β-arrestin2抗基因RNA慢病毒载体体外基因沉默效应研究

目的:探讨β-arrestin2抗基因RNA慢病毒载体在体外工具细胞中的基因沉默效应及其携带的用于活体核磁共振成像监测的铁蛋白报告基因的表达.方法:用构建的β-arrestin2抗基因RNA慢病毒感染NG108-15细胞,实时荧光定量PCR和Western Blot方法检测β-arrestin2抗基因RNA慢病毒对工具细胞的β-arrestin2 mRNA和蛋白表达的下调作用,以及该病毒所携带的用于活体核磁共振成像监测的铁蛋白报告基因的表达.结果:构建的β-arrestin2抗基因RNA慢病毒能显著降低工具细胞中β-arrestin2 mRNA和蛋白的表达,与对照组相比实时荧光定量PCR和Western Blot方法检测的沉默效率分别为79%和82%(P<0.05).感染病毒组的NG108-15细胞的铁蛋白表达量显著升高,是对照组细胞的2.29倍(P<0.05).结论:构建的β-arrestin2抗基因RNA慢病毒在工具细胞中对β-arrestin2基因具有显著的沉默效应,该病毒携带的铁蛋白报告基因在工具细胞中表达.成功验证了β-arrestin2抗基因RNA慢病毒在体外的基因沉默效应和铁蛋白报告基因的表达,为该病毒的在体研究奠定了基础.     

慢病毒对大鼠骨髓间充质干细胞生物学特性的影响

目的 探讨慢病毒对大鼠骨髓间充质干细胞(rMSCs)生物学特性的影响.方法 将含有绿色荧光蛋白基因的慢病毒感染第3代rMSCs.观察感染的rMSCs的形态学;感染的rMSCs与FITC标记的抗大鼠CD29抗体、PE标记的抗大鼠CD90抗体及APC标记的抗大鼠CIM5抗体孵育后,立即检测细胞表面CD29、CD90、CD45的表达水平;感染的rMSCs在成骨诱导培养基中培养21 d时,观察骨细胞的形成情况;感染的rMSCs在成脂肪诱导培养基中培养14 d时,观察脂肪细胞的形成情况;感染的rMSCs培养1、2、3、4、5、6、7、8 d时测定细胞活力;感染的rMSCs在琼脂培养基中培养21 d时,观察细胞克隆的形成情况;将感染的rMSCs接种于BALB/c-nu/nu裸鼠背部,观察接种后42 d内接种部位肿瘤的形成情况.结果 感染的rMSCs的形态学无改变,表达CD29+ CD90+ CD45-,具有形成骨细胞和脂肪细胞的能力,细胞活力无明显改变,无细胞克隆形成,接种裸鼠后接种部位未见肿瘤形成.结论 慢病毒对大鼠骨髓间充质干细胞生物学特性无影响.     

用于包装复制缺陷性腺病毒的低代次293细胞的培养

目的:建立体外培养低代次293细胞的方法.方法:细胞复苏,将冻存的低代次293细胞于37℃水浴中快速融解,移入75 cm2细胞培养瓶中,加入10 mL低代次293细胞培养基,6～8 h细胞贴壁后更换培养基.细胞传代,吸出培养基,用1×柠檬酸盐细胞消化液洗2遍,留取0.5 mL 37℃消化5～10 min,待细胞脱壁后加入3 mL培养基,轻轻吹匀以1:2比率传代培养.细胞冻存,以1×柠檬酸盐细胞消化液消化5～10 min,细胞脱壁后加入5 mL细胞培养基中和消化液,离心收集细胞,以1 mL的细胞冻存液(90% FBS+10% DMSO)重悬、冻存.结果:细胞传代后8h细胞完全贴壁;以腺病毒感染质粒感染293细胞14 d后可观察到腺病毒空斑形成.结论:该方法操作简便,对细胞损伤小且保持细胞生物学特性不变.     

活鼠妇贴敷治疗鸡眼102例

目的:观察活鼠妇贴敷治疗鸡眼的疗效。方法:选取2006年6月—2010年12月本院门诊治疗的鸡眼患者234例,将患者随机分为治疗组102例、对照1组65例和对照2组67例。治疗组给予活鼠妇贴敷治疗,对照1组给予水杨酸苯酚贴膏治疗,对照2组给予电烧灼术治疗。结果:治疗组有效率91.18%,对照1组有效率75.38%,对照2组有效率82.09%,治疗组优于对照1组、对照2组(P0.05)。结论:活鼠妇贴敷治疗鸡眼疗效肯定,安全而无副作用,具有"简、便、验、廉"的特点。     

N-甲基-D-天门冬氨酸受体2B亚基抗原表位DNA疫苗免疫大鼠的效应

目的 采用N-甲基-D-天门冬氨酸受体2B亚基抗原表位(eNg2B)插人质粒载体pDC515中制备的DNA疫苗(pDC515/eNR2B)免疫大鼠,评价其免疫效应.方法 成年雄性SD大鼠40只,体重200～250 g,随机分为4组:对照组(C组)、PBS组、pDC515组和pDC515/eNR2B组,每组10只.PBS组、pDC515组和pDC515/eNR2B组分别肌肉注射PBS 100 μl、pDC515 100 μg和pDC515/eNR2B 100 μg进行免疫,1周后以等剂量再次免疫.于第1次免疫前、第2次免疫后8、14、21 d时,截尾法采集尾静脉血,分离血清,ELISA法检测NR2B抗体水平.于第2次免疫后21 d时处死大鼠取脊髓,分别采用免疫组织化学法和Western blot法检测NB2B抗体与自身腰段脊髓组织NR2B特异性结合情况.结果 第2次免疫后8 d,pDC515/eNR2B组血清中可检测到NR2B抗体,14 d时达高峰,并高滴度持续至21 d(P＜0.05);C组、PBS组和pDC515组均未检测到相应NR2B抗体;免疫组织化学法和Western blot法检测到pDC515/eNR2B组血清NR2B抗体可与自身脊髓组织NR2B结合.结论 pDC515/eNR2B可诱导SD大鼠产生体液免疫反应,所产生的自身抗体在血液中可高滴度存在一定时间.     

转基因细胞移植治疗慢性疼痛研究进展

转基因细胞移植作为一项新的生物干预手段，已被广泛应用于治疗多种疾病的研究。在疼痛治疗中，目前基因治疗主要有两个方向：上调抗痛基因表达和下调疼痛基因表达。转基因细胞移植主要是将抗痛基因转入基因工程细胞来上调抗痛基因表达。首先由Wu等提出，他将前垂体细胞AtT-20细胞(分泌β-内啡肽)转染人前脑啡肽基因后进行移植，发现能够发挥镇痛效应。     

N-甲基-D-天冬氨酸受体2B亚基基因重组腺病毒镇痛疫苗的构建

目的 构建携带N-甲基-D-天冬氨酸受体2B亚基(NR2B)基因的重组腺病毒镇痛疫苗.方法 以携带NR2B基因的腺病毒穿梭质粒pDC515-NR2B和腺病毒骨架质粒pBHGfrt(del)E1,3FLP共转染腺病毒包装细胞293细胞,连续观察细胞的形态学.取形成病毒空斑的293细胞,分别采用PCR、RT-PCR及Western blotting的方法从基因水平、转录水平和蛋白水平对病毒空斑筛选和鉴定,对鉴定正确的病毒空斑进行扩增和纯化.结果 转染后12 d可观察到细胞病变效应,15 d后形成病毒空斑.NR2B基因不仅正确插入重组腺病毒载体,而且可在293细胞正确表达NR2B蛋白.鉴定正确的病毒空斑命名为NR2B基因重组腺病毒5型镇痛疫苗,滴度为5×1011 VP/ml,纯度100%.结论 成功地构建了NR2B基因重组腺病毒镇痛疫苗,可用于疫苗镇痛的研究.     

四逆散应用举偶

四逆散出自《伤寒论》。由柴胡、芍药、枳实、甘草四味药组成。有疏肝理脾．透解郁热之效．是调和肝脾之代表方。笔者以此方加减治疗慢性胆囊炎、妇女痛经及急性细菌性痢疾等疾病．收到良好效果，现介绍如下：     

四环素调控系统修饰永生化大鼠星形胶质细胞株的构建及鉴定

目的构建四环素及其衍生物强力霉素诱导表达目的基因的永生化大鼠星形胶质细胞株。方法用脂质体法将逆转录病毒载体四环素调控系统中的质粒pRevTet-On转染病毒包装细胞 PT67,经筛选培养后获得病毒载体RevTet-On,采用RT-PCR进行鉴定,并应用NIH313细胞测定病毒滴度。将RevTet-On感染永生化大鼠星形胶质细胞,用有限稀释法挑选阳性细胞单克隆后扩大培养,每个克隆瞬时转染含萤光素酶报告基因的质粒pRevTRE-Lue,加入强力霉素48h后分别检测其萤光素酶活性值,挑选出强力霉素诱导表达高、背景表达低的细胞株并检测其诱导表达的时效、量效关系。结果 RT-PCR结果显示逆转录病毒包装成功,病毒最高滴度为7．4×105CFU／ml。RevTet-On转染永生化大鼠星形胶质细胞后挑选出48个单克隆,瞬时转染pRevTER-Luc后筛选出1株高表达低背景细胞株, 其诱导表达值为876．1 RLU,背景表达值为42．5 RLU,诱导倍数为20．6。该细胞株在加入诱导因子强力霉素1 h后目的基因即开始表达,在24 h时达到高峰,在强力霉素浓度100-2 000 ng/ml的范围内, 其诱导表达活性与药物浓度呈剂量依赖性。结论含四环素调控系统的永生化大鼠星形胶质细胞株诱导活性可靠,可用于调控表达外源基因的研究。