黄芪甲苷对高糖诱导肾小管上皮细胞凋亡及线粒体自噬相关蛋白表达的影响

【目的】探讨黄芪甲苷对高糖诱导肾小管上皮细胞凋亡及线粒体自噬相关蛋白表达的影响。【方法】将大鼠近端肾小管上皮细胞NRK-52E分为3组:正常对照组、高糖刺激组(给予葡萄糖30 mmol/L,作用48 h)及黄芪甲苷干预组(给予葡萄糖30 mmol/L刺激的同时加用黄芪甲苷100μmol/L,48 h)。采用细胞计数试剂盒8(CCK-8)检测细胞增殖能力;采用Westernblot法检测促凋亡蛋白cleaved-caspase-3及同源性磷酸酶张力蛋白诱导的激酶1(PINK1)/帕金蛋白(Parkin)介导的线粒体自噬相关蛋白PINK1、Parkin、LC3-Ⅱ、LC3-Ⅰ的表达。【结果】黄芪甲苷可有效缓解高糖对细胞增殖的抑制作用(P 0.01)。高糖可上调NRK-52E细胞促凋亡蛋白cleaved-caspase-3,线粒体自噬相关蛋白PINK1、Parkin的表达水平及LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值(均P 0.01);而黄芪甲苷干预可显著下调上述促凋亡蛋白及线粒体自噬相关蛋白的表达(P 0.05或P 0.01)。【结论】黄芪甲苷可抑制高糖诱导的肾小管上皮细胞NRK-52E的凋亡,减轻其由PINK1/Parkin介导的线粒体自噬。     

姜黄素对高糖诱导人肾小管上皮细胞线粒体自噬的影响

目的:观察姜黄素(Curcumin, Cur)对高糖环境下人肾小管上皮细胞(Human kidney 2,HK-2)线粒体自噬及氧化应激的影响,探究姜黄素对HK-2细胞的保护作用及机制。方法:体外培养HK-2细胞,随机分为4组：对照组(5.5 mmol/L葡萄糖)、姜黄素组(5.5 mmol/L葡萄糖+10μmol/L姜黄素)、高糖组(30 mmol/L葡萄糖)、姜黄素高糖组(30 mmol/L葡萄糖+10μmol/L姜黄素)。各组干预刺激48 h,收集细胞的总蛋白,采用Western blot检测线粒体自噬相关蛋白Pink1、Parkin、LC3B以及beclin1的表达;JC-1检测各组线粒体膜电位水平;采用活性氧检测试剂盒检测细胞内活性氧(Reactive oxygen species, ROS)生成情况。结果:与对照组比较,姜黄素组各项指标无明显改变(P>0.05);与姜黄素组比较,高糖组Pink1、Parkin、LC3B、beclin1蛋白表达降低(P<0.01),细胞内ROS表达升高(P<0.01),线粒体膜电位活性下降(P<0.01);与高糖组比较...     

棕榈酸通过cGAS-STING-IRF3通路降低心肌细胞的自噬功能

目的 探究棕榈酸（PA）对心肌细胞自噬功能的影响及潜在机制。方法 提取大鼠乳鼠心肌细胞（NRCMs）并体外培养24 h,分别加入 10%BSA 以及不同浓度的 PA（0、0.1、0.3、0.5、0.7 mmol/L）共培养 24 h。Western blotting 检测 NRCMs 中自噬指标（PINK1、Parkin、p62、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ）以及cGAS、STING、p-IRF3/IRF3的蛋白表达水平。CCK8法检测细胞活性,筛选0.7 mmol/LPA用于后续实验。进一步将cGAS siRNA转染入NRCMs中以敲降cGAS的表达,将NRCMs细胞分为：空白对照组（Control组,无特殊处理）、阴性对照组（NC组,转染NC序列）、cGAS siRNA组（转染cGAS-siRNA敲降cGAS）、PA组（0.7 mmol/L PA处理24 h）、cGAS siRNA+PA组（转染cGAS-siRNA后予以0.7 mmol/L PA处理24 h）。Western blot检测NRCMs自噬相关蛋白指标表达变化,CCK8法检测细胞活性,免疫荧光检测p62和LC3阳性着色情况。结果 经不同浓度PA作用24 h后,NRCMs中PINK1、Parkin,LC3Ⅱ/LC3Ⅰ和LC3Ⅱ/LC3Ⅰ+Ⅱ蛋白表达量明显降低（P<0.05）,p62蛋白表达量明显增高（P<0.05）,且心肌细胞活性明显下降（P<0.05）。将cGAS敲降后,可明显逆转PA诱导的NRCMs自噬功能降低,并改善心肌细胞活性（P<0.05）。结论 PA通过介导cGAS-STING-IRF3通路激活,抑制心肌细胞的自噬功能,导致细胞活性降低。     

双磷酸盐对高糖环境下BMSCs自噬相关因子Beclin1和LC3Ⅱ影响的研究

目的 研究双磷酸盐对高糖环境下骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs）自噬相关因子Beclin1和微管相关蛋白1轻链3（microtubule-associated protein 1 light chain 3, LC3)Ⅱ的影响。 方法 BMSCs体外分离与培养,进行成骨、成软骨及成脂三向分化诱导与鉴定,配置含浓度梯度10-6~10-9mmol/L双磷酸盐的高糖（30 mmol/L）培养基,采用CCK-8检测BMSCs的增殖活性后选定用于实验的双磷酸盐浓度为10-9 mmol/L。另取BMSCs分为3组:正常对照组（D-葡萄糖5.6 mmol/L）,高糖组（D-葡萄糖30 mmol/L）,高糖（D-葡萄糖30 mmol/L）+双磷酸盐（10-9 mmol/L）组。用real time -PCR检测3组细胞LC3和Beclin1的基因表达,Western blot检测3组细胞LC3Ⅱ和Beclin1蛋白的表达水平,透射电镜观察自噬体。 结果 鉴定结果示所得BMSCs具有成骨、成软骨及成脂分化能力。高糖组LC3和Beclin1 mRNA、LC3Ⅱ和Beclin1蛋白的表达较正常对照组增高（P<0.01）,而高糖组+双磷酸盐组较高糖组低（P<0.05）;透射电镜显示高糖组细胞中自噬体数量最多,高糖+双磷酸盐组其次,正常对照组最少。 结论 高糖环境下BMSCs自噬水平升高,而双磷酸盐能下调高糖环境下BMSCs自噬相关因子Beclin1和LC3Ⅱ的表达。     

SCFAs调节线粒体自噬改善高糖下胰岛β细胞损伤的研究

目的 探究短链脂肪酸(short-chain fatty acids,SCFAs)通过调节线粒体自噬途径改善高糖环境下胰岛β细胞功能损伤的作用及机制。方法 将大鼠胰岛素瘤INS-1细胞随机分为对照组、模型组、乙酸钠(sodium acetate,NaA)组、丙酸钠(sodium propionate,NaP)组、丁酸钠(sodium butyrate,NaB)组,除对照组外,其余组均采用33mmol/L葡萄糖培养诱导高糖损伤,NaA组、NaP组及NaB组预先分别以100μmol/L的NaA、NaP、NaB进行处理;各组INS-1细胞处理结束后,CCK-8法检测细胞增殖活性,流式细胞术检测细胞凋亡水平,Hoechst 33258染色观察细胞凋亡形态,放射免疫法测定细胞释放胰岛素的含量,DCFH-DA荧光探针测定细胞活性氧(reactive oxygen species,ROS)水平,透射电子显微镜观察线粒体超微结构及自噬情况,Western blot法检测微管相关蛋白Ⅰ轻链3(microtubule-associated protein Ⅰlight 3,LC3-Ⅰ)、LC3-Ⅱ、p62、PINK1及Parkin的表达水平。结果 与模型组比较,NaA组、NaP组及NaB组的细胞增殖率升高,而细胞凋亡率下降,未见明显蓝色凋亡体,胰岛素释放量升高,ROS水平减少,线粒体受损与自噬现象得到改善,细胞中LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值降低,PINK1与Parkin蛋白相对表达量下调,且p62蛋白相对表达量上调,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论 3种SCFAs(NaA、NaP、NaB)均能改善高糖环境下胰岛β细胞的功能损伤,其机制可能与抑制线粒体自噬相关。     

PINK1低表达诱导线粒体自噬障碍致糖尿病缺血心肌易损及机制

【立论依据】 糖尿病患者发生缺血性心脏病(IHD)后心肌损伤程度明显高于非糖尿病患者,但其具体机制尚待阐明。线粒体自噬是细胞通过自噬机制选择性清除线粒体的过程,对于维持线粒体功能和细胞生存至关重要。新近研究表明,线粒体激酶PINK1可通过线粒体融合蛋白Mfn2募集并结合E3泛素连接酶Parkin,介导线粒体自噬。然而,PINK1在糖尿病心肌中的表达变化及其介导的Mfn2-Parkin通路在心肌缺血损伤中的作用尚不清楚。 【设计思路】 本课题拟在整体和细胞水平研究PINK1在糖尿病心肌中是否低表达、并引发线粒体自噬障碍,进而增加糖尿病缺血心肌易损性。 【实验内容】 (1)高脂饲料(45%脂肪含量)喂养C57BL/6小鼠16周,建立2型糖尿病(T2DM)小鼠模型。(2)在对照和T2DM小鼠构建心肌缺血(MI)模型,观察缺血心肌损伤、心肌PINK1-Mfn2-Parkin信号变化、线粒体自噬及线粒体功能。(3)分离乳鼠心肌细胞,高糖/高脂培养,利用腺病毒转染过表达PINK1或RNAi技术剔除PINK1表达,研究PINK1介导的线粒体自噬与心肌细胞缺氧损伤的关系。 【材料】 C57BL/6小鼠,SD乳鼠,线粒体膜电位测试盒,TUNEL凋亡检测试剂盒,蛋白质印迹、RNA干扰、腺病毒转染所需试剂等。 【可行性】 我们成功制备了T2DM小鼠模型;预实验结果提示,与对照组相比,T2DM小鼠心肌PINK1表达减少,且MI后心肌线粒体自噬水平显著降低,心肌缺血损伤加重(P<0.05)。过表达PINK1可有效增加高糖/高脂培养心肌细胞的线粒体自噬,减少缺氧心肌细胞凋亡(P<0.05)。以上结果强烈提示,PINK1的低表达通过影响线粒体自噬加重糖尿病心肌易损性的假设是可行的。本课题涉及的实验方法在前期研究中已熟练运用,为顺利完成奠定了基础;且实验室具备所需实验条件,所有实验试剂均可在国内购得。 【创新性】 PINK1-Mfn2-Parkin介导的线粒体自噬对于糖尿病心肌易损性的作用未见报道。预实验结果证实,PINK1低表达诱导线粒体自噬障碍致糖尿病缺血心肌易损性增加,增加心肌PINK1表达可显著改善糖尿病心肌抗缺血损伤的能力。如能彻底阐明该问题,可为减轻糖尿病IHD患者的心肌损伤提供全新的干预靶点和实验依据。     

葡萄糖浓度对乳鼠心肌细胞自噬的影响

目的观察葡萄糖浓度对乳鼠心肌细胞自噬的影响。方法建立体外培养乳鼠心肌细胞模型,随机分成对照组（5．5mmol／L）,高糖组（25mmol／L）,对照＋雷帕霉素组（100nmol／L）,高糖＋雷帕霉素组（100nmol／L）。分别测定各组心肌细胞面积;用RT-PCR检测心肌肥大标记基因[心房利钠肽（ANP）、β-肌球蛋白重链（13-MHC）]表达情况;运用Western印迹检测自噬标记性蛋白微管相关蛋白3（LC-3）的表达。结果（1）高糖组心肌细胞肥大相关指标较对照组升高,高糖组LC-3的表达较对照组减低,差异均有统计学意义（P〈0．05）。（2）高糖＋雷帕霉素组心肌细胞肥大相关指标较对照＋雷帕霉素组升高,高糖＋雷帕霉素组LC-3较对照＋雷帕霉素组减低,但差异均无统计学意义。（3）高糖＋雷帕霉素组心肌细胞肥大相关指标较高糖组减低,高糖＋雷帕霉素组LC-3表达较高糖组升高,差异均有统计学意义。结论（1）培养基中葡萄糖浓度升高可导致心肌细胞肥大,同时合并有心肌细胞自噬水平的下降。（2）在高糖培养基中加入雷帕霉素可升高心肌细胞的自噬水平,同时抑制高糖导致心肌细胞肥大效果。（3）培养基中葡萄糖浓度升高导致心肌细胞肥大的效果可能与心肌细胞自噬水平的改变相关。（4）结合本实验的研究结果,自噬在糖尿病性心肌病方面可能起一定作用。     

抑制线粒体活性氧自由基可减轻高糖诱导的心肌细胞焦亡和铁死亡

目的 探讨抑制线粒体氧化应激和炎症小体减轻高糖诱导的H9C2心肌细胞焦亡和铁死亡的作用,分析线粒体活性氧自由基（ROS）和炎症小体之间可能的上下游关系。方法 将H9C2心肌细胞按照随机数字表法随机分为5组。正常对照组（CON）：含25 mmol/L浓度葡萄糖的DMEM完全培养基;高糖损伤组（HG）：含35 mmol/L浓度的高糖完全培养基;高糖+线粒体抗氧化剂Mitoquinone（MitoQ）组（HG+MitoQ）：35 mmol/L高糖完全培养基中加入终浓度为0.5 μmol/mL的MitoQ;高糖+ NLRP3抑制剂MCC950组（HG+MCC950）：35 mmol/L高糖完全培养基中加入终浓度为1 μmol/mL的MCC950;高糖组+MCC950+线粒体电子传递抑制剂Rotenone（ROT）组（HG+MCC950+ROT）：35 mmol/L高糖完全培养基中加入终浓度为1 μmol/mL的MCC950和0.5 μmol/mL的ROT。各组心肌细胞干预24 h后,CCK-8法测定细胞活性;CellRox和MitoSox荧光探针分别测定心肌细胞内和线粒体氧化应激水平变化;免疫荧光法检测细胞内NLRP3炎症小体水平;Western blot检测心肌细胞中NLRP3、GSDMD和Cleaved-GSDMD（GSDMD-NT）等焦亡相关重要因子的蛋白表达和铁死亡相关因子GPX4蛋白表达。结果 与CON组相比,HG组细胞活性明显下降（P<0.01）,心肌细胞和线粒体内ROS荧光强度（P<0.01）、NLRP3免疫荧光强度（P<0.01）以及焦亡相关因子NLRP3,GSDMD和GSDMD-NT的蛋白表达（P<0.01）均明显升高,铁死亡相关因子GPX4蛋白表达下降（P<0.01）。与HG组相比,HG+MitoQ和HG+MCC950组细胞活性明显升高（P<0.01）,细胞和线粒体内ROS荧光强度（P<0.01）、NLRP3免疫荧光强度（P<0.01）以及 NLRP3、GSDMD 和 GSDMD-NT 的蛋白表达明显降低（P<0.05）,GPX4 蛋白表达增高（P<0.01）。与HG组相比,HG+MCC950+ROT组细胞活性和NLRP3、GSDMD-NT的蛋白表达无明显差异（P>0.05）;但与HG+MCC950组相比,HG+MCC950+ROT组细胞活性明显降低（P<0.01）,ROS荧光强度、NLRP3炎症小体免疫荧光以及NLRP3、GSDMD-NT的蛋白表达均明显升高,GPX4蛋白表达降低（P<0.05）。结论 MitoQ直接抑制线粒体ROS的产生减轻了高糖诱导的心肌细胞NLRP3炎症小体的生成,减少焦亡和铁死亡的发生;抑制NLRP3炎症小体减少线粒体ROS的产生;线粒体ROS和NLRP3之间可能存在着相互影响。     

低糖培养对H9c2心肌细胞的自噬功能和细胞凋亡的影响

目的 研究低糖培养对H9c2心肌细胞自噬活性的影响及此时自噬功能对细胞凋亡水平的影响。方法 用33.3mmol/L葡萄糖浓度的培养基培养H9c2细胞后用2.5mmol/L葡萄糖浓度培养基处理细胞4h作为低糖组（LG组）,高糖组（HG组）维持33.3mmol/L的葡萄糖浓度,对照组（Con组）维持5.5mmol/L的葡萄糖浓度;LG组加入自噬抑制剂3-MA作为抑制剂组（LG+3-MA组）。采用LDH检测试剂盒检测细胞毒性;MTT法检测H9c2细胞增殖能力; Western blot法检测caspase3、LC3、Beclin-1的表达量。结果 与Con组和HG组相比,LG组LDH活性显著增加,细胞增殖能力显著降低,caspase3、LC3-Ⅱ和Beclin-1表达显著增加;而与LG组比较,抑制剂组LC3-Ⅱ、Beclin-1表达降低,同时caspase3以及细胞毒性降低,细胞活力增加。结论 低糖培养通过激活H9c2心肌细胞的自噬活性引起细胞凋亡。     

灵芝提取物对MPP+诱导的Neuro-2a细胞自噬的影响

目的 观察灵芝提取物（Ganoderma lucidum extract,GLE）对1-甲基-4-苯基-吡啶离子（1-methyl-4-phenylpyridinium,MPP⁺）诱导的Neuro-2a细胞自噬的调节作用。方法 采用蛋白印迹检测自噬标志物LC3的转换（LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ）以及荧光显微镜检测LC3点状聚集物的形成。同时Western blotting法检测AMPK/mTOR/ULK1、PINK1/Parkin、NIX/LC3蛋白的表达水平。结果 激光共聚焦采集图像结果显示,MPP⁺处理组细胞LC3-Ⅱ聚集于自噬体膜上,观察到呈点状聚集状态,而GLE干预组细胞点状聚集状态不明显。以LC3的点状聚集阳性细胞占总细胞的百分比评价自噬水平的高低。MPP⁺组呈绿色点状分布的LC3阳性细胞百分比明显升高,GLE组明显降低。Western blotting法检测结果显示GLE组LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值降低。同时,经GLE处理后,可以改善MPP⁺损伤引起的AMPKα/mTOR/ULK1、PINK1/Parkin通路各蛋白异常表达。结论 GLE能抑制MPP⁺诱导的Neuro-2a细胞的自噬反应,调节细胞自噬相关蛋白AMPK/mTOR/ULK1以及PINK1/Parkin的异常表达,表明GLE可能通过调节细胞自噬而发挥神经保护作用。     

ALKBH5通过抑制上皮-间质转化降低人滋养细胞的迁移和侵袭能力

目的 探讨去甲基酶ALKBH5对滋养细胞HTR-8/SVneo迁移、侵袭功能及对上皮-间质转化（EMT）过程的影响。方法 将ALKBH5高表达、抑制及其阴性对照NC质粒转染人滋养细胞系HTR-8/SVneo细胞,采用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）及Westen boltting（WB）实验检测各组细胞中ALKBH5 mRNA及ALKBH5蛋白的表达水平。并通过Transwell实验检测转染后滋养细胞迁移、侵袭功能变化,同时通过 WB 实验检测各组细胞中上皮-间质转化（EMT）相关蛋白：Vimentin、Fibronectin、E-cadherin、N-cadherin、MMP9及MMP2的表达水平。结果 ALKBH5组与未转染组（Control）和无意义序列组（NC）相比,ALKBH5 mRNA及蛋白高表达效果显著（P<0.05）;shALKBH5组与未转染组（Control）和无意义序列组（NC）相比,ALKBH5 mRNA及蛋白抑制效果显著（P<0.05）。ALKBH5高表达后HTR-8/Svneo细胞迁移、侵袭功能降低（P<0.05）,EMT相关蛋白中上皮标记物E-cadherin蛋白表达上调,间质标记物Fibronectin、N-cadherin、MMP2蛋白表达下调,差异有统计学意义（P<0.05）。ALKBH5表达抑制后HTR-8/Svneo细胞迁移、侵袭功能增强（P<0.05）,EMT相关蛋白中上皮标记物E-cadherin蛋白表达下调,间质标记物Fibronectin、N-cadherin、MMP2蛋白表达上调,差异有统计学意义（P<0.05）。结论 ALKBH5通过抑制EMT过程降低滋养细胞迁移、侵袭能力,从而参与子痫前期的发病机制。     

小乌桂汤治疗小鼠胶原诱导性关节炎的作用机制

目的 以胶原诱导性关节炎（CIA）小鼠为模型,探讨小乌桂汤治疗类风湿关节炎的免疫学机制。方法 构建DBA/1小鼠CIA模型,将关节炎指数（AI）评分相近的30只CIA小鼠随机分为正常对照组、模型组（CIA）、甲氨蝶呤组、小乌桂汤低剂量组（0.975 g/mL）、小乌桂汤中剂量组（1.95 g/mL）、小乌桂汤高剂量组（3.9 g/mL）,5只/组。其中,正常对照组和CIA组给予生理盐水,甲氨蝶呤组给予0.1 mg/mL甲氨蝶呤溶液,3个小乌桂汤处理组按照规定剂量分别给予小乌桂汤药液（0.2 mL/10 g体质量）连续灌胃28 d处理。使用AI评分和HE染色评价小乌桂汤对CIA模型小鼠关节的影响。利用流式细胞术观察小乌桂汤对CIA小鼠脾脏Th1、Th17、MDSC、G-MDSC、M-MDSC细胞亚群的影响。结果 甲氨蝶呤和不同剂量组小乌桂汤治疗后小鼠AI评分降低,炎症程度比其他组明显缓解,踝关节损伤得到有效修复,且随着小乌桂汤剂量增高,其治疗效果呈现出逐渐增强的趋势（P<0.05）。与模型组相比,甲氨蝶呤组和不同剂量组小乌桂汤组脾脏中Th1、Th17和M-MDSC细胞比例降低（P<0.05）,GMDSC细胞比例显著增加,且随着小乌桂汤剂量增高,细胞比例变化呈现逐渐明显的趋势（P<0.01）。相关分析结果显示,Th1、Th17细胞比例与M-MDSC细胞比例呈正相关,而与G-MDSC细胞比例呈负相关（P<0.01）。结论 小乌桂汤可通过调节MDSC细胞亚群水平,升高G-MDSC细胞比例和降低M-MDSC、Th1、Th17细胞比例改善CIA小鼠关节损伤,高剂量小乌桂汤其作用与甲氨蝶呤等效,且安全性更高。     

IL-17A/IL-17RA通过上调自噬降低卵巢癌SKOV3细胞对顺铂敏感性

目的 探讨白细胞介素（IL）17A通过调控细胞自噬对卵巢癌细胞顺铂（DDP）化疗敏感性的影响。方法 体外培养卵巢癌SKOV3细胞并分别用不同浓度DDP（1、2、4、6、8、10、15、20 μg/mL）处理,MTT法测定细胞增殖活性以及IL-17A（100 ng/mL,处理24 h）对DDP 诱导SKOV3细胞凋亡的影响;流式细胞术检测人卵巢癌细胞SKOV3中IL-17A受体（IL-17RA）的表达水平;Annexin V-FITC/PI双染法检测细胞凋亡;线粒体膜电位检测试剂盒（JC-1）检测细胞早期凋亡情况;IL-17RA 中和抗体（IL-17RA mAb）进行IL-17RA阻断实验;合成针对IL-17RA基因的siRNA片段（siRNA-IL-17RA）,转染SKOV3细胞,沉默IL-17RA表达;3-甲基腺嘌呤（3-MA）抑制细胞自噬水平;Western blot检测细胞凋亡相关蛋白（Bcl2、Bax、Cleaved Caspase3）、自噬相关蛋白（P62、Beclin-1）表达。结果 DDP可以增加卵巢癌SKOV3细胞IL-17RA表达水平;IL-17A降低SKOV3细胞对DDP的敏感性（P<0.05）;DDP诱导SKOV3细胞内自噬相关蛋白Beclin-表达增强,自噬降解底物P62蛋白减少;IL-17A/IL-17RA增强了DDP自噬诱导作用（P<0.05）;3-MA 阻断自噬后,SKOV3细胞凋亡率较干扰前明显升高,细胞抗凋亡蛋白Bcl2表达水平降低、凋亡蛋白Bax表达水平升高,差异有统计学意义（P<0.05）。结论 IL-17A/IL-17RA可能通过上调DDP诱导的自噬水平降低人卵巢癌SKOV3细胞化疗敏感性。     

垂体肿瘤转化基因1在系统性硬化症中的表达及作用

目的 研究垂体肿瘤转化基因（PTTG1）在系统性硬化症（SSc）中的表达及其对成纤维细胞的作用。方法 收集皮肤活检组织,其中SSc患者组21例,正常组22例。分别应用实时荧光定量聚合酶链式反应法（Real-time PCR）检测皮肤组织中PTTG1基因表达水平;应用免疫组化方法检测皮肤组织中PTTG1蛋白表达水平;应用小干扰RNA（siRNA）降低成纤维细胞中PTTG1基因表达,通过 Real-time PCR 方法检测细胞中 PTTG1 及与细胞纤维化密切相关的几个基因α-SMA、COL1A1、COL1A2、COL3A1的表达变化;通过细胞实时增殖检测系统检测细胞增殖。结果 与正常对照相比,SSc患者皮肤组织中PTTG1的表达水平明显升高,差异具有统计学意义（P<0.05）;与正常对照相比,SSc患者皮肤组织中阳性细胞增多,PTTG1蛋白表达明显升高;原代皮肤成纤维细胞中PTTG1表达水平和α-SMA、COL1A1、COL1A2、COL3A1均存在正相关,差异具有统计学意义（R²=0.8192,P<0.05;R²=0.6398,P<0.05;R²=0.316,P<0.05;R²=0.3723,P<0.05）;同时,原代皮肤成纤维细胞中PTTG1干扰后,细胞增殖被显著抑制,纤维化相关基因（COL1A1、COL1A2、PAI-1）表达下降,胶原蛋白的基因表达降低。结论 SSc患者中存在PTTG1过度表达,干扰PTTG1可降低成纤维细胞活性,提示PTTG1与SSc纤维化程度密切相关。     

异丙酚对高糖诱导心肌细胞肥大时血红素加氧酶-1表达的影响

目的:观察血红素加氧酶-1在高糖诱导的心肌细胞肥大中的表达,以及异丙酚对其表达的影响。方法:体外培养乳鼠心肌细胞,分组给药后,用BCA法测心肌细胞的蛋白质含量;用计算机图像分析系统检测心肌细胞表面积;用DCFH-DA活性氧检测试剂盒检测细胞内氧自由基的产生;用RT-PCR和Western blot分别检测心肌细胞中HO-1mRNA及蛋白表达。结果:高糖组心肌细胞表面积、细胞蛋白含量及氧自由基产生均升高。50μmol/L浓度的异丙酚对高糖诱导的肥大心肌细胞表面积、细胞蛋白含量及氧自由基的产生均有显著的抑制作用,而给予HO-1抑制剂后其作用明显减弱。结论:HO-1可能参与了异丙酚抑制心肌细胞肥大的作用。     

Palbociclib可诱导人肾小管上皮细胞周期阻滞及衰老

目的 探讨Palbociclib药物对肾小管上皮细胞周期进展及细胞增殖的影响。方法 体外培养肾小管上皮细胞HK-2分别给予不同浓度（0、1、5、10、20 μmol/L）的Palbociclib进行处理，通过细胞计数和CCK8法检测不同浓度及时间下Palbociclib对HK-2细胞增殖及细胞活力的影响。EDU染色检测不同浓度下Palbiciclib对HK-2细胞作用5 d后的细胞增殖情况。流式分析检测Palbociclib对HK-2细胞生长周期分布的影响。采用SA-β-Gal、C12FDG等衰老染色技术检测不同浓度下Palbociclib作用于HK-2细胞5 d后其对衰老表型的诱导情况。RT-PCR检测P16、P21、P53及衰老相关分泌表型的mRNA相对表达水平，Western blot检测P16、P21和P53的蛋白表达情况。结果 Palbociclib抑制HK-2细胞增殖并诱导细胞周期阻滞于G1期。相比于对照组而言，高剂量（10 μmol/L）的 Palbociclib 可明显抑制 HK-2 细胞增殖活性，且在第 5 天时增殖抑制效果最为明显（P<0.01）。Palbociclib诱导HK-2细胞生长周期主要阻滞于G1期，而进入S期的细胞数相比于对照组来说明显减少（P<0.01）。Palbociclib可诱导HK-2细胞发生衰老，通过SA-β-Gal和C12FDG衰老染色检测，结果表明在Palbociclib作用下，HK-2细胞的胞内衰老相关半乳糖苷酶活性明显升高。RT-PCR及Western blot结果显示Palbociclib可明显上调HK-2细胞中P16、P21、P53等衰老相关因子的基因和蛋白表达水平（P<0.01）。与对照组相比，RT-PCR检测Palbociclib作用下的HK-2细胞中衰老相关分泌因子的基因表达水平也升高（P<0.01）。结论 Palbociclib可通过抑制HK-2细胞生长并阻滞其细胞周期进程进而诱导HK-2细胞发生衰老。     

我的梦想是做“百年老店”——记首都医科大学三博脑科医院神经外科于春江教授

目的 探讨干预miRNA-181a(miR-181a)促进多发性骨髓瘤凋亡的机制。方法 首先检测健康志愿者外周血、骨髓瘤患者骨髓、骨髓瘤细胞株MM1S中miR-181a的表达水平。再将miR-181a抑制剂(miR-181a inhibitor)及对照siRNA分别转染进MM1S细胞,回复实验进一步验证miR-181a功能。流式细胞术检测凋亡率和线粒体膜电位,透射电镜观察线粒体超微结构及自噬泡,Western blotting检测Cleaved-caspase-3、Bcl-2/Bax、LC3 Ⅱ/LC3-Ⅰ、P62、Parkin。结果 骨髓瘤及MM1S细胞株中miR-181a的相对表达水平显著升高(P<0.05),分别为1.57±0.09及1.64±0. 06。miRNA-181a 抑制剂作用下,MM1S细胞的凋亡率及Cleaved-caspase-3显著高于健康对照组及阴性转染对照组,电镜下自噬泡数目增加而且线粒体结构毁坏严重,线粒体膜电位水平低下伴有Bcl-2/Bax、LC3 Ⅱ/LC3-Ⅰ水平的显著升高,而P62水平的显著降低。过表达Parkin的回复实验显示,miRNA-181a 抑制剂对骨髓瘤细胞的作用明显降低。结论 抑制miRNA-181a可以升高Parkin表达水平,进而促进该基因通路介导的线粒体自噬,抑制骨髓瘤细胞的增殖。     

EBV 阳性人鼻咽癌细胞外泌体促进淋巴管新生与鼻咽癌淋巴结转移

目的 探讨EB病毒（EBV）阳性鼻咽癌细胞外泌体对淋巴管新生与鼻咽癌淋巴结转移的影响。方法 利用超速离心获得细胞外泌体,对外泌体进行Western blot与纳米颗粒追踪分析（NTA）鉴定。利用Dio染料吞噬实验,验证外泌体可以被淋巴管内皮细胞摄取。离体条件下,分别利用等体积培养基以及20 μg/mL 鼻咽上皮细胞（NP69）、HK1-EBV、C666-1细胞外泌体和除去外泌体的HK1-EBV与C666-1上清蛋白预处理淋巴管内皮细胞,检测淋巴管内皮细胞成管与迁移情况;在体实验,首先建立裸鼠腘窝淋巴结转移模型,负瘤裸鼠被随机分成4组,3只/组。对照组：腘窝处注射生理盐水（30 μL）;NP69外泌体组：10 μg/30 μL NP69外泌体;HK1-EBV除去外泌体上清组：10 μg/30 μL HK1-EBV除去外泌体上清蛋白;HK1-EBV外泌体组：10 μg/30 μL HK1-EBV外泌体。每2 d注射1次,共4次。结果 超速离心获得外泌体富含外泌体特异性蛋白,同时NTA鉴定表明其粒径范围正常;鼻咽癌细胞与NP69外泌体可以被淋巴管内皮细胞摄取;HK1-EBV与C666-1外泌体较空白对照组与NP69外泌体可显著促进淋巴管内皮细胞成管与迁移（P<0.05）,HK1-EBV与C666-1外泌体组与对应除去外泌体上清蛋白组间无显著性差异（P>0.05）;腘窝淋巴结转移实验发现：HK1-EBV外泌体较空白对照组、NP69外泌体以及除去外泌体的HK1-EBV上清蛋白可显著促进鼻咽癌细胞淋巴结转移以及局部淋巴管新生（P<0.05）。结论 EBV阳性鼻咽癌细胞外泌体能促进鼻咽癌淋巴管新生与淋巴结转移。     

沉默FASN基因对肝母细胞瘤HepG2细胞的脂质代谢及增殖、迁移和凋亡的影响

目的 研究FASN基因沉默对肝母细胞瘤HepG2细胞脂质代谢及生物学行为的影响。方法 以脂质体包裹siRNA的方法沉默FASN基因,实验分为Control组、NC-siRNA组和FASN-siRNA组,FASN-siRNA组转染75 nmol/L的FASN-siRNA片段,NC-siRNA组转染等剂量的NC-siRNA片段,Control组只加入等体积的转染试剂。通过实时荧光定量PCR和Western blot法检测FASN基因和蛋白水平的相对表达;通过酶联免疫吸附法检测HepG2细胞甘油三酯水平;通过油红O染色法检测细胞内脂滴数目;利用CCK-8实验检测HepG2细胞增殖活性的改变;通过annexinV-FITC/PI双染色法检测HepG2细胞凋亡情况;采用划痕愈合实验及transwell实验检测HepG2细胞迁移能力的改变。结果 FASN-siRNA组的FASN基因表达、蛋白表达低于NC-siRNA组（P<0.001）。油红O染色显示,FASN-siRNA组细胞内脂滴较NC-siRNA组减少（P<0.001）、甘油三酯水平降低（P< 0.01）;CCK-8实验、annexinV-FITC/PI双染实验及划痕愈合实验结果显示,转染48、72、96 h后,FASN-siRNA组HepG2细胞增殖被显著抑制,FASN-siRNA组细胞总凋亡率与NC-siRNA组相比增加、FASN-siRNA组发生迁移的HepG2细胞数量低于NC-siRNA组（P<0.001）。结论 沉默FASN基因可抑制肝母细胞瘤HepG2细胞的增殖及迁移,并诱导HepG2细胞凋亡,该作用可能与FASN基因抑制后HepG2细胞内脂质合成降低有关。