克隆测序确认HLA新等位基因B^＊3712

目的：由于技术原理的限制，目前尚不能对所有的HLA等位基因进行严格的区分，特别是以往没有发现的新基因序列只能通过测序的方法解决，然而，当遇到等位基因杂合时，测序给出的结果仍然无法确认新的序列改变发生在等位基因的哪一侧，这时需要用分子生物学方法分离杂合子然后进行测序才能确定新的基因序列。采用基因克隆方法确认HLA新等位基因。 方法：实验于2006-01／05在河南省红十字血液中心HLA实验室，美国海军骨髓库HLA实验室完成。造血干细胞血样由中华骨髓库提供。采用荧光微珠HLA分型方法对中华骨髓库捐献者血样进行HLA分型检测，无法给出确切结果的摸棱两可结果标本用基因克隆（TOPO TA Cloning）、DNA测序的方法确认新的HLA基因序列。 结果：通过克隆分离杂合等位基因，再进行测序确认发现新的序列与B^＊3709相比，出现4个核苷酸改变：1．355nt C〉A，2．363nt C〉G，3．412nt G〉A，4．477ntC〉G，而且均发生在H哺B基因外显子3（exon3）。4处改变引起氨基酸编码改变：①编码95CTC〉ATC，氨基酸改变L〉1（亮氨酸〉异亮氨酸）。②97AGC〉AGG．S〉R（丝氨酸〉精氨酸）。③114GAC〉AACD〉N（天门冬氨酸〉天冬酰胺）。（9135GCC〉GCGA=A无氨基酸改变。 结论：①新的基因序列已经在GenBnak注册，被WHO的HLA因子命名委员会得到正式命名为HLA-B^＊3712基因。②基因克隆是确认HLA新基因的根本方法。     

克隆测序确认HLA新等位基因B*3712

目的：由于技术原理的限制，目前尚不能对所有的HLA等位基因进行严格的区分，特别是以往没有发现的新基因序列只能通过测序的方法解决，然而，当遇到等位基因杂合时，测序给出的结果仍然无法确认新的序列改变发生在等位基因的哪一侧，这时需要用分子生物学方法分离杂合子然后进行测序才能确定新的基因序列。采用基因克隆方法确认HLA新等位基因。 方法：实验于2006-01／05在河南省红十字血液中心HLA实验室，美国海军骨髓库HLA实验室完成。造血干细胞血样由中华骨髓库提供。采用荧光微珠HLA分型方法对中华骨髓库捐献者血样进行HLA分型检测，无法给出确切结果的摸棱两可结果标本用基因克隆（TOPO TA Cloning）、DNA测序的方法确认新的HLA基因序列。 结果：通过克隆分离杂合等位基因，再进行测序确认发现新的序列与B^＊3709相比，出现4个核苷酸改变：1．355nt C〉A，2．363nt C〉G，3．412nt G〉A，4．477ntC〉G，而且均发生在H哺B基因外显子3（exon3）。4处改变引起氨基酸编码改变：①编码95CTC〉ATC，氨基酸改变L〉1（亮氨酸〉异亮氨酸）。②97AGC〉AGG．S〉R（丝氨酸〉精氨酸）。③114GAC〉AACD〉N（天门冬氨酸〉天冬酰胺）。（9135GCC〉GCGA=A无氨基酸改变。 结论：①新的基因序列已经在GenBnak注册，被WHO的HLA因子命名委员会得到正式命名为HLA-B^＊3712基因。②基因克隆是确认HLA新基因的根本方法。     

弱RhCe型家系调查

目的　了解弱RhCe抗原遗传背景。方法　采用红细胞凝集试验检测先证者父母和兄弟姐妹的RhD、C、c、E、e抗原 ,用PCR SSP方法检测RH基因。观察Rh血型基因的构成和抗原表达情况。结果　父亲带有弱RhCe抗原和正常的RhcE抗原 ,基因型为RHCe/RHcE ;母亲有正常RhCe抗原 ,基因型为RHCe/RHCe ;先证者有与父亲相同的弱RhCe抗原 ,基因型为RHCe/RHCe ;哥哥和弟弟都仅有RhcE抗原 ,基因型为RHcE/RHCe ;姐姐有正常的RhcE和RhCe抗原 ,基因型为RHcE/RHCe。结论　我国人群中RHCE基因存在有无效的RHCe基因和弱RHCe等位基因。     

缩短全自动酶免分析仪总处理时间方法探讨

目的　探讨缩短BEPⅢ全自动酶免分析仪总的处理时间方法。方法　编试验程序时 ,调整BEPⅢ洗板浸泡时间和进板顺序。结果　洗板浸泡时间设定为 7s;先进抗 HCV ,后进HBsAg ,然后两者交替进板 ,8块板 (35 2个样本 )总的完成时间由原来的 2 4 0min减少到 185min ,总的处理时间缩短了 5 5min。结论　本方法缩短了BEPⅢ处理时间 ,提高了工作效率。     

血站系统酶联免疫检测试剂的选择

血站检验科所进行的酶免实验有其特殊性 :标本量大、检测集中、项目固定。卫生部规定的酶免检测项目有ＨＢｓＡｇ、抗 ＨＣＶ、抗 ＨＩＶ、抗 ＴＰ(梅毒酶免检测 )等 ,要用不同厂家的试剂进行初、复检实验。采用全自动酶免分析检测系统后对试剂又有了新的要求 ,笔者所在的实验室采用试剂招标的方法进行试剂选择 ,做法如下。1　成立试剂选择 (招标 )组织在有关人员的主持下组成由相关部门参加的试剂招标办公室 ,负责收集曾用过的试剂厂家的有关资料、向其他厂家发出邀请、并负责收集整理厂家寄回的资料。负责对厂家的合格身份进行审核 ,拟订…     

郑州市无偿献血者HIV流行病学调查

近年来,河南省的艾滋病防治形势仍较严峻[1],为了向临床提供安全的血液,降低输血风险,我们对郑州市无偿献血者HIV感染情况作了分析,现报告如下.     

献血者HCV核酸实时荧光定量PCR（FQ—PCR0检测方法的建立

目的 建立献血者HCV核酸荧光定量检测方法。方法 按卫生部规定对机采献血者进行初复检合格后，再用荧光定量PCR进行核酸检测，对结果进行分析。结果 经过酶免试验剂检测合格的准备献血者245人再用荧光定量PCR检测核酸，发现一例阳性，结论 PCR核酸检测检测有较高的灵敏度，而且实时荧光定量PCR检测有诸多优越性。     

荧光定量PCR法筛查混合血浆中的HBV及HCV的可行性

输血所致病毒感染一直受到国内外输血界的关注。因病毒感染初期“窗口期”(从病毒感染到血清标志物检出的时间)的存在，采用现开展的ELISA检测可造成不合格血液的漏检。目前使用各种试剂的“窗口期”如下：HIV1／2抗体22d，HCV抗体70d，HBsAg约56d，其中HCV抗体的“窗口期”已大于70d。通过ELISA法对抗-HCV抗体进行筛查，仍有输血后HCV的感染，这是目前多数输血相关传染病多为丙型肝炎的主要原因。     

河南省部分RhD(一)献血者RhD基因多态性分析

目的：探讨RhD(-)本省无关供血者中RhD的构成情况。方法：采用PCR－SSP法对80名常规血清学RhD(-)本省供血者RhD基因外显子2、3、4、5、6、7、9、10和内含子4及RhCE内含子4的特异性片段进行扩增。结果：80名RhD(-)供血者中RhD基因完全缺失53例，占66.2%；RhD基因部分缺失7例，占8.7%，其中大部分为3－9外显子缺失；RhD基因完整存在20例，占25％。结论：本省常规血清学RhD(-)无关供血者RhD基因存在高度多态性，提示本省人群RhD（－）特征有多种遗传机制，目前在白种人群中使用的DNA鉴定Rh血型的方法不适合我国人群，临床上应采用适合我国人群的检测方法。     

大批量微板自动化检测正反定ABO及RhD血型的研究

目的:探讨用微孔板代替纸板实现仪器自动化检测正反定ABO以及RhD血型。方法:利用加样器取自试管内的红细胞或血浆,然后分配到微板内,经离心、振荡,最后在微板观察仪上进行判断,在局域网上发送报告。结果:正定ABO及RhD仪器优化参数为:在预稀释板上加生理盐水147μl,吸标本压积红细胞3μl,使红细胞浓度达到2%;吸红细胞的液体参数前吐后弃体积均为0μl,并且吸前不混合;在预稀释板上分配,加样针离微板的距离为5 mm;2%红细胞与抗-A或抗-B体积选择均为25μl;预稀释板上剩余的50μl混合红细胞作为RhD检测用,抗-D体积为25μl。反定ABO优化参数为:红细胞浓度选择3%,体积为25μl,血浆50μl。离心转速为1000 r/m in,时间1 m in;振荡15 s,静止2 m in,观察结果。本方法B3、A3弱亚型均能检出,和纸板法符合率为100%,500份样本正反定ABO以及RhD血型,从准备到发结果仅需2 h。结论:本研究实现了正反定ABO及RhD血型的自动化操作,不但省时省工,而且结果准确可靠,减少了微板和抗-D、抗-A和抗-B的用量,具有显著的经济效益和社会效益。