鼻咽癌中EB病毒启动子Qp的突变及其功能学研究

【目的】 探讨鼻咽癌细胞中启动EB病毒核抗原1(EBNA1蛋白)表达的EB病毒Q启动子(Qp)的变异特征,比较有第62 225位点(g→a)和第62 422位点(g→c)两个点突变的Qp与原型Qp(B95.8型)的功能学差异及其生物学意义&#65377;【方法】 采用PCR的方法扩增29例鼻咽癌组织石蜡标本和14例健康成人外周血标本(总共43例)中的Qp序列,PCR产物测序后分析其突变情况,统计学分析Qp中的点突变与鼻咽癌的相关性&#65377;把突变型和原型Qp分别克隆到荧光素酶报告基因载体上,检测相对光强度(RLU),比较突变型与原型Qp启动转录的活性&#65377;使用染色质免疫共沉淀(ChIP)实验来比较突变型和原型Qp与Sp1蛋白的亲和力&#65377; 【结果】 通过PCR扩增和测序实验,证实Qp的突变与鼻咽癌有密切的相关性(P = 0.0395,< 0.05)&#65377;突变型Qp启动转录的活性明显高于原型(RLU之比约为2.5:1,P < 0.05),并且突变型Qp与Sp1的亲和力较原型Qp增强约1.52倍&#65377;【结论】 在鼻咽癌组织中,突变型Qp可能通过增强与Sp1亲和力的机制,使其启动转录的活性明显增强&#65377;Qp特定位点的突变在EB病毒对鼻咽上皮细胞的感染和转化过程中可能起了重要的作用&#65377;     

RNA干扰LMP1阻滞淋巴瘤细胞于G0/G1期并提高细胞对顺铂的敏感性

目的 利用RNA干扰方法下调EB病毒潜伏膜蛋白1(1atent membrane protein,LMP1)的表达,探讨LMP1对化疗药物敏感性的影响.方法 采用小分子干扰片段转染EB病毒阳性淋巴瘤B95.8细胞,RT-PCR和Western blot分别检测LMPI的mRNA和蛋白的表达水平;联合应用化疗药物顺铂,通过MTT法观察细胞增殖活性变化.结果 干扰LMP1后,其mRNA和蛋白的表达均明显下调;细胞增殖能力减弱;细胞被阻滞在C0/G1期;并且细胞对顺铂的IC<,50>明显降低.结论 干扰LMP1提高了B95.8细胞对化疗药物的敏感性,揭示LMP1可能是一个潜在的药物靶点.     

在鼻咽癌细胞中EB病毒LMP1调控G1/S检测点重要相关蛋白的转录

目的在Tet-on-LMPlHNE2鼻咽癌细胞中探讨EB病毒编码的潜伏膜蛋白1（LMP1）调控p16和cyclinD1的转录．方法采用Westernblot方法、荧光素酶报道系统和RT-PCR方法检测在DOX诱导下不同时间点p16和cyclinD1的启动子活性和转录．结果LMP1可下调p16启动子活性和mRNA表达；同时上调cyclinD1启动子活性和mRNA表达．结论 在Tet-on-HNE2鼻咽癌细胞中EB病毒LMP1在转录水平调控G1／S检测点重要相关蛋白p16和cyclinD1的表达．     

广州地区鼻咽癌EB病毒LMP1基因N端XhoI酶切位点的丢失

目的：检测广州地区鼻咽癌组织EB病毒LMP1基因N-末端区Xho Ⅰ酶切位点的丢失，探讨LMP1基因变异在鼻咽癌发生发展中的作用。方法：收集中山大学肿瘤防治中心鼻咽癌新鲜活检标本63例以及EB病毒健康携带者外周血单个核细胞10例。采用QLAamp DNA Mini Kit和qlaAMP DNA Blood Mini Kit分别抽取组织和外周血单个核细胞的DNA，应用巢式PCR扩增EB病毒LMP1基因的N-末端区，并用Xho Ⅰ对扩增产物进行酶切。采用四色荧光末端终止法对扩增产物进行序列分析。结果：10例健康携带者外周血单个核细胞的EB病毒LMP1基因N-末端区均未见Xho Ⅰ酶切位点的丢失。63例鼻咽癌组织中有50例(79％)出现Xho Ⅰ酶切位点的丢失(Xho Ⅰ--loss)，4例(6％)为Xho Ⅰ酶切住点部分丢失，只有9例(14％)未见Xho Ⅰ酶切住点的丢失(wt--Xho Ⅰ)。除了Xho Ⅰ酶切住点的丢失(nt：169423～169428；GAGCTC→GA[T] CTC)外，还发现4个错义点突变。结论：广州地区EB病毒健康携带者外周血单个核细胞所携带的EB病毒LMP1基因为wt--Xho Ⅰ，而在鼻咽癌组织中主要为Xho Ⅰ—loss。因此，我们认为EB病毒LMP1基因N-末端区Xho Ⅰ酶切住点的丢失和其他的错义点突变可能是在鼻咽癌的发生发展过程中产生的。     

慢病毒携带shRNA抑制CR-1基因表达对 CNE-2细胞特性的影响

 【目的】 应用慢病毒介导的RNA干扰(RNAi)技术,有效沉默鼻咽癌细胞CNE-2的CR-1基因表达,研究CR-1对鼻咽癌细胞生物学行为的影响&;#65377; 【方法】 构建针对CR-1的siRNA慢病毒表达载体[含H1启动子和绿色荧光蛋白(GFP)]&;#65377;利用包装细胞293FT生产慢病毒,感染鼻咽癌细胞CNE-2, 流式筛选GFP阳性细胞&;#65377;应用荧光定量PCR&;#65380;Western blot检测病毒感染后CNE-2细胞中CR-1基因的mRNA和蛋白表达,获得干扰CR-1基因的细胞群&;#65377;并用MTT法&;#65380;平板克隆形成实验及Boyden侵袭小室观察CR-1干扰后对CNE-2细胞生物学行为的影响&;#65377; 【结果】 PCR 和测序证实,成功构建了CR-1 shRNA的慢病毒载体pLVTHM-shCR-1&;#65377;荧光定量PCR 和Western blot结果表明,所获得的细胞中CR-1 mRNA及蛋白表达水平较阴性对照组&;#65380;空白对照组均显著降低(P < 0.05)&;#65377;CR-1干扰后的细胞生长明显减慢,克隆形成能力减弱,侵袭运动能力下降&;#65377; 【结论】 通过RNAi技术阻断CR-1的表达,可抑制CNE-2细胞的生长&;#65380;增殖&;#65380;迁徙,提示CR-1在鼻咽癌的发生&;#65380;发展过程中起重要作用&;#65377;     

EB病毒潜伏膜蛋白1的研究进展

EB病毒 (Epstein -BarrVirus,EBV)是一类全球性分布、人群感染率较高的单纯疱疹病毒家族成员之一 ,是一种线状双链DNA病毒 ,感染者体内终生潜伏存在 ,有致瘤性。编码LMP1的基因位于EB病毒基因组U5 -TR区的BNLF - 1基因 ,为BamHINhet区域 ,由ED-L1和L1-TR激活子所控制。LMP1是由     

EB病毒LMP1在鼻咽癌细胞中通过IκBα的降解活化NF-κB

目的　阐明鼻咽癌细胞中EB病毒编码的潜伏膜蛋白 1(LMP1)活化核转录因子NF κB的机制。方法　利用强力霉素Dox诱导表达LMP1的鼻咽癌细胞株Tet on LMP1 HNE2为实验模型 ,首先应用免疫印迹方法测定Dox诱导后不同时相LMP1的表达动力学以及IκBs蛋白量及功能的改变。进而用间接免疫荧光法检测NF κB的亚细胞定位。最后采用瞬间共转染及报道基因活性分析分析NF κB的活性。结果　在鼻咽癌细胞Tet on LMP1 HNE2中 ,Dox处理 15分钟后LMP1的表达迅速升高并维持与较高水平直至 12 0分钟。LMP1的诱导性表达导致IκBα的磷酸化并降解 ,但IκBα蛋白总量无改变。继IκBα的磷酸化并降解 ,NF κB(P6 5 )自胞浆易位至胞核且活性升高。IκBα的显性负性突变子抑制NF κB(P6 5 )的核易位及报道活性。LMP1的诱导性表达并未引起IκBβ蛋白水平变化。结论　在鼻咽癌细胞Tet on LMP1 HNE2中 ,EB病毒LMP1通过IκBα的磷酸化并降解激活核转录因子NF κB的活性 ,并且 ,LMP1诱导的NF κB活性能被IκBα的显性负性突变子完全抑制。IκBβ在此信号传导途径中无改变。LMP1表达前后IκBα蛋白总量维持恒定可能是由于NF κB的活化迅速启动了IκBα的重头合成这一自身调节环路所致。     

中山市EB病毒筛查阴性人群12年追踪随访

【目的】探讨EB病毒在人体内的变化规律及其与鼻咽癌发病的关系 ,及其对鼻咽癌筛查策略的影响。【方法】通过前瞻性方法对中山市 1986 - 1987年鼻咽癌首次筛查EB病毒抗体阴性人群 (385 5 0人 )随访 12年的资料以及首次筛查阳性人群 (2 92 1人 )随访 7年的资料进行比较 ,观察上述人群EB病毒VCA/IGA的变化规律及其与鼻咽癌发病的关系。【结果】EB病毒抗体VCA/IGA阴性队列每年都有一定的转阳率 (2 2 8% ) ,其头 3年鼻咽癌发病风险仅为一般人群的 11%左右 ,以后逐渐增加 ,但仍低于一般人群 ;与阴性队列比较 ,阳性队列鼻咽癌发病风险高 ,相对危险度达 2 3 2 2倍 (P <0 0 5 )。【结论】VCA/IGA阴性人群有一定比例可转为阳性 ;VCA/IGA阴性队列在较长的时间内保持鼻咽癌发病较一般人群及阳性人群低 ;EB病毒可能是鼻咽癌发病因素 ,EB病毒检测可预测鼻咽癌发生风险 ,通过抑制EB病毒活性可能达到预防鼻咽癌的目的     

siRNAs干扰EBNA1下调EBV阳性鼻咽癌细胞内ALOX12的表达

 【目的】 利用RNA干扰技术抑制C666-1细胞中EB病毒核抗原1(EBNA1)的表达,探索氧化应激与抗氧化相关基因的表达变化&#65377; 【方法】 采用蛋白质印迹证实了能有效抑制EBNA1表达的干扰序列,使用甲基噻唑基四唑(MTT)方法检测C666-1细胞的存活率,利用实时定量PCR芯片技术探索了氧化应激与抗氧化相关基因的转录谱变化,并通过反转录聚合酶链反应(RT-PCR)和蛋白质印迹进行了验证&#65377;【结果】 EBNA1-1414和EBNA1-1437干扰序列转染C666-1细胞48 h后,分别可抑制59%和56%的EBNA1蛋白表达,细胞存活率分别降低了33%和24%&#65377;PCR芯片实验发现干扰EBNA1表达后48 h C666-1细胞中花生四烯酸盐12-脂氧合酶(ALOX12)蛋白表达有下调,谷胱甘肽还原酶(GSR)和过氧化物酶3(PRDX3)在转录水平表达上调&#65377; 【结论】 EBNA1或许能够通过上调ALOX12的表达间接地发挥促鼻咽癌作用&#65377;     

膀胱癌抑癌基因Apaf-1和APC的甲基化状况 及其临床意义

 【目的】 研究抑癌基因细胞凋亡蛋白酶活化因子-1(Apaf-1)和腺瘤性结肠息肉病相关基因(APC)的启动子甲基化状况与膀胱癌临床病理的关系及对患者复发的影响&#65377;【方法】采用甲基化特异性PCR方法检测110例膀胱癌组织中Apaf-1和APC的启动子甲基化状态,以15例正常膀胱黏膜组织为对照组&#65377;【结果】 Apaf-1和APC基因在膀胱癌组织中的甲基化率为90.0%和82.7%,在正常膀胱组织为6.77%和20.0%,差异分别有统计学意义(P均 = 0.000)&#65377;Apaf-1及APC的甲基化率与肿瘤分化程度及临床分期有明显的相关性,随肿瘤分级&#65380;分期的增加而升高&#65377;在复发组与未复发组的比较中,Apaf-1的甲基化阳性率分别为97.6%(41/42)和85.3%(58/68),差异有统计学意义(χ2 = 4.382,P = 0.036),而APC的甲基化率分别为85.7%(36/42)和80.9%(55/68),差异无统计学意义(χ2 = 0.424, P = 0.515)&#65377;【结论】 Apaf-1及APC的甲基化改变在膀胱癌的发生&#65380;发展过程中具有重要作用,Apaf-1启动子甲基化可能成为膀胱癌患者预后判断的分子标志物&#65377;     

端粒酶启动子调控tk基因靶向性杀伤鼻咽癌细胞的实验研究

目的 探讨端粒酶催化亚单位启动子/胸腺嘧啶脱氧核苷激酶(hTERTp/tk)基因特异载体在体外靶向性杀伤鼻咽癌细胞的效应.方法 通过细胞转染将hTERTp/tk转染鼻咽癌细胞株中,采用RT-PCR及MTT法检测hTERTp/tk/pGL3体外特异性杀伤鼻咽癌细胞的效应及其tk基因、端粒酶表达.结果 转染hTERTp/tk/pGL3后可见tk基因表达,端粒酶及其hTERT表达较对照组下降.hTERTp/tk/pGL3能特异性杀伤鼻咽癌HNE1细胞,而对正常成纤维细胞无杀伤作用,hTERTp/tk/pGL3杀伤细胞的效应比阳性对照CMV/tk/pGL3的无选择性杀细胞作用略低.结论 hTERTp/tk基因特异表达系统具有靶向性杀伤鼻咽癌细胞的作用及抑制肿瘤细胞端粒酶活性.     

鼻咽癌差异表达miRNAs筛选研究

 【目的】应用miRNAs芯片筛选原代培养的鼻咽癌细胞差异表达miRNAs，并寻找差异表达miRNAs调控的靶基因，为进一步研究其在鼻咽癌发病机制中的作用打下基础。【方法】运用miRNAs芯片技术筛选原代培养的鼻咽癌细胞差异表达miRNAs，同时运用miRNAs特异的引物组对差异表达的miRNAs进行荧光定量RTPCR验证。运用靶基因预测软件并结合全基因组表达谱芯片结果预测差异表达miRNAs可能调控的靶基因，并利用westernblot技术检测预测的靶基因在原代培养的鼻咽癌细胞中的表达。【结果】miRNAs芯片结果显示，鼻咽癌中miR-203、miR-503、miR-424、miR-141和miR-148a表达下调，而miR-25、miR-195和miR-15a表达上调，其差异表达均在2倍以上；荧光定量RTPCR结果与miRNAs芯片的结果较符合；其中miR-203的预测靶基因为CCNG1和SPARC，Western blot结果显示，其在原代培养的鼻咽癌细胞亦高表达。【结论】miR-203、miR-503、miR-424、miR-141、miR-148a、miR-25、miR-195、miR-15a在原代培养的鼻咽癌细胞与正常鼻咽上皮细胞中存在差异表达；CCNG1和SPARC可能是miR-203调控的靶基因，可能参与了鼻咽癌的发生发展。     

EBV-LMP1促CNE2细胞迁移的作用机制

目的：探讨EBV-LMP1对鼻咽癌细胞CNE2迁移表型的影响及作用机制。方法：用RV-LNSX，RV-LMP1和RV-LMP1^TRADD。逆转录病毒分别感染CNE2细胞，G418筛选后，观察和检测转基因细胞的形态学特点，在基质中的运动迁移能力以及R-钙黏蛋白（E-Cadherin）表达的变化；用pLNSX，pLNSX-LMP1和pLNSX—LMPI^TRADD质粒分别与E-Cadherin报告基因共转染293细胞，检测LMP1对E-Cadherin启动子活性的影响。结果：与CNE2和CNE2-LNSX细胞相比，CNE2-LMP1在培养过程中由扁平、鹅卵状上皮细胞形态逐渐演变为细胞间接触消失的长梭状纤维细胞形态，相对迁移明显增大（n=3，P〈0.05）。且E-Cadherin表达明显下调或缺失；随着共转染野生型LMP1（pLNSX-LMP1）剂量的增加（0．2，0、6，1．0μg），对E／-Cadherin启动子转录活化的抑制率增加，呈明显浓度依赖性；LMPI^TRADD不改变CNE2细胞形态学及迁移表型，对E-Cadherin启动子的转录活性及蛋白表达亦无明显影响。结论：抑制E-Cadherin启动子活化可能是EBV-LMP1下调E-Cadherin蛋白表达、促CNE2细胞迁移的机制之一，位于LMP1羧基端的TRADD可能是其促迁移的主要活性部位。     

胡芦巴对Caco-2细胞NPC1L1基因的mRNA表达水平的影响

目的探讨胡芦巴的降脂机制,观察经胡芦巴水溶液处理后,Caco-2细胞中NPC1L1(胆固醇吸收的主要载体基因)的mRNA表达水平。方法将胡芦巴水溶液暴露于Caco-2细胞中24、42、48小时,未处理组作为对照组,从细胞中分离mRNA进行Real-Time PCR分析,采用ABI PRISM7000生物程序分析系统测定Caco-2细胞的NPC1L1的mRNA表达水平。结果经胡芦巴水溶液处理的Caco-2细胞NPC1L1的mRNA表达水平与对照组(未治疗组)相比降低47%。结论胡芦巴可降低Caco-2细胞的NPC1L1的mRNA表达水平。     

27-羟基胆固醇对神经细胞和星形胶质细胞溶酶体胆固醇转运相关因子表达的影响

目的 探讨27-羟基胆固醇（27-hydroxycholesterol,27-OHC）在神经细胞（SH-SY5Y）和星形胶质细胞（C6）共培养体系中对细胞溶酶体胆固醇转运相关因子表达的影响。方法 采用Trans-well小室进行SH-SY5Y细胞和C6细胞共培养,使用不同剂量的27-OHC对共培养体系下细胞进行处理,分为对照组（DMEM组）、低剂量组（27-OHC 5 μmol/L）、中剂量组（27-OHC 10 μmol/L）及高剂量组（27-OHC 20 μmol/L）。采用COD-PAP法检测两种细胞中的总胆固醇浓度;采用Real-time PCR和Western blotting检测两种细胞溶酶体内特异性胆固醇转运蛋白质——尼曼匹克蛋白质1（Niemann-Pick C protein 1,NPC1）、NPC2的基因表达水平和蛋白质表达水平。结果 随着27-OHC处理浓度的升高,SH-SY5Y细胞内胆固醇浓度逐渐上升（P<0.05）,C6细胞内胆固醇浓度逐渐降低（P<0.05）;SH-SY5Y细胞溶酶体内NPC基因及蛋白质表达水平显著下调（P<0.05）;C6细胞内溶酶体NPC基因及蛋白质表达水平显著上调（P<0.05）。结论 27-OHC可引起神经细胞及星形胶质细胞溶酶体内胆固醇转运障碍,使胆固醇在神经细胞溶酶体内蓄积。     

Association of E-cadherin and β-catenin with metastasis in nasopharyngeal carcinoma

Background This study was designed to detect methylation of E-cadherin gene promoter and gene mutation of β-catenin in exon 3 and their expression of protein and mRNA in primary tumor and lymph node metastatic tumor of nasopharyngeal carcinoma (NPC), and investigate the mechanism of invasion and metastasis of neoplastic cells in NPC. Methods Fourty-two fresh biopsy samples were taken from untreated NPC patients at the Affiliated Hospital of Sun Yat-sen Medical College, Sun Yat-sen University, Guangzhou, China during the period of 1999 -2002. Among them 21 were taken from primary tumors and the other 21 from lymph node metastatic tumors. The gene promoter methylation of E-cadherin was detected by methylation-specific PCR (MSP). The mutation in exon 3 of β-catenin was detected by direct sequencing analysis. RT-PCR, Western blot and immunohistochemical staining were used to detect the mRNA and protein expression patterns in both primary and metastatic tumors of NPC. Results Down-regulated expression of E-cadherin in metastatic tumor was compared with that in primary tumor. Reduced expression of E-cadherin was found to be correlated with lymph node metastatic tumor of NPC ( P = 0. 004) ; but there was no obvious correlation between primary and metastatic tumors in the expression of β-catenin (P = 0. 698). The mRNA expression level of Ecadherin in metastatic tumors decreased significantly compared with that in primary tumors. However, little change was observed in the mRNA level of β-catenin in different tumor tissues. Only 4 samples (19. 1%) displayed gene promoter methylation of E-cadherin in primary tumor and 10 samples (47. 6%) showed methylated form of E-cadherin. The gene promoter methylation of E-cadherin was more common in metastatic tumor than in primary tumor of NPC ( P =0. 024). Only 2 (4. 76% ) of the 42 samples showed mutations in exon 3 of β-catenin at 41 (T41A, ACC→GCC) and codon 47(S47T, AGT→ACT). The cytoplasmic and nuclear expression of β-catenin in tumor was not found in any samples of NPC. Conclusions The results suggest that the downregulation of E-cadherin results from the gene promoter aberrant methylation of E-cadherin and that the methylation of E-cadherin plays an important role in invasion and metastasis of tumor cells in NPC. However, β-catenin mutation is an infrequent event in NPC, and β-catenin is not a critical factor influencing the invasion and metastasis of tumor cells in NPC.     

应用激光捕获显微切割和蛋白质组学技术筛选鼻咽癌的差异表达蛋白质

目的:筛选鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma,NPC)的差异表达蛋白质,为寻找NPC的分子标志物提供科学依据. 方法:采用激光捕获显微切割技术(laser capture microdissection,LCM)分别从NPC组织和正常鼻咽上皮组织(normal nasopharyngeal epithelial tissue,NNET)中纯化NPC细胞和正常鼻咽上皮细胞(normal nasopharyngeal epithelial cells,NNEC),应用二维凝胶电泳(2-DE)分离LCM 纯化细胞的蛋白质,图像分析识别差异表达的蛋白质点,基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)和电喷雾电离串联质谱(ESI-Q-TOF-MS)鉴定差异蛋白质点,Western 印迹和组织芯片(tissue microarray,TMA)免疫组织化学验证差异蛋白鳞状细胞癌抗原1(SCCA1)在两种组织中的表达水平.结果:建立了LCM 纯化的NPC细胞和NNEC的2-DE图谱,质谱鉴定了36个差异蛋白质,其中20个蛋白只在NPC表达或表达上调,16个蛋白在NPC中表达下调或缺失. Western 印迹和组织芯片免疫组织化学结果显示:SCCA1在NPC中的表达水平较NNET明显下调,与比较蛋白质组学结果一致.结论:36个差异蛋白可能与NPC的发病有关,为筛选NPC分子标志物奠定了基础.     

18F-FDG SPECT/CT显像在鼻咽癌诊断及分期中的价值

[目的]评价18F-FDG符合线路显像同机CT图像融合在鼻咽癌诊断及分期中的价值.[方法]27例鼻咽癌病人(初发12例、放疗后病人15例)和对照组11例进行18F-FDG SPECT显像及同机CT图像融合检查.[结果]①鼻咽部恶性病灶的长径和最大面积与L/B比值呈正相关,相关系数分别为0.835和0.815(P＜0.01).②27例患者中,18F-FDG符合显像诊断鼻咽部恶性病灶的敏感性、特异性、准确率分别为100%、86.4%和92.1%;其中鉴别鼻咽癌放疗后的复发或残存分别为100%(4/4)、81.8%(9/11)和86.7%(13/15).③18F-FDG显像准确地检测原发鼻咽癌转移灶,其中2例分期上调,占(2/12)16.7%;3例分期下调,占(3/12)25%.有效地评价15例鼻咽癌病人放疗后的状况,帮助再分期.④同机CT图像融合能提供较准确的定位诊断.[结论]18F-FDGSPECT显像在鼻咽癌诊断及分期中有实用价值,值得临床广泛应用.