人CXC型趋化因子受体CXCR6真核表达载体的构建及生物学功能研究

目的:克隆和构建带人CXC型趋化因子受体6(CXCR6)基因的真核表达载体pcDNA3.1(+).CXCR6,分析瞬时转染CXCR6基因对人乳腺癌细胞MDA-MB-231迁移能力的影响.方法:Trizol一步法抽提人外周血单个核细胞(PBMC)总RNA,RT-PCR扩增CXCR6全长基因,克隆入T载体,测序,双酶切连入真核表达载体peDNA3.1(+),酶切鉴定.将构建好的pcDNA3.1(+)-CXCR6瞬时转染.MDA-MB-231细胞,RT-PCR和Western blotting鉴定重组质粒的表达.利用微孔隔离小室检测转入人CXCR6基因的MDA-MB-231细胞的迁移能力.结果:扩增出人CXCR6基因全长,测序结果和GenBank记载完全一致,成功克隆入真核表达载体pcDNA3.1(+).瞬时转染pcDNA3.1(+)-CXCR6显著增强MDA.MB-23l细胞的迁移能力.结论:成功构建带有人CXCR6基因的真核表达载体pcDNA3.1(+)-CXCR6,为CXCR6在肿瘤学中的研究奠定基础.     

HOXA5基因真核表达质粒的构建及在乳腺癌细胞中的功能研究

目的：构建HOXA5基因真核表达重组质粒,并转染乳腺癌细胞株观察其对细胞迁移能力的影响。方法：实时定量聚合酶链反应（RT-QPCR）检测MCF7、BT474及MDA-MB-231等3种乳腺癌细胞中HOXA5 mRNA的表达。采用全基因合成法合成HOXA5编码区序列,克隆入pcDNA3.1（＋）载体,构建重组质粒pcDNA3.1-HOXA5。重组质粒转染乳腺癌细胞,采用Western blot及RT-QPCR检测HOXA5的表达效率。观察细胞形态并通过细胞划痕实验检测细胞的迁移能力。结果：3株乳腺癌细胞中,MDA-MB-231细胞中HOXA5 mRNA表达水平较低。其基因测序结果显示与预期片段大小一致,表明HOXA5重组质粒构建成功。将HOXA5重组质粒瞬时转染MDA-MB-231细胞后,检测到其mRNA和蛋白表达水平均明显上调,MDA-MB-231细胞的迁移能力降低,EMT相关转录因子Twist的表达显著下调。结论：成功构建HOXA5过表达重组质粒,在MDA-MB-231中过表达HOXA5抑制乳腺癌的迁移能力。     

肌细胞增强因子2A基因真核表达质粒的构建及对乳腺癌细胞MCF-7增殖能力的影响

目的：构建肌细胞增强因子2A（MEF2A）基因真核表达重组质粒,并转染乳腺癌细胞株观察其对细胞增殖能力的影响。方法：实时定量聚合酶链反应（RT-QPCR）检测MCF-7、BT474及MDA-MB-231等3种乳腺癌细胞中MEF2A mRNA的表达。采用全基因合成法合成MEF2A编码区序列,克隆入pcDNA3.1（＋）-HA载体,构建重组质粒pcDNA3.1-MEF2A-HA。重组质粒转染乳腺癌细胞,采用Western blot及RT-QPCR检测MEF2A的表达效率。细胞计数实验检测细胞的增殖能力。结果：3株乳腺癌细胞中,MDA-MB-231细胞中MEF2A mRNA表达水平较低;其基因测序结果显示与预期片段大小一致,表明MEF2A重组质粒构建成功。将MEF2A重组质粒瞬时转染MDA-MB-231细胞后,MEF2A表达质粒组与对照组比较,其MEF2A表达升高,细胞增殖能力增强。结论：成功构建MEF2A过表达重组质粒,在MDA-MB-231中过表达MEF2A促进细胞的增殖能力。     

HIV-1 Tat真核表达载体的构建及在内皮细胞的表达

目的:构建HIV-1 Tat真核表达质粒,为研究Tat在HIV-1致病机制中的作用奠定实验基础。方法:以pCV1(tat and rev)质粒为模板,用PCR方法扩增HIV-1 Tat基因,克隆至p cDNA3.1( )表达载体,酶切及测序鉴定重组体。重组质粒转染ECV304细胞,用RT-PCR、转染HIV-1 LTR荧光报告基因的方法检测tat基因的表达及活性。结果:经酶切及测序鉴定,成功构建pcDNA3.1( )-Tat重组质粒。重组体转染ECV304细胞,建立稳定表达细胞株,应用RT-PCR可检测到Tat基因mRNA的表达;荧光仪检测Tat蛋白可明显促进荧光素酶在ECV304细胞内的表达。结论:成功构建HIV-1Tat真核表达载体,并建立了HIV-1 Tat内皮细胞稳定表达细胞株。     

辐射敏感性新基因UHRF1真核表达载体的构建及鉴定

目的构建UHRF1的真核表达载体,并验证其在乳腺癌细胞MDA-MB-231中的表达。方法采用RT-PCR方法,从乳腺癌细胞MCF-7的总cDNA中扩增出2.3kb的UHRF1基因的cDNA片段,经限制性内切酶KpnⅠ与XhoⅠ双酶切,定向克隆到真核表达载体pcDNA3中,构建重组质粒pcDNA3（＋）-UHRF1,利用限制性内切酶双酶切分析和DNA序列分析鉴定重组质粒;构建成功的重组质粒,经脂质体Lipofactamin2000介导转染MDA-MB-231细胞,G418筛选阳性克隆,以RT-PCR和Western blot检测UHRF1的mRNA和蛋白的表达。结果获得全长约为2.3kb的UHRF1基因片段;重组质粒经限制性内切酶XhoⅠ和KpnⅠ酶切、电泳后显示2.3kb的UHRF1目的片段和5.4kb的pcDNA3载体片段,即UHRF1基因的cDNA已正确克隆到真核细胞表达载体pcDNA3中;UHRF1转染乳腺癌MDA-MB-231细胞后的RT-PCR和Western blot的结果显示：UHRF1的mRNA和蛋白水平均呈现高表达。结论成功构建UHRF1基因的真核表达载体,为进一步研究该基因的功能奠定基础。     

稳定转染pEGFP-4.1 N乳癌细胞系的筛选与鉴定

目的:建立真核表达载体pEGFP-4.1N稳定转染的乳癌MDA-MB-231细胞系,观察4.1N在MDA-MB-231细胞中的表达和定位.方法:真核表达载体pEGFP-4.1N转化到大肠杆菌中进行扩增,酶切鉴定插入片段后进行测序.脂质体法将重组质粒转染至MDA-MB-231细胞中,经G418筛选抗性克隆,利用倒置荧光显微镜观察融合蛋白在细胞中的定位,并用Western blot检测融合蛋白的表达.结果:真核表达载体pEGFP-4.1N的酶切片段经琼脂糖电泳和测序鉴定结果正确.G418筛选14 d后获得pEGFP-4.1 N稳定转染的MDA-MB-231抗性克隆.荧光显微镜下观察到融合蛋白在MDA-MB-231阳性克隆的细胞质中表达.核内不表达.Western blot亦检测到4.1N融合蛋白的表达.结论:成功建立了pEGFP-4.1N稳定转染的乳痛细胞系MDA-MB-231阳性克隆.     

转染BRMS1基因对乳腺癌MDA MB 231细胞体外侵袭力的影响

目的：探讨BRMS1基因对乳腺癌MDA MB 231细胞体外侵袭力的影响。方法：将携带BRMS1基因的真核表达载体pcDNA3.1/myc BRMS1通过脂质体介导稳定转染乳腺癌MDA MB 231细胞;RT PCR检测转染前后细胞中BRMS1mRNA的表达;扫描电镜观察细胞表面超微结构的改变;Boyden小室检测细胞体外侵袭力。结果：转染成功的乳腺癌MDA MB 231细胞其BRMS1mRNA呈高表达;细胞表面超微结构发生改变;体外侵袭力下降。结论:转染BRMS1基因可抑制乳腺癌MDA MB 231细胞的体外侵袭能力。     

血红素氧合酶-1基因真核表达载体的构建及其在血管内皮细胞中的表达

目的克隆血红素氧合酶-1（HO-1）基因，并构建真核表达载体，建立重组HO-1蛋白的血管内皮表达细胞系。方法从大鼠脾脏中提取RNA，利用反转录聚合酶链式反应（RT—PCR），克隆到鼠的HO-1基因，并对该基因片段进行T载体克隆、酶切鉴定和测序分析。将HO-1基因插入到真核表达载体pcDNA3中，利用脂质体介导将重组质粒转染血管内皮细胞ECV304细胞，经G418加压筛选后，对细胞进行间接免疫荧光和Western blot分析。结果DNA测序分析表明克隆的HO-1基因与文献报道一致，酶切鉴定证实基因正确地插入表达载体中。经间接免疫荧光和Western blot表明重组HO-1蛋白在ECV304细胞中获得高效表达，其分子量约为32kD。结论HO-1基因真核表达载体的成功构建和重组HO-1蛋白在血管内皮细胞系中的高效表达，为进一步研究其生物学功能奠定了基础。     

组织型纤溶酶原激活剂真核表达载体的构建及其在乳癌细胞系MCF-7中的瞬时表达

目的:构建组织型纤溶酶原激活剂(t-PA)真核表达载体,并检测其在乳癌细胞系MCF-7中的瞬时表达.方法:以含t-PA cDNA的质粒PETPFR为模板,PCR扩增目的片段t-PA,HindⅢ和Sal Ⅰ双酶切t-PA,HindⅢ和xhoⅠ双酶切pcDNA3真核表达载体.Sal Ⅰ和Xho Ⅰ的黏性末端互补,体外连接酶切产物,重组体转化感受态JM109细菌,筛选菌落和测序鉴定.以脂质转染胺试剂LipokctamineTM2000将pcDNA3-t-PA转染入乳癌细胞系MCF-7,G418筛选.应用原位杂交技术,以地高辛标记的t-PA cDNA为探针,显示t-PA在MCF-7中的瞬时表达.结果:电泳获得目的片段t-PA的条带2.1kb,初步鉴定为阳性重组体,测序证实为正确的t-PA序列.MCF-7细胞原位杂交显示大部分细胞表达阳性.结论:组织型纤溶酶原激活剂真核表达载体构建成功,可在乳癌细胞系MCF-7中表达.     

转染人血纤溶酶原Kringle 5基因对人胰腺癌PC3细胞的影响

目的　将人血纤溶酶原Kringle 5基因导入人胰腺癌PC3细胞 ,观察其对人胰腺癌PC3细胞系的基因治疗作用。方法　将外源性Kringle 5通过脂质体转染法导入人胰腺癌PC3细胞 ,筛选阳性克隆 ,同时设空质粒组及PC3细胞为对照。采用RT PCR、免疫组织化学、MTT、电镜、流式细胞术等方法 ,鉴定及检测转染前后细胞超微结构、细胞周期及Kringle 5蛋白表达情况 ,并用血管内皮细胞增殖实验及裸鼠接种检测目的胰腺癌细胞株表达的Kringle 5蛋白抑制血管内皮细胞生长的活性及裸鼠移植瘤生长情况。结果　人血纤溶酶原Kringle 5基因及蛋白水平在胰腺癌PC3细胞系均可以稳定表达 ,能抑制ECV30 4血管内皮细胞生长及具有抑制裸鼠移植瘤生长的作用。结论　成功转染人Kringle 5基因的人胰腺癌PC3细胞可稳定表达Kringle 5蛋白 ,且具有抗血管内皮细胞增殖活性的良好作用 ,为进一步进行体内抗血管生成基因治疗奠定了基础。     

人Endostatin cDNA的克隆及其在HT1080细胞中的表达

目的 :构建能表达人Endostatin的真核表达质粒。方法 :设计引物从成人肝cDNA文库中通过PCR扩增到EndostatincDNA ,并在 5′端融合编码人胰岛素信号肽序列 ,经测序证实后连接到真核表达载体pcDNA3.1(- )中。将携带基因的真核表达载体质粒pcDNA3.1(- ) SEND转染HT10 80细胞后用G4 18筛选获得克隆 ,采用RT PCR和West ern blot检测Endostatin的表达。结果 :测序结果表明克隆的人EndostatincDNA完全正确 ,并且在其 5′端融合编码人胰岛素信号肽序列 ;RT PCR显示转染后的HT10 80细胞可以有效地转录EndostatinmRNA ;Western blot检测到转染后的HT10 80细胞上清有相应的蛋白质 ,大小为 2 0kD左右。结论 :含有人胰岛素信号肽序列的人EndostatincDNA重组质粒pcDNA3.1(- ) SEND转染HT10 80细胞后可以有效的表达目的蛋白并能分泌到细胞外 ,本研究为Endostatin的功能研究及应用于基因治疗提供基础     

pcDNA3-MAGE-1真核表达载体的构建及其在Hepal-6细胞中的稳定表达

目的:构建真核表达载体,并在小鼠肝癌Hepal-6细胞中稳定表达,观察转染细胞的增殖能力和致瘤能力.方法:用PCR方法扩增SMMC-7721人肝癌细胞株MAGE-1全长序列,连接到真核表达载体pcDNA3中,构建真核表达pcDNA3-MAGE-1,脂质体法转染小鼠Hepal-6细胞.G418筛选阳性克隆(Hepal-6-MAGE-1),用RT-PCR和Western blotting检测阳性克隆中mRNA和蛋白质的表达;MTT法检测Hepal-6细胞和Hepal-6-MAGE-1细胞生长和增殖的变化;分别以Hepal-6细胞和Hepal-6-MAGE-1细胞接种于CA7BL/6j小鼠右侧背部皮下,观察Hepal-6-MAGE-1细胞的致瘤能力.结果:构建MAGE-1的真核表达载体转染Hepal-6细胞,PT-PCR与Western bohting检测分别在Hepal-6-MAGE-1细胞中检测到人MAGE-1基因的mNRA和蛋白质的表达,两组细胞增殖无统计学差异;两组各10只小鼠均皮下成瘤,且肿瘤大小没有明显差异.结论:成功构建了真核表达载体pcDNA3-MAGE-1,获得了稳定表达人MAGE-1基因的小鼠肝癌Hepal-6细胞株,并具有很好的增殖和致瘤能力.     

pcDNA3-MAGE-1真核表达载体的构建及其在Hepal-6细胞中的稳定表达

目的:构建真核表达载体,并在小鼠肝癌Hepa1-6细胞中稳定表达,观察转染细胞的增殖能力和致瘤能力。方法:用PCR方法扩增SMMC-7721人肝癌细胞株MAGE-1全长序列,连接到真核表达载体pcDNA3中,构建真核表达pcDNA3-MAGE-1,脂质体法转染小鼠Hepa1-6细胞。G418筛选阳性克隆(Hepa1-6- MAGE-1),用RT-PCR和Western blotting检测阳性克隆中mRNA和蛋白质的表达;MTT 法检测Hepa1-6细胞和Hepa1-6- MAGE-1细胞生长和增殖的变化;分别以Hepa1-6细胞和Hepa1-6- MAGE-1细胞接种于C57BL /6j小鼠右侧背部皮下,观察Hepa1-6- MAGE-1细胞的致瘤能力。结果:构建MAGE-1的真核表达载体转染Hepa1-6细胞,PT-PCR与Western boltting检测分别在Hepa1-6- MAGE-1细胞中检测到人MAGE-1基因的mNRA和蛋白质的表达,两组细胞增殖无统计学差异;两组各10只小鼠均皮下成瘤,且肿瘤大小没有明显差异。结论:成功构建了真核表达载体pcDNA3-MAGE-1,获得了稳定表达人MAGE-1基因的小鼠肝癌Hepa1-6细胞株,并具有很好的增殖和致瘤能力。     

pcDNA3.1/myc-His-DJ-1M26I重组载体构建及其对NIH3T3细胞增殖和凋亡研究

目的 构建pcDNA3.1/myc-His-DJ-1和pcDNA3.1/myc-His-DJ-1M26I重组表达载体,为研究DJ-1M26I突变与细胞增殖、凋亡的关系及建立转基因动物模型奠定基础.方法 采用突变试剂盒将DJ-1蛋白第26位氨基酸进行突变,分别构建pcDNA3.1/myc-His-DJ-1和pcDNA3.1/myc-His-DJ-1M26I重组表达载体,并采用脂质体介导的方法分别将其转染入NIH3T3细胞,500 μg/mL G418压力筛选稳定克隆,对2种转染细胞在DNA水平、RNA水平和蛋白质水平进行鉴定,采用MTT染色方法和AnnexinV-FITC试剂盒进行转染阳性克隆细胞的细胞活力与细胞凋亡检测.结果 pcDNA3.1/myc-His-DJ-1和pcDNA3.1/myc-His-DJ-1 M26I重组质粒转染NIH3T3细胞经G418筛选后,PCR方法检测分别获得1个和3个阳性细胞克隆,RT-PCR及western blot方法进行DJ-1 -His基因表达检测,结果均证明外源插入基因的表达,MTT实验结果初步证明转染DJ-1M26I基因的NIH3T3阳性细胞组细胞增殖速率低于正常NIH3T3细胞组(P＜0.05),转染DJ-1基因的NIH3T3阳性细胞组细胞增殖速率与正常NIH3T3细胞相比无明显差别;细胞凋亡检测表明转染DJ-1M26I基因的NIH3T3阳性细胞组细胞凋亡率高于正常NIH3T3细胞,转染DJ-1基因的NIH3Ｔ3阳性细胞组细胞凋亡率低于正常NIH3T3细胞(P＜0.05).结论 成功构建pcDNA3.1/myc-His- DJ-1和pcDNA3.1/myc-His-DJ-1M26I重组表达载体,成功筛选出稳定表达人DJ-1及DJ-1M26I的NIH3T3细胞.DJ-1M26I基因突变更易导致NIH3T3细胞的凋亡.     

Construction of eukaryotic expression vector of human S100A13 gene and its effect on proliferation of human thyroid cancer cell line TT

Objective To investigate the effect of exogenous S100A13 gene overexpression on the proliferation of human thyroid cancer cell line TT.Methods The recombinant ORF of S100A13 tagged with six histidines ...     

DJ-1L166P与DJ-1M26I基因对NIH3T3细胞增殖和凋亡的比较

目的 在细胞学水平比较DJ、DJ-1M261、DJ-1L166P基因对NIH 3T3细胞增殖速率与凋亡的关系,为建立转基因动物模型及帕金森疾病发病机制研究奠定基础.方法 分别将pcDNA3.1/myc-His-DJ-1、pcDNA3.1/myc-His-DJ-1L166P和pcDNA3.1/myc-His-DJ-1M261重组质粒脂质体方法转染NIH 3T3细胞,500 μg/ml G418压力筛选稳定克隆,对3种转染细胞在DNA水平、RNA水平和蛋白质水平进行鉴定,采用MTT染色方法和Annexin V-FITC试剂盒进行转染阳性克隆细胞的细胞活力与细胞凋亡检测.结果 pcDNA3.1/myc-His-DJ-1、pcDNA3.1/myc-His-DJ-1L166P和pcDNA3.1/myc-His-DJ-1M261重组质粒转染NIH 3T3细胞经G418筛选后,PCR方法检测分别获得1个、4个、3个阳性细胞克隆,RT-PCR及Western blot方法进行DJ-1-His基因表达检测,结果均证明外源插入基因的表达,Caspase-3 RNA水平检测DJ-1L166P和DJ-1M261组表达高于正常NIH 3T3细胞组,而DJ-1组caspase-3转录水平相对最低,MTT实验结果初步证明转染DJ-1L166P和DJ-1M261基因的NIH3T3阳性细胞组细胞增殖速率均低于DJ-1组和正常NIH 3T3细胞组(P＜0.05),转染DJ-1基因的NIH 3T3阳性细胞增殖速率与正常NIH 3T3细胞相比无明显差别;细胞凋亡检测表明转染DJ-1L166P和D J-1M261基因的NIH3T3阳性细胞凋亡率均高于正常NIH 3T3细胞,转染DJ-1基因的NIH 3T3阳性细胞凋亡率低于正常NIH 3T3细胞(P＜0.05).结论 DJ-1L166P和DJ-1M261基因突变均降低NIH3T3细胞增殖速率,DJ-1L166P和DJ-1M261基因突变更易导致NIH 3T3细胞的凋亡,DJ-1L166P和DJ-1M261基因突变对NIH3T3细胞增殖速率和细胞凋亡影响是相似的.     

诱导型一氧化氮合酶基因在3T3成纤维细胞中的转染和意义

目的观察人诱导型一氧化氮合酶基因(iNOS)转染3T3成纤维细胞的可能性.方法用阳性脂质体将含人诱导型一氧化氮的真核表达载体pcDNA3.0-iNOS转染至3T3细胞,用G418筛选,通过RT-PCR、免疫组化的方法鉴定.结果 pcDNA3.0-iNOS基因转染的3T3细胞有人iNOS基因mRNA的表达,细胞中有iNOS蛋白的表达,空载体和对照组没有表达.结论人iNOS基因能够在3T3成纤维细胞得到稳定转染和表达.     

人内皮抑素基因转染原代成人黑色素瘤细胞

目的:研究人内皮抑素（human endostatin,hEndo）基因转染的原代黑色素瘤细胞的体外和体内生物学特性。方法:先构建重组人内皮抑素的真核表达载体pcDNA3.1-hEndo,将人内皮抑素基因导入原代成人黑色素瘤细胞,检测转基因细胞hEndo蛋白的表达、分泌和抑制细胞增殖活性,并验证转基因细胞在体外和裸鼠体内的生长特性。结果:载体pcDNA3.1-hEndo经酶切后获得5.4kb和624bp条带,电转后G418筛选获得克隆;RT-PCR检测到转染细胞表达hEndo mRNA,Western blot检测到转染细胞分泌hEndo蛋白,MTT表明转基因细胞上清可抑制细胞增殖;裸鼠体内生长实验显示转基因黑色素瘤生长速度明显低于对照组（P<0.05）,肿瘤组织RT-PCR示hEndo基因稳定表达。结论:转hEndo基因原代黑色素瘤细胞可有效、稳定地表达有生物学活性的hEndo,hEndo能抑制瘤细胞在动物体内的生长速度。     

Inhibitory Effects of Anti-sense PTTG on Malignant Phenotype of Human Ovarian Carcinoma Cell Line SK-OV-3

To construct eukaryotic expression vector expressing full length anti-sense pituitary tumor transforming gene (PTTG) mRNA and observe its blocking effect on the potential invasion of human ovarian carcinoma cell line SK-OV-3. PCR primers containing designed enzyme cut sites were used for cloning full-length PTTG gene fragment, and the resulting PCR product was inserted into the eukaryotic vector pcDNA3. 1 in the antisense direction. The recombinant vector was then transfected into SK-OV-3 by Lipofectamine. The positive cell clone was screened by G418, PTTG and bFGF at protein level expression were detected by Western blot. The biological behavior change of transfection positive cells was observed by colony formation in soft agar assay. Our results showed that SK-OV-3 clones stably expressing full-length recombinant pcDNA3. 1-PTTGas were obtained. The expressions of PTTG and bFGF protein in transfected cells were decreased by 61.5% and 52.3%, respectively as compared with non-transfected ones. The number of colony formation was reduced significantly in transfected cells as compared with empty vector transfected and non-transfected cells. It is concluded that the recombinant vector pcDNA3. 1-PTTGas is a novel tool and provides an alternative anti-sense gene therapy targeted at PTTG in human carcinoma.