微镜下可观察到GFP的表达。结论：成功构建了pEGFP．mfgl2融合基因表达载体；重组载体可在CHO细胞中表达出GFP—mfgl2融合蛋白，为下一步进行mfgl2RNA干扰研究提供了简便的判断手段。     

重组中国仓鼠卵巢细胞表达系统高效表达载体研究进展

生物制药是21世纪高科技产业,治疗性重组蛋白的生产是生物制药的重要部分。宿主细胞以中国仓鼠卵巢(CHO)细胞用途最为广泛,近70%宿主细胞是用CHO细胞表达系统生产的。影响外源蛋白在CHO细胞中表达的因素很多,其中表达载体是重要因素之一。构建重组CHO细胞表达系统高效表达载体可以利用核基质附着区、泛在染色质开放元件,构建特定位点重组载体系统,以及选择合适的内部核糖体进入位点及弱化筛选标记等实现。CHO细胞表达高效载体构建涉及多个因素,需要进行不同元件的优化,才可达到高效表达。     

小鼠肿瘤坏死因子受体1基因的克隆及其与绿色荧光蛋白的融合表达

目的：构建小鼠肿瘤坏死因子受体1（TNFR1）和绿色荧光蛋白（GFP）的融合基因真核表达质粒，然后在中国仓鼠卵巢（CHO）细胞表达，为TNFR1的基因干预研究提供简便的判定手段。方法：从小鼠肝组织提取总RNA，RT-PCR扩增出TNFR1基因的cDNA片段，将目的片段克隆至pMD18-T载体。酶切和测序鉴定，然后将目的片段酶切回收后插到GFP表达载体pEGFP-N2中GFP基因序列的上游，构建TNFR1-EGFP融合基因真核表达载体pEGFP-TNFR1，将该重组质粒转染到CHO细胞后24—48h，用免疫组化技术检测TNFR1的表达情况。同时荧光显微镜下观察GFP表达情况。结果：扩增出了长约1360bp的基因片段，并将其克隆至pMD18-T载体，酶切和测序鉴定无误；将pMD-TNFR1中TNFR1基因亚克隆至pEGFP-N2载体，酶切鉴定无误；重组质粒pEGFP-TNFR1转染CHO细胞后，免疫组化染色可见细胞有阳性棕染，同时荧光显微镜下也可观察到绿色荧光蛋白的表达。结论：成功构建了小鼠TNFR1-EGFP融合基因真核表达质粒；重组质粒可在CHO细胞中表达出TNFR1-EGFP融合蛋白，为进一步的TNFR1基因干扰研究奠定了基础。     

RECK基因GFP融合蛋白表达载体的构建、鉴定及在脑胶质瘤细胞中的表达

目的:获得RECK基因GFP融合蛋白表达载体并使其在脑胶质瘤细胞SHG44中表达。方法:用基因克隆的方法构建RECK基因GFP融合蛋白表达载体,通过酶切和测序鉴定,用绿色荧光蛋白表达载体对RECK基因在人脑胶质瘤细胞SHG44中进行亚细胞定位。结果:所得RECK基因融合蛋白表达载体序列与预期相符。pEGFP-RECK表达质粒转染SHG44细胞后,荧光信号主要集中在与细胞质有关的部位。结论:成功构建了GFP-RECK融合蛋白表达质粒,这为进一步研究该基因的功能奠定了基础。     

应用GFP标记基因研究RNAi载体的抑制效果

目的 用绿色荧光蛋白(GFP)反映RNA干扰(RNAi)载体的转染率,以研究RNAi载体的抑制效果.方法 将GFP基因和RNAi片段(特异性针对Bcl-2基因)连接至pC1载体上,构建共表达载体GFP/RNAi及其对照载体,转染293细胞,用荧光显微镜、流式细胞仪检测细胞的GFP转染率,并用TR-PCR分析RNAi抑制Bcl-2 mRNA表达的效果.结果 在293细胞中,GFP的转染率可达85%以上,此时观察到RNAi有效的抑制了Bcl-2 mRNA的表达.结论 在RNAi实验时,可选用GFP等标记基因作为载体转染率的判断标准,以进一步判断RNAi的作用效果.构建的RNAi载体有效的抑制了Bcl-2的表达,为下一步抑制肿瘤细胞的生长提供科学资料.     

pEGFP-N1-亚麻苦甙水解酶重组真核表达载体的构建及亚麻苦甙水解酶在SGC-7901细胞中的表达

目的:构建携带亚麻苦甙水解酶(lis)基因的重组真核表达载体,以绿色荧光蛋白(GFP)为报告基因,导入SGC-7901细胞中表达。方法:提取木薯总RNA,PCR扩增lis目的基因,将该基因全长定向克隆至真核表达载体pEGFP-N1上,构建重组质粒载体。用电穿孔法转染体外培养的SGC-7901细胞,在活细胞状态下用荧光显微镜直接观察lis-EGFP融合蛋白在细胞中的表达。用PCR检测lis转录水平的表达,用Western blot法验证lis蛋白水平的表达。结果:酶切和测序证实pEGFP-N1-lis重组质粒构建正确,重组质粒载体在SGC-7901细胞中获得了表达,表达的融合蛋白具有lis和EGFP的双重活性。结论:通过基因克隆方法成功地构建了pEGFP-N1-lis重组质粒载体,并且在SGC-790细胞中稳定表达。     

CD40-IgG1Fc融合蛋白真核表达载体的构建及表达

目的 构建人CD40-IgG1Fc融合蛋白的真核表达载体CD40-IgG1Fc/pcDNA3.1( ),并在中国仓鼠卵巢细胞(CHO细胞)表达.方法 应用T-A克隆技术和亚克隆技术,构建人CD40膜外段和IgG1Fc段融合蛋白的真核表达载体CD40-IgG1Fc/pcDNA3.1( ),将其转染入CHO细胞株并筛选,进行稳定表达.通过RT-PCR、Western blot法及ELISA法证实融合基因的表达.结果 成功构建真核表达载体CD40-IgG1Fc/pcDNA3.1( ),并建立CHO细胞稳定表达株.Western blot及ELISA法检测到细胞培养上清中有融合蛋白的表达.结论 通过基因工程生产的人CD40-IgG1Fc融合蛋白,能够特异性阻断CD40-CD40L的相互作用.     

间隙连接蛋白connexin43基因在真核细胞中的表达

目的：构建携带间隙连接蛋白connexin43 cDNA的真核表达载体,建立connexin43蛋白高表达细胞株。方法：connexin43 cDNA在大肠杆菌中扩增后连入真核表达载体pEN4,转染中国仓鼠卵巢（CHO）细胞,用甲氨喋呤（MTX）筛选得到connexin43基因高表达细胞。结果：酶切电泳结果显示载体pED4-Cx43按设计构建。经MTX筛选得到不同抗性的CHO细胞,免疫组织化学方法显示有connexin43蛋白的表达,但表达量有限。细胞间染料传递实验证实不同MTX抗性的CHO细胞间传递小相对分子质量物质的能力有差异。结论：利用载体pED4可以使connexin43基因在真核细胞内表达。     

人PSMP重组蛋白在CHO细胞中表达、纯化及功能鉴定

目的:构建新的具有趋化作用的人类细胞因子PSMP的真核表达载体,在仓鼠卵巢细胞(Chinese hamster ovary,CHO)中表达并纯化,为PSMP的功能机制研究奠定基础.方法:从pcDNA3.1-PSMP-myc/His中切下PSMP-myc/His片段,插入pMH3表达载体.利用电穿孔法将该表达载体转染CHO细胞,G418抗性筛选稳定克隆株.以Dot blot及Western blot法检测上清液中PSMP蛋白的表达,利用有限稀释法对抗性筛选出的混合克隆单克隆化,悬浮无血清大批培养工程细胞,通过镍亲和层析法纯化蛋白,SDS-PAGE电泳分析蛋白纯度,Boyden小室体外趋化实验分析蛋白功能活性.结果:PSMP-myc/His基因插入pMH3载体后成功构建真核表达载体pMH3-PSMP,转染CHO细胞后经2次克隆化获得稳定表达PSMP的基因工程细胞株.镍亲和层析纯化的重组蛋白PSMP纯度达95％以上且具有生物学活性.结论:成功构建了PSMP蛋白的真核表达载体,并获得其稳定表达的CHO细胞株,获得了较高纯度的、具有生物学活性的重组蛋白,为下一步PSMP功能和机制研究提供有用工具.     

含绿色荧光蛋白的慢病毒载体的构建及表达

目的　构建以泛醌启动子 (PUB)驱动绿色荧光蛋白 (GFP)表达的慢病毒载体三质粒表达系统 ,并建立其包装细胞系获得GFP的表达。方法　载体的构建采用限制性内切酶酶切、T4DNA连接酶连接等方法。三质粒系统中 ,转移质粒含PUB启动子及标志基因GFP ,包装质粒为ΔNRF ,内含CMV启动子和来自胰岛素基因的Poly(A)位点 ,包膜蛋白质粒编码水疱性口炎病毒G糖蛋白 (VSV -G)。载体构建成功后 ,用磷酸钙沉淀法将三质粒共转染来源于人胚肾细胞系的包装细胞——— 2 93T ,12h后在荧光显微镜下观察绿色荧光的表达情况。转染后 72h收集病毒上清 ,采用 6孔板培养感染细胞 ,荧光显微镜计数GFP阳性细胞法测定病毒滴度。结果　成功构建了含PUB启动子驱动GFP表达的质粒pXZ5。转染 2 93T细胞后 12h在荧光显微镜下均观察到较强的绿色荧光 ,证实了GFP的表达 ,成功构建了慢病毒载体的三质粒系统 ,建立了慢病毒载体的包装细胞系。 72h后 ,GFP的荧光强度较 12h增强 ,每一视野下 ,GFP表达阳性的细胞比例达 5 0 %左右。病毒浓度的测定在未进行超速离心浓缩的情况下达 2× 10 8U L。结论　成功构建了含PUB启动子驱动GFP表达的的慢病毒载体三质粒表达系统 ,转染2 93T细胞后获得了GFP的表达 ,完成了慢病毒载体包装细胞系的建立     

应用RNA干扰抑制目的基因在小鼠体内表达

目的研究RNA干扰(RNAi)对体外和体内基因表达的沉默作用。方法以PCR方法从基因组DNA中克隆出依赖于RNA聚合酶Ⅲ的H1启动子,并用于驱动RNAi片段的合成;构建特异性针对目的基因(绿色荧光蛋白,GFP)的RNAi载体(Pi)。将RNAi干扰载体和GFP载体转染NIH3T3细胞,应用荧光显微镜观察、RT-PCR、流式细胞技术(FACS)分析上述细胞中RNAi对目的基因GFP表达的抑制效果,进一步在个体水平将RNAi载体注入小鼠体内,研究RNAi对GFP表达的抑制情况。结果RNAi能有效地使NIH3T3细胞中GFP表达量降低约60%以上,并能有效地抑制GFP在转基因小鼠体内的表达。结论RNAi技术能抑制目的基因在体内外的表达,是一种有效的基因治疗工具。     

绿色荧光蛋白和HCV5′NCR调控荧光素酶双顺反子真核表达载体的构建及其在肝细胞中的表达

目的 :探讨绿色荧光蛋白 (greenfluorescentprotein ,GFP)和HCV 5′NCR(noncodingregion)调控荧光素酶双顺反子真核表达载体的构建及其在肝细胞中的表达。方法 :用基因重组技术 ,将真核表达载体pCMVNCRLuc的HCV5′NCR及其调控的荧光素酶基因亚克隆至报告载体pEGFP C1的GFP基因下游 ,构建含GFP和HCV 5′NCR调控荧光素酶双顺反子的真核表达载体pGFPNCRLuc。用脂质体基因转染技术 ,将pGFPNCRLuc转染至肝细胞株QSG770 1。结果 :GFP和荧光素酶基因均得到高效表达 ,其荧光素酶表达强度与pCMVNCRLuc比较 ,差异无显著性 (P >0 .0 5 ) ,GFP表达水平与pEGFP C1比较 ,差异无显著性 (P >0 .0 5 )。结论 :成功构建HCV和HCV 5′NCR调控荧光素酶双顺反子真核表达载体 ,HCV和荧光素酶基因在肝细胞内得到共表达。该结果为特异性抗HCV药物评价系统的建立创造了条件     

以绿色荧光蛋白为报告基因的酿酒酵母表达载体的构建

目的：构建以绿色荧光蛋白（GFP）为报告基因的酿酒酵母表达载体。方法：利用通用载体质粒融合系统（UPS），首先将GFP片断连入donor载体，随后在Cre酶作用下与acceptor载体融合，获得了带有GFP片断的酿酒酵母（saccharomyces cerevisiae）表达载体。结果：成功构建了以GFP为报告基因的酿酒酵母载体，并在酵母中得到表达。结论：GFP是一种理想的报告基因。同时，利用UPS能够高效、简便地进行酵母表达载体的构建。     

绿色荧光蛋白和HCV5′NCR调控荧光素酶双顺反子真核表达载体的构建及其在肝细胞中的表达

目的：探讨绿色荧光蛋白（green fluorescent protein,GFP)和HCV5′NCR(noncoding region)调控荧光素酶双顺反子真核表达载体的构建及其在肝细胞中的表达。方法：用基因重组技术，将真核表达载体pCMVNCRLuc的HCV5′NCR及其调控的荧光素酶基因亚克隆至报告载体pEGFP-C1的GFP基因下游，构建含GFP和HCV5′NCR调控荧光素酶双顺反子的真核表达载体pGFPNCRLuc。用脂质体基因转染技术，将pcGFPNCRLuc转染至肝细胞株QSG7701。结果：GFP和荧光素酶基因均得到高效表达，其荧光素酶表达强度与pCMVNCRLuc比较，差异无显著性（P＞0.05)，GFP表达水平与pEGFP-C1比较，差异无显著性（P＞0.05)。结论：成功构建HCV和HCV5′NCR调控荧光素酶双顺反子真核表达载体，HCV和荧光素酶基因在肝细胞内得到共表达。该结果为特异性抗HCV药物评价系统的建立创造了条件。     

含绿色荧光蛋白和HyTK基因双顺反子腺病毒载体的构建及鉴定

目的构建一种带有绿色荧光蛋白（ＧＦＰ）和潮霉素磷酸转移酶和ＨＳＶ－ＴＫ的融合基因（ＨｙＴＫ基因）的新型腺病毒载体，用于简便、快速地了解自杀基因在恶性肿瘤中的转染效率和提高疗效。方法利用脑炎心肌炎病毒的内部核糖体进入位点（ｉｎｔｅｒｎａｌｒｉｂｏｓｏｍｅｅｎｔｒｙｓｉｔｅ，ＩＲＥＳ），将ＧＦＰ的ｃＤＮＡ与ＨｙＴＫ真核表达载体重组，构建获得含ＧＦＰ和ＨｙＴＫ基因真核表达载体，在Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ介导下转染ＣＯＳ－７细胞，检测其表达后进一步克隆获得含ＧＦＰ和ＨｙＴＫ基因双顺反子腺病毒载体。结果构建含绿色荧光蛋白和ＨｙＴＫ基因双顺反子腺病毒载体，显示该载体可获得ＨｙＴＫ基因及ＧＦＰ的良好表达。结论含绿色荧光蛋白和ＨｙＴＫ基因双顺反子腺病毒载体的构建为ＨｙＴＫ基因治疗恶性肿瘤用于临床提供了新的治疗工具及随访检测手段。     

Constructing retroviral vector carrying green fluorescent protein （GFP） and investigating the expression of GFP in primary rat myoblast

INTRODUCTION Green fluorescent protein ( G FP ) absorbs blue or ultraviolet light , and gives out bright green fluorescence.G FP has been expressed in a variety of species , and extentively used in tissue engineering [1]. M yoblast could fuse w ith host m yofibers , transform - ing the target gene into the host , and expressing corressponding gene product.M yoblast is com patible w ith collagen and could be induced to differentiate by collagen. N ow m yoblast has been used in studies on…     

22R序列loop和泡突变对GFP报告基因表达的作用

目的:我们研究室的前期工作在猴空泡病毒40(SV40)早期mRNA PolyA序列(SV40PolyA)中发现1个活化基因的原件22R(5' -GTGAAAAAAATGCTTTATTTGT-3'),该片段可以解除Alu串连序列(或Line-1重复序列)对GFP报告基因的抑制作用.我们研究22R突变对GFP报告基因表达的...     

RNA干扰用于柯萨奇病毒B3感染治疗作用研究

目的研究观察自行构建的siRNA表达载体对柯萨奇病毒B3（CVB3）感染的潜在治疗作用。方法以CVB3聚合酶编码区基因序列为靶点,构建发夹型siRNA真核表达载体pGCsi—U6／GFP／P及与CVB基因组序列无关的阴性对照pGCsi—U6／GFP／N。利用脂质体转染进入Hela细胞后,用CVB3毒株进行攻击,观察感染后Hela细胞病变情况,并用RT—PCR法检测细胞培养上清中的CVB3负链RNA水平。结果构建的表达质粒pGCsi—U6／GFP／P在Hela细胞能够正确表达,其表达产物能够使CVB3基因沉默,并间接抑制了CVB3的复制。结论本实验成功构建了能够抑制CVB3的发夹状siRNA表达质粒,该质粒具有增强细胞抗CVB3感染的能力。     

携带绿色荧光蛋白基因的重组腺病毒的构建及其在人血管平滑肌细胞中的表达

目的:构建携带绿色荧光蛋白(Green Fluorescent Protein,GFP)基因的重组腺病毒质粒pAd-GFP,制备重组腺病毒Ad-GFP,并使GFP在血管平滑肌细胞中得到高效表达。方法:将线性化的穿梭质粒pRNAT-H1.1与腺病毒骨架质粒pAdeasy-1在感受态BJ5183内进行同源重组,并筛选出阳性重组子pAd-GFP;用Pac I酶切线性化pAd-GFP,线性化的腺病毒质粒经脂质体转染AD293细胞,进行重组腺病毒的包装和扩增。采用CsC1密度梯度离心进行病毒浓缩和纯化。获得的腺病毒感染人血管平滑肌细胞(human vascular smooth muscle cell,hVSMC),观察其感染效率和GFP表达水平。结果:通过Pac I酶切证实腺病毒载体构建成功,包装出携带GFP基因的腺病毒,滴度达到4.5×1012pfu/mL,获得的腺病毒对hVSMC的感染效率约为100%。结论:利用细菌内同源重组方法成功地构建了携带绿色荧光蛋白的重组腺病毒,并能够在hVSMC细胞中高效地表达,为利用GFP作为报告基因的研究奠定了实验基础。