硝化应激参与同型半胱氨酸诱导的血管内皮细胞自噬降低

本研究旨在探讨硝化应激与同型半胱氨酸(Hcy)诱导血管内皮细胞自噬降低之间的关系。利用饮食法建立高同型半胱氨酸血症(HHcy)大鼠模型,利用免疫组织化学染色法分别检测大鼠胸主动脉自噬相关蛋白及硝化应激相关蛋白的表达。体外培养人脐静脉内皮细胞,用Hcy刺激内皮细胞,提取细胞蛋白,检测自噬相关蛋白及硝化应激相关蛋白的表达。利用FeTMPyP预处理Hcy刺激的HUVECs细胞,检测上述相关蛋白表达的变化。结果显示HHcy大鼠模型建立成功,同时其胸主动脉LC3表达下降,p62表达增加,NT表达增加;Hcy处理的HUVECs自噬水平明显降低,而FeTMPyP预处理能够降低NT表达,逆转Hcy导致的细胞自噬水平降低。本研究表明硝化应激参与了同型半胱氨酸诱导的血管内皮细胞自噬降低。     

Liguzinediol调控心肌细胞线粒体动力学和自噬改善心肌梗死后大鼠心功能的机制

目的：观察川芎嗪衍生物2,5?二羟甲基?3,6?二甲基吡嗪（liguzinediol,Lig）对左冠状动脉前降支结扎致心肌梗死大鼠的心功能改善作用及其潜在机制。方法：结扎大鼠心脏左冠状动脉前降支复制大鼠心肌梗死模型,给予不同剂量Lig（5、10、20 mg/kg）及阳性药地高辛（0.033 2 mg/kg）治疗12周。超声心动图检测心功能;试剂盒检测心肌损伤标志物脑钠肽（brain natriuretic peptides,BNP）、乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase,LDH）和三磷酸腺苷（adenosine triphosphate,ATP）含量;HE染色观察心肌形态;电镜检测线粒体形态;Western blot检测线粒体动力学相关蛋白的表达水平;免疫组织化学染色检测线粒体自噬相关蛋白的表达水平。复制氧糖剥夺（oxygen glucose deprivation,OGD）H9C2细胞模型。使用Lig干预细胞,并将自噬激动剂和抑制剂与Lig结合使用。Western blot检测线粒体自噬相关蛋白的表达;转染LC3B腺病毒检测自噬水平;荧光标记检测线粒体膜电位、活性氧（reactive oxygen species,ROS）水平和细胞凋亡。结果：Lig各个剂量均能显著升高心肌梗死模型大鼠射血分数（ejection fraction,EF）、左室短轴缩短率（fractional shortening,FS）,减小左室收缩末期内径（left ventricular dimension in systole,LVIDs）。Lig可显著降低心肌梗死模型大鼠血清BNP、LDH,并增加大鼠心脏中ATP水平。Lig改善心肌梗死大鼠心肌细胞及线粒体形态,调节心肌梗死大鼠心脏中线粒体动力学相关蛋白表达并促进自噬。在体外,Lig减少OGD模型H9C2细胞的ROS含量,促进线粒体自噬和融合,保护线粒体膜电位,减少H9C2细胞凋亡。自噬激动剂与Lig的合用部分增加了Lig对OGD模型H9C2细胞的保护作用,自噬抑制剂则可改变Lig对OGD模型H9C2细胞线粒体的调节作用及对凋亡的抑制作用。结论：Lig可促进线粒体自噬和融合,维持线粒体形态和功能完整,减少心肌细胞凋亡,改善心肌梗死大鼠的心功能。     

同型半胱氨酸对乳鼠心肌细胞自噬水平及mTOR信号通路的影响

高同型半胱氨酸血症(HHcy)是心血管疾病的一个独立的危险因素,但其对心肌的损伤机制尚不清楚。细胞自噬是近几年研究比较热门的细胞自身保护机制,有研究发现同型半胱氨酸(Hcy)可抑制神经细胞的自噬水平,但其对心肌细胞自噬水平的作用尚不清楚。本研究利用体外细胞实验初步探讨Hcy对心肌细胞自噬水平及自噬调节信号通路mTOR通路的影响。通过原代乳鼠心肌细胞体外培养,给予Hcy共孵育刺激,利用western blot检测心肌细胞自噬相关蛋白LC3表达水平的改变以及mTOR信号通路蛋白磷酸化水平的改变;给予LC3双标签腺病毒Ad-GFP-RFP-LC3感染细胞24 h后,进行Hcy刺激,利用激光共聚焦显微镜观察自噬流的改变;对心肌细胞进行AnnexinV/PI双标记染色,利用流式细胞仪计数检测细胞凋亡情况。结果发现,给予Hcy刺激后,乳鼠心肌细胞凋亡率升高,自噬水平降低,自噬调节信号通路mTOR及其下游p70 S6K磷酸化水平升高。 这些结果提示Hcy可降低心肌细胞自噬水平,mTOR信号通路可能参与其中。     

HSPB1对H2O2诱导大鼠心肌细胞损伤中线粒体膜电位的影响

目的:观察热休克蛋白B1(heatshockproteinB1,HSPB1)对H2O2诱导的大鼠心肌细胞损伤过程中线粒体膜电位(DY)的影响,从线粒体水平阐明HSPB1保护心肌细胞抗氧化损伤机制。方法:以本室建立的稳定转染人HSPB1的大鼠心肌细胞系H9c2(HSPB1H9c2)和空载体转染的H9c2(CON)为实验对象,300μmol/LH2O2刺激2、4和8h后,倒置光学显微镜观察细胞形态学变化,荧光探针JC鄄1测定线粒体膜电位。结果:HSPB1高表达显著抑制了H2O2诱导的典型凋亡形态学改变;HSPB1高表达使线粒体膜电位升高42%以上(P<0.001);HSPB1高表达显著抑制线粒体膜电位下降,H2O2刺激2、4、8h后,HSPB1H9c2和CON的线粒体膜电位分别降至刺激前的69.5%和66.5%(P<0.05),74.4%和67.0%(P<0.05),70.7%和58.1%(P<0.05)。结论:HSPB1有效抑制了氧化应激诱导的以凋亡为主的细胞损伤和线粒体膜电位丧失,提示线粒体膜电位的稳定可能参与了HSPB1抗心肌细胞的氧化损伤机制。     

大鼠严重烧伤早期心肌线粒体Ca2+转运变化及其机制研究

目的 探讨严重烧伤早期心肌线粒体Ca^2 转运变化及其发生机制。方法 复制30%Ⅲ度烫伤大鼠模型,测定伤后1、3、6、12、24h大鼠心肌线粒体Ca^2 转运速率,同时检测影响Ca^2 转运的相关指标--心肌细胞胞浆Ca^2 浓度（[Ca^2 ]c）、线粒体膜电位及ATP含量。结果 伤后1h心肌线粒体Ca^2 摄取速率明显升高,而Ca^2 释放速率无明显改变,但3、6、12、24h心肌线粒体Ca^2 摄取与释放速率、线粒体膜电位、ATP含量均显著降低,且烧伤后线粒体Ca^2 摄取速率与膜电位呈明显正相关,Ca^2 释放速率与线粒体ATP含量呈显著正相关。而伤后3、6、12、24h[Ca^2 ]c均明显高于正常对照组。结论 ①烧伤初始心肌线粒体Ca^2 摄取加强,伤后续阶段线粒体Ca^2 转运紊乱;②线粒体膜电位下降、ATP含量降低是烧伤后续阶段心肌线粒体Ca^2 转运紊乱的主要原因,伤后[Ca^2 ]c升高或有升高趋势也参与严重烧伤早期心肌线粒体Ca^2 转运变化的发生。     

磷酸肌酸保护心肌细胞线粒体功能机制初探

目的：探讨磷酸肌酸(phosphocreatine，CP)保护心肌细胞线粒体功能的机制。方法：采用胶原酶分离成年大鼠心肌细胞，0．2mmoL／L过氧化氢(hydrogen peroxide，H2O2)刺激细胞，于刺激前10min加入1mmol／L、10mmol／L CP，利用荧光探针JC-1结合流式细胞仪检测线粒体膜电位的变化；Annexin-V／PI及TUNEL。染色法鉴定心肌细胞的凋亡。使用10μmoL／L鱼藤酮及2μmoL／L碘乙酰胺分别抑制呼吸链及磷酸肌酸激酶(CK)，观察其对CP保护作用的影响。结果：H2O2导致线粒体膜电位下降，细胞凋亡增加。磷酸肌酸有效地抑制了线粒体膜电位的下降，减少了细胞凋亡。鱼藤酮及碘乙酰胺可使其保护作用消失。结论：CP能够抗心肌细胞氧化损伤，其机制可能依赖于减低线粒体膜电位的下降，保护线粒体正常功能。     

线粒体自噬在心肌梗死中的作用及研究进展

心肌梗死(MI)是指营养心脏的冠状动脉发生病变后,灌注血流急剧减少或中断,使心肌出现持久而严重的急性缺血缺氧导致的心肌缺血性坏死。心肌梗死患者心肌损伤的机制亟待明确,寻找干预靶点具有重要的临床价值。线粒体作为提供能量的细胞器,是心肌细胞内的主要能量来源,负责三磷酸腺苷(ATP)生成和能量代谢,线粒体完整性和功能的丧失是改变心脏结构和功能的重要病理因素,是心肌细胞不断收缩和舒张的关键保障。心肌梗死时线粒体功能异常是心肌损伤的重要机制,线粒体质量控制是指线粒体在生成与清除之间维持平衡,对维持细胞的生存及功能显得尤为重要。线粒体自噬与神经退行性疾病、心血管疾病、癌症等多种疾病相关。线粒体自噬是以损伤的线粒体作为自噬底物的一种选择性自噬,在心血管功能稳态的维持中具有重要作用。心肌缺血时,心肌细胞发生线粒体损伤,而线粒体自噬能通过促进降解和回收受损的线粒体以进行线粒体质量控制,进而保护缺血的心肌细胞。对于正常心肌细胞来说,足够的线粒体生成能够保证充足的能量供应;但当外界刺激导致线粒体损伤时,如果受损线粒体未及时清除造成堆积,会造成心肌细胞氧化应激损伤甚至引起细胞凋亡。线粒体自噬过程复杂,涉及诸多生理学及病理学过程,有多种物质如蛋白及RNA参与调控。本文将探讨线粒体自噬在心肌梗死中扮演的重要角色和相关机制。      

衰老心肌中热休克因子1的表达与线粒体损伤的关系

目的 探讨衰老心肌中热休克因子（heat shock factor 1,HSF1）的表达与线粒体损伤的相关性。方法 选用4月龄、24月龄的C57 BL/6小鼠作为年轻鼠和衰老鼠,运用透射电镜观察心肌组织中线粒体形态学的改变。用ATP检测试剂盒检测衰老心肌及H9C2心肌细胞中ATP的含量,利用活性氧（reactive oxygen species,ROS）检测试剂盒分析衰老心肌及H9C2心肌细胞中ROS的变化,采用JC-1染色法检测心肌细胞膜电位的改变,利用Western blotting法检测心脏组织及心肌细胞中HSF1的表达。结果 与年轻小鼠相比,衰老小鼠心肌组织中线粒体的形态异常;衰老小鼠心肌组织中ATP含量下降（1.253±0.059 vs 0.479±0.122,P=0.012）,ROS的含量上升（10.853±0.096 vs 1.550±0.233,P=0.025）;衰老小鼠心肌组织中HSF1的表达增高（0.980±0.112 vs 1.979±0.175,P=0.013）;衰老心肌中HSF1的表达与ATP的浓度呈负相关（r=-0.977,P=0.005）,与ROS的含量呈正相关（r=0.934,P=0.020）;过氧化氢（H₂O₂）刺激后H9C2心肌细胞线粒体膜电位下降,ATP含量下降,ROS的含量上升,HSF1表达升高（P<0.05）。结论 衰老的心肌中损伤的线粒体功能与HSF1的表达呈负相关。     

球形脂联素对间歇低氧所致H9C2细胞损伤的保护作用及机制

目的：探讨Parkin介导的线粒体自噬在球形脂联素(globular adiponectin,gAPN)减轻间歇低氧(intermittent hypoxia, IH)所致H9C2心肌细胞损伤中的作用及相关机制。方法：建立H9C2细胞IH模型来模拟阻塞性睡眠呼吸暂停低通气综合征。 采用流式细胞术检测细胞凋亡。采用JC-1试剂盒检测线粒体膜电位(mitochondrial membrane potential,MMP)。采用免疫印迹法检测Parkin、Bax、Bcl-2蛋白表达。采用Parkin siRNA抑制Parkin基因表达。采用LC3与线粒体红色荧光探针进行荧光共定位检测线粒体自噬。结果：IH暴露后,H9C2细胞凋亡率、Bax及Parkin蛋白表达水平、线粒体自噬明显升高,MMP下降,Bcl-2 蛋白表达水平下降;给予gAPN保护后,IH+gAPN组细胞凋亡率、Bax蛋白表达水平较IH组下降,MMP较IH组升高,Bcl-2及 Parkin蛋白表达水平、线粒体自噬也较IH组升高。抑制Parkin基因表达后,线粒体自噬明显下降,线粒体损伤、心肌细胞凋亡率明显增加。结论：gAPN通过上调Parkin介导的线粒体自噬减轻IH所致H9C2心肌细胞损伤。     

姜黄素通过AMPK/FUNDC1缓解 LPS诱导的心肌细胞损伤

目的 阐明AMPK/FUNDC1在姜黄素(curcumin,Cur)减轻脂多糖诱导的心肌细胞毒性中的作用及机制。方法将分离的乳鼠心肌原代细胞(neonatal mouse cardiomyocytes, NMCMS)构建脂多糖损伤模型。以CCK-8细胞活力检测试剂盒检测细胞活力、ROS检测试剂盒检测ROS生成量、ATP检测试剂盒检测线粒体ATP生成、JC-1荧光染色观察线粒体膜电位、Western blot法检测自噬标志蛋白的表达情况。结果 与Con组比较,LPS处理后显著降低心肌细胞活力且ROS水平显著增加,同时AMPK的磷酸化水平及线粒体自噬标志蛋白FUNDC1的表达显著降低。Cur处理后这种改变被显著逆转,从而保护NMCMS免受LPS诱导的心肌细胞毒性损伤。而siAMPK的加入则部分抵消Cur对心肌细胞的保护作用,此外线粒体自噬抑制剂3-MA及线粒体自噬激活剂rapamycin处理后表明,FUNDC1作为AMPK的下游的关键调控分子,参与Cur对LPS诱导的心肌损伤的保护作用。结论 Cur通过激活AMPK/FUNDC1信号通路,缓解LPS诱导的心肌细胞毒性。     

人脐带间质干细胞来源的外切体对大鼠心肌细胞缺血/再灌注损伤的作用

［摘要］目的： 研究人脐带间质干细胞来源的外切体（hucMSC exosome）对大鼠缺血/再灌注（I/R）损伤心肌细胞的修复作用。方法： 在体内,建立大鼠I/R模型：经冠状动脉左前降支（LAD）结扎缺血30 min后取消结扎恢复灌注,与此同时,尾静脉注射hucMSC exosome。在体外,建立大鼠H9C2(2 1)心肌细胞缺氧/复氧（H/R）模型：细胞于无血清低糖培养基中缺氧（5% CO2/93% N2）24 h后,用含hucMSC exosome的高糖10% FBS培养液复氧24 h。采用MTT法、TUNEL法、心肌酶谱以及线粒体膜电位等方法检测大鼠心肌细胞的增殖和凋亡状况。结果： 在体内,心肌细胞经I/R损伤后,hucMSC exosome与hucMSC处理组较PBS处理组血清乳酸脱氢酶（LDH）、肌酸激酶同工酶（CK MB）值均下降;TUNEL结果显示,前两组较PBS处理组心肌细胞凋亡明显减少;在体外,心肌细胞经H/R损伤后,MTT实验表明细胞增殖显著减弱,hucMSC exosome作用后,TUNEL及线粒体膜电位(ΔΨm)结果分别显示受损心肌细胞凋亡以及膜电位下降明显减少。结论： hucMSC exosome能有效抵抗心肌细胞因缺血/再灌注损伤而引起的细胞凋亡。     

EGB对缺血心肌线粒体膜脂质过氧化与ATP酶活性的影响

目的　探讨银杏叶提取物 (EGB)对缺血心肌的细胞保护机制。方法　用垂体后叶素 (2 0U/kg,腹腔内注射 )复制小鼠急性心肌缺血模型 ,观察不同剂量 (10 0mg/kg ,2 0 0mg/kg)EGB对心肌缺血 6 0min线粒体获得率 ,膜磷脂含量 ,Ca2 + ATP酶 ,Mg2 + ATP酶活性 ,MDA及胞浆SOD活性变化的影响。结果　预先给予EGB可有效抑制缺血所致线粒体膜磷脂含量减少 ,MDA水平增高 ,提高线粒体Ca2 + ATP酶及胞浆SOD酶活性 ,其部分作用表现为剂量依赖性。结论　EGB对缺血心肌的保护作用可能与其增加胞液SOD活性 ,防止线粒体膜脂质过氧化 ,维持线粒体膜Ca2 + ATP酶活性 ,改善缺血心肌细胞Ca2 + 转运有关。     

过氧化氢在大鼠心脏缺氧再灌注时的细胞化学定位

目的：研究心肌缺氧再灌注时过氧化氢的产生部位。方法：以大鼠为实验动物，CeCl3为捕捉剂，用细胞化学的方法进行检测，并用X－射线能谱分析的方法对沉淀颗粒进行元素分析。结果：血管内皮细胞及部分心肌的线粒体肿胀。内皮细胞腔面、基底膜、肌细胞膜都有沉淀颗粒，以血管内皮细胞腔面最多。结论：缺氧再灌注时，不仅损伤内皮细胞，而且损伤至每一个心肌细胞。     

红花黄色素改善大鼠缺氧心肌能量代谢的研究

目的 探讨红花黄色素(SY)缓解大鼠心肌缺氧性损伤作用及其对能量代谢的影响。方法 建立大鼠离体心脏的冠状动脉灌流模型，以2，4—二硝基苯肼比色法测心室肌组织乳酸脱氢酶(LDH)漏出量，以荧光素酶法测心室肌组织ATP含量，透射电镜观察心尖部组织超微结构；制备大鼠心室肌组织线粒体混悬液，分别以比浊法与荧光偏振法观察线粒体肿胀与膜流动性的变化。结果 SY可减少大鼠低灌流离体心脏LDH漏出，缓解心室肌组织ATP含量下降及其超微结构的损伤；SY可缓解大鼠心肌线粒体混悬液中线粒体的肿胀及其膜流动性下降。结论 SY可改善大鼠心肌能量代谢，进而缓解心肌缺氧性损伤。     

线粒体KATP通道开放剂对培养大鼠心肌细胞缺血/再灌注损伤心肌线粒体的保护作用

目的探讨线粒体ATP敏感性钾通道开放剂二氮嗪预处理对大鼠心肌细胞线粒体功能保护作用。方法采用培养大鼠心肌细胞缺血/再灌注损伤模型,观察二氮嗪预处理对心肌细胞缺血/再灌注损伤损伤后细胞线粒体活性和线粒体膜电位影响。结果二氮嗪预处理大鼠后,对培养大鼠心肌细胞缺血/再灌注损伤有保护作用,能减少心肌细胞线粒体活性和线粒体膜电位的下降。结论线粒体ATP敏感性钾通道开放剂能产生预处理心肌细胞线粒体保护效应。     

红花提取物对肝纤维化大鼠肝线粒体的作用

目的 探讨红花提取物对肝纤维化大鼠肝细胞线粒体的保护作用。方法 二乙基亚硝胺诱导大鼠肝纤维化模型,实验组口服红花提取物,分离各组肝组织细胞线粒体,观察肝细胞线粒体形态学改变,检测MDA和SOD在肝细胞线粒体中的水平。观察线粒体膜势能和线粒体ATP的水平改变,并观察线粒体的呼吸功能变化,以研究红花提取物对肝纤维化大鼠肝细胞线粒体是否具有保护作用。结果 正常组大鼠肝线粒体排列整齐、形态正常,对照组的大鼠线粒体肿胀且形态不规则,边界不清晰,且大小不一致,而实验组线粒体的肿胀、结构不清晰、大小不一等情况有明显改善;肝纤维化大鼠肝细胞线粒体中MDA的水平明显升高,而SOD的含量明显下降,红花提取物处理则能明显降低线粒体MDA的水平,并提高SOD的含量;与正常组相比,肝纤维化大鼠的线粒体膜势能明显降低,而红花提取物处理能够提高线粒体膜势能;大鼠由于肝纤维化可加重消耗肝细胞线粒体中的ATP,而红花提取物能明显减少大鼠线粒体中的ATP消耗。与之一致的是,实验组大鼠线粒体中的磷氧比明显高于对照组。结论 红花提取物能明显降低大鼠肝纤维化诱导的肝细胞线粒体氧化应激。能维持肝细胞线粒体ATP水平、呼吸控制率及磷氧比来保护线粒体的功能。     

迷迭香酸激活Parkin介导的线粒体自噬并抑制高糖诱导的心肌细胞肥大

目的 评估迷迭香酸对高糖培养下心肌细胞线粒体自噬水平以及细胞肥大的影响。方法 体外培养H9c2大鼠心肌母细胞,分为对照组（葡萄糖5.5 mmol/L）、高糖组（葡萄糖25 mmol/L）、高糖+迷迭香酸组（葡萄糖25 mmol/L+迷迭香酸50 μmol/L）、高糖+迷迭香酸+Parkin-siRNA组（葡萄糖25 mmol/L+迷迭香酸50 μmol/L+Parkin-siRNA转染）;Western blot法测定PINK1、Parkin、LC3II/LC3I蛋白表达水平,透射电子显微镜下观察线粒体自噬体形成情况,流式细胞术检测活性氧物质（ROS）与凋亡水平,分光光度法检测细胞线粒体呼吸链复合酶活性,荧光酶标法检测线粒体膜电位水平,3H-亮氨酸标记法检测细胞蛋白质合成速率,光学显微镜下检测心肌细胞表面积。结果 迷迭香酸可提高高糖培养下心肌细胞内PINK1、Parkin、LC3-II/LC3-I蛋白表达水平（P<0.05）,增多线粒体自噬体数量,并抑制高糖诱导的ROS生成、恢复线粒体呼吸链复合酶活性与线粒体膜电位水平（P<0.05）,抑制高糖诱导的细胞凋亡（P<0.05）,并降低心肌细胞表面积与蛋白质合成速率（P<0.05）。利用Parkin-siRNA抑制心肌细胞线粒体自噬,则阻断了迷迭香酸对高糖培养下心肌细胞氧化应激与心肌细胞肥大的保护作用（P<0.05）。结论 迷迭香酸可通过激活Parkin介导的线粒体自噬,对高糖诱导心肌细胞的氧化应激损伤有保护作用,并改善心肌细胞肥大。     

碱性成纤维细胞因子对肺炎大鼠心肌损伤的影响

目的:研究碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)对大鼠肺炎造成心肌损害的保护作用。方法:用金黄色葡萄球菌制作肺炎大鼠模型。观察bFGF对它们的心肌病理改变及心肌组织中丙二醛(MDA)、三磷酸腺苷(ATP)及钙含量的影响。结果:肺炎组及治疗组心肌出现明显病理损伤,经bFGF治疗这种损伤明显减轻,相互比较均有显著性差异(P均<0.01)。肺炎组及治疗组与对照组的比较心肌组织中的MDA、钙含量明显增多(P均<0.01),而ATP含量明显减少(P<0.01);经bFGF治疗心肌组织中的MDA、钙含量明显减少(P均<0.01),而ATP含量明显增多(P<0.01)。结论:bFGF对肺炎大鼠的心肌损伤有保护作用。