PEP-1-CAT融合蛋白预处理对在体大鼠心肌缺血再灌注损伤的保护作用

目的观察细胞穿透肽PEP-1介导CAT转导入在体大鼠心肌组织的能力,探究PEP-1-CAT融合蛋白对在体大鼠心肌缺血再灌注损伤的保护作用。方法以生理盐水为对照,分别从SD大鼠尾静脉注射500μgPEP-1-CAT和CAT融合蛋白,在0.5,1,2,4,8,24h时将其处死,取其心脏,免疫荧光检测CAT的转导能力,用试剂盒检测心肌CAT的酶活性。40只SPF级雄性SD大鼠,随机分为5组,假手术组,心肌缺血再灌注组,100μgPEP-1-CAT融合蛋白预处理组,300μgEP-1-CAT融合蛋白预处理组,500μgPEP-1-CAT融合蛋白预处理组。结扎冠状动脉前降支1h,再灌注2h末,检测血中的LDH和CK活性以及心肌组织内的MDA含量。结果生理盐水组以及CAT组,荧光显微镜下均未见到绿色荧光;PEP-1-CAT各组均可观察到绿色荧光,且8h时强度最大;酶活性检测显示,CAT组与生理盐水对照组差别没有统计学意义（P〉0.05）,而PEP-1-CAT组随着时间的延长,心肌组织中CAT的活性逐渐增加,在8h时达到峰值,为对照组的4.20倍。PEP-1-CAT各剂量组均能显著减少血清中LDH和CK活性和心肌组织的MDA含量（P〈0.01）。结论PEP-1能够介导CAT以时间依赖的方式转导入在体大鼠心肌组织,转导入大鼠心肌组织内的CAT具有相应的酶活性;PEP-1-CAT融合蛋白预处理对在体大鼠心肌缺血再灌注损伤具有保护作用,为临床应用PEP-1-CAT融合蛋白防治心肌缺血再灌注损伤奠定了实验基础。     

PEP-1介导过氧化氢酶对大鼠离体心肌缺血再灌注损伤的保护作用

目的:研究细胞穿透肽PEP-1携带过氧化氢酶(CAT)穿透大鼠离体心肌的能力,并探讨PEP-1-CAT融合蛋白预处理对大鼠离体心肌缺血-再灌注损伤的保护作用及其机制。方法:建立大鼠离体心脏Langendorff灌流模型,随机分为5组(n=10):缺血-再灌注组(I/R组)行平衡30 min、停灌30 min与再灌注60 min,CAT组、PEP-1-CAT融合蛋白预处理组(A、B、C、D组)在平衡15 min后依次以10,5,10,20μmol/L的融合蛋白预处理15 min,停灌、复灌与I/R组相同。记录各组左室舒张末压(LVEDP)、左室收缩压(LVSP)、左室内压最大变化速率(±dp/dtmax)及冠脉流量(CF)变化,测定平衡15 min时、再灌注15 min时冠脉流出液乳酸脱氢(LDH)活性。测定再灌注60 min时心肌丙二醛(MDA)含量。结果:PEP-1-CAT融合蛋白能高效转导入离体心肌组织并呈现剂量依赖性。在平衡15 min末,各组LVEDP、LVSP、±dp/dt max以及LDH活性比较差异无统计学差异(P>0.05)。与I/R组比较,B、C、D组在再灌注后各时间点LVEDP降低(P<0.01),LVSP、±dp/dt max以及CF升高(P<0.01),灌注15 min时冠脉流出液LDH活性降低(P<0.01),再灌注后60 min心肌MDA含量降低(P<0.01)。CAT处理组所有结果和对照组相比无统计学意义(P>0.05)。结论:PEP-1-CAT融合蛋白能高效转导入离体心肌织并对大鼠离体心肌缺血-再灌注损伤具有明显的保护作用,将为其治疗心肌缺血再灌注损伤奠定坚实的实验基础。     

PEP-1-SOD1对离体缺血再灌注损伤大鼠心肌Bax、Bcl-2蛋白表达的影响

目的:研究细胞穿透肽PEP-1介导人铜锌-超氧化物歧化酶(Cu,Zn-SOD,SOD1)对大鼠离体心肌缺血再灌注损伤(MIRI)细胞凋亡的影响。方法:采用Langendorff灌流系统对离体大鼠心脏进行停灌-复灌建立心肌缺血再灌注损伤模型。大鼠随机分为对照组、SOD1蛋白预处理组,25、50、100μmol/L PEP-1-SOD1蛋白预处理组。复灌结束后,TUNEL法检测心肌细胞凋亡,免疫荧光法检测心肌组织Bax、Bcl-2蛋白表达。结果:与对照组及SOD1组相比,各PEP-1-SOD1组心肌细胞凋亡指数(AI)显著下降,Bcl-2蛋白表达升高,Bax蛋白表达显著减少(P<0.01)。结论:PEP-1-SOD1融合蛋白可抑制离体心脏缺血再灌注损伤大鼠心肌细胞凋亡,其机制可能与上调Bax表达及下调Bcl-2表达有关。     

盐酸右美托咪定预处理对缺血-再灌注损伤大鼠心肌Bax和Bcl-2表达的影响

目的研究盐酸右美托咪定对大鼠心肌缺血-再灌注损伤时心肌凋亡相关基因Bax和Bcl-2表达的影响。方法将21只健康SD大鼠随机分为3组:假手术组(sham组,n=7)、缺血-再灌注组(I/R组,n=7)、缺血-再灌注+盐酸右美托咪定组(DEX组,n=7)。采用结扎左冠状动脉前降支的方法制备在体大鼠心肌缺血-再灌注损伤模型。采用RT-PCR、免疫组化方法检测Bcl-2和Bax mRNA、蛋白的表达,TUNEL法检测凋亡细胞TTC染色测定心肌梗死面积。结果与sham组比较,I/R组Bcl-2和Bax mRNA和蛋白表达增加(P<0.05);与I/R组比较,DEX组Bcl-2mRNA和蛋白表达升高(P<0.05),Bax mRNA和蛋白表达下降(P<0.05),凋亡细胞明显减少(P<0.01),心肌梗死面积减小(P<0.05)。结论盐酸右美托咪定预处理可上调心肌缺血-再灌注损伤大鼠心肌Bcl-2mRNA和蛋白表达,下调Bax mRNA和蛋白表达,表明盐酸右美托咪定在心肌缺血-再灌注损伤中有抗凋亡的作用。     

阿托伐他汀对兔心肌缺血再灌注诱导细胞凋亡的影响

目的探讨阿托伐他汀对兔心肌缺血再灌注诱导的细胞凋亡及Bcl-2、Bax蛋白表达的影响。方法30只雄性大白兔,随机分为假手术组(sham组)、缺血再灌注组(I/R组)及缺血再灌注加阿托伐他汀组(I/R AT组)。采用结扎、开放兔冠状动脉的方法,制作兔心肌缺血再灌注模型(缺血40min,再灌注2h),采用原位末端标记法(TUNEL法)检测心肌细胞凋亡情况,采用免疫组织化学法检测心肌中Bcl-2、Bax蛋白的表达情况。结果①I/R组凋亡指数明显大于sham组(P<0.01),而I/R AT组凋亡指数较I/R组显著减少(P<0.01)。②I/R组及I/R AT组Bcl-2蛋白表达百分率显著高于sham组(均P<0.01),且I/R AT组的Bcl-2蛋白表达也较I/R组明显上调(P<0.01);I/R组及I/R AT组的Bax蛋白表达明显强于sham组(均P<0.01),但I/R AT组的Bax蛋白表达弱于I/R组(P<0.01)。结论阿托伐他汀可以抑制心肌缺血再灌注诱导的细胞凋亡,减少心肌细胞凋亡数目,其机制可能与其上调心肌缺血再灌注时Bcl-2蛋白的表达、抑制Bax蛋白的表达有关。     

丙泊酚对大鼠心肌缺血再灌注损伤时凋亡蛋白Bax、Bcl-2的影响

目的 观察丙泊酚对大鼠心肌缺血再灌注损伤时凋亡蛋白Bax、Bcl-2表达的影响.方法 雄性Wistar大鼠24只,随机分为3组:(n=8),即心肌缺血再灌注组(CI组)、心肌缺血再灌注+丙泊酚组(CP组)、假手术组(CC组).CI组和CP组采用结扎左冠状动脉前降支30 min再灌注2h的方法制备心肌缺血再灌注损伤模型.CP组在缺血前10 min开始静脉泵注丙泊酚6 mg·kg-1 ·h-1至再灌注2h结束;CC组仅穿线不结扎.再灌注结束后,采用全自动生化分析仪测定大鼠血清乳酸脱氢酶(LDH)、肌酸激酶(CK)水平,免疫组化法测定心肌Bax和Bcl-2表达水平.结果 CI组与CC组相比,LDH、CK水平升高,Bcl-2、Bax表达上调,Bcl-2/Bax比例下降(P＜0.05);与CI组比较,CP组LDH、CK水平降低,Bax表达下调,Bcl-2表达上调,Bcl-2/Bax比例升高(P＜0.05).结论 大鼠心肌缺血再灌注损伤时丙泊酚可上调抗凋亡蛋白Bcl-2表达、下调凋亡前蛋白Bax的表达.     

黄芩茎叶总黄酮预处理对大鼠缺血再灌注心肌细胞凋亡的影响

目的:探讨黄芩茎叶总黄酮预处理对大鼠缺血再灌注心肌细胞凋亡的影响。方法:40只SD大鼠随机分为假手术组,缺血再灌注组,SSTF预处理组(SSTF组)。SSTF组于术前1周灌服不同剂量SSTF(17.5、35、70mg/kg.d)。采用结扎大鼠左冠状动脉前降支方法制备心肌缺血再灌注模型。缺血30min,再灌注2h,用HE染色在光学显微镜下观察凋亡心肌组织的病理改变;并用免疫组织化学法检测心肌组织中Bax和Bcl-2蛋白表达情况。结果:缺血再灌注组Bcl-2蛋白表达明显比假手术组低(P<0.05),而SSTF预处理组Bcl-2蛋白表达明显比缺血再灌注组高(P<0.05),缺血再灌注组Bax蛋白表达较假手术组高,而SSTF预处理组Bax蛋白表达明显较缺血再灌注组低(P<0.05);缺血再灌注组大鼠心肌细胞结构出现明显的病理改变。结论:SSTF对结扎大鼠左冠状动脉前降支引起的心肌缺血再灌注损伤有保护作用,它可能通过上调Bcl-2蛋白表达和下调Bax蛋白表达进而抑制心肌细胞凋亡。     

G-CSF后处理对大鼠缺血再灌注心肌细胞凋亡的影响

目的探讨粒细胞集落刺激因子(G-CSF)后处理对大鼠急性心肌缺血再灌注损伤(MIRI)细胞凋亡的影响及其可能机制。方法 SD大鼠48只随机分为假手术组(Sham组)、缺血再灌注组(I/R组)和G-CSF后处理组(G-CSF组),每组16只。在体缺血30min再灌注180min后,检测血清肌酸激酶(CK)、乳酸脱氢酶(LDH)的活性,采用三苯基氯化四氮唑(TTC)染色法测定各组心肌梗死面积,TUNEL法检测心肌细胞的凋亡情况并计算凋亡指数(Apoptosis Index,AI),免疫组化法检测Bcl-2、Bax蛋白的表达。结果 G-CSF组心肌梗死面积[(28.01±1.43)%]较I/R组[(41.82±1.22)%]显著缩小(P<0.01),CK、LDH的活性及心肌细胞的AI和Bax的表达明显降低(P<0.01),而Bcl-2的表达则明显上调(P<0.01)。结论在再灌注前应用G-CSF进行药物后处理明显减轻心肌缺血再灌注损伤,其机制可能与其调控Bcl-2/Bax的表达抑制心肌细胞凋亡有关。     

细胞穿透肽PEP-1介导血红素加氧酶-1对大鼠缺血心肌的转导及影响

目的:探讨细胞穿透肽PEP-1介导血红素加氧酶-1(HO-1)对大鼠心肌缺血再灌注损伤的影响。方法:制备融合蛋白PEP-1/HO-1,通过酶联免疫吸附法检测给予融合蛋白后各时间点血清HO-1水平,探讨动物实验给予融合蛋白的最佳时间点。健康雄性SD大鼠18只,体重220-280g,随机分为3组:正常对照组(C组,n=6)、缺血再灌注组(IR组,n=6)和PEP-1/HO-1处理+缺血再灌注组(HO组,n=6)。制备心肌缺血再灌注损伤模型,于再灌注结束后,测定血清肌酸激酶(CK)和乳酸脱氢酶(LDH)的活性及心肌梗死面积。结果:给予融合蛋白后,血清HO-1蛋白浓度在1h和3h达峰值。与C组比较,IR组血清CK和LDH活性升高,心肌梗死面积增加(P<0.05);与IR组比较,HO组血清CK和LDH活性降低,心肌梗死面积减少(P<0.05)。结论:细胞穿透肽PEP-1介导的HO-1对大鼠心肌缺血再灌注损伤具有保护作用。     

缬沙坦后处理对离体大鼠心肌缺血再灌注细胞凋亡及Bcl-2、Bax表达的影响

目的观察缬纱坦后处理对离体大鼠心肌缺血再灌注(ischemia-reperfusion, I/R)细胞凋亡及凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax表达的影响.方法利用Langendorff 离体心脏灌流装置,采用完全复灌/停灌的方法制备I/R模型.24只SD大鼠随机等分为:①对照(sham)组:K-H液持续灌流110min;②I/R组:停灌30 min,复灌60 min;③缬纱坦后处理(Po vst)组:I/R+缬沙坦1μmol/L(再灌注头15min给药).Hoechst 荧光染色观察凋亡情况,计算凋亡指数(AI);Western blot 检测Bcl-2、Bax的表达.结果 sham组凋亡细胞零星分布(AI=3.48±0.38),另两组均有大量凋亡细胞存在,且Povst组AI(25.87±1.04)明显低于I/R组(36.99±2.26)(P<0.05);Bcl-2、Bax的表达在I/R、Povst组均明显高于sham组(P<0.01),Povst组Bcl-2的表达明显高于I/R组(P<0.01),而Bax的表达与I/R组无显著差异(P>0.05).结论缬纱坦后处理抑制离体大鼠心肌再灌注细胞的凋亡,与上调Bcl-2表达、增加Bcl-2/Bax 比值有关.     

细胞穿透肽PEP-1介导人过氧化氢酶转导入在体大鼠心肌组织

目的：观察PEP-1介导CAT转导人心肌组织的能力,检测转导的CAT是否具有天然活性．方法：用基因工程手段表达并纯化出PEP-1-CAT和CAT融合蛋白．以生理盐水为对照,分别从SD大鼠尾静脉注射500μg PEP-1-CAT和CAT融合蛋白,在0．5,1,2,4,8,24h时将其处死,取其心脏,免疫荧光及Western Blot检测CAT的转导能力,用试剂盒检测心肌CAT的酶活性．结果：SDS—PAGE和Western Blot证实目的蛋白PEP-1-CAT和CAT得到了高表达,且纯度在90％左右．生理盐水组及CAT组,荧光显微镜下均未见到绿色荧光,Western Blot亦未检测到目的蛋白;PEP-1-CAT各组均可观察到绿色荧光,且8h时强度最大,同时Western Blot也检测到了目的蛋白,8h时量最多;酶活性检测显示,CAT组与生理盐水对照组差别无统计学意义,而PEP-1-CAT组随着时间的延长,心肌组织中CAT的活性逐渐增加,在8h时达到峰值,为对照组的4．20倍．结论：PEP-1能够介导CAT以天然活性方式转导入大鼠心肌组织,且其转导呈时间依赖性．     

PEP-1介导的血红素氧合酶HO-1对缺血再灌注损伤大鼠肝脏TNF-α mRNA表达的影响

目的:探讨PEP-1介导的血红素氧合酶-1(HO-1)对缺血再灌注损伤(IR I)大鼠肝脏肿瘤坏死因子(TNF-α)mRNA的影响。方法:SD大鼠经尾静脉注射HO-1(HO-1组)或PEP-1-HO-1(PEP-1-HO-1组)300μg后,制备大鼠肝脏缺血再灌注损伤模型,1、6、12、24 h后用RT-PCR法检测肝组织中TNF-αmRNA水平,另设对照。结果:PEP-1-HO-1组肝脏TNF-αmRNA水平均较单纯IR I组和HO-1组低(P<0.05),且随IR I时间延长而逐渐降低(P<0.05)。结论:PEP-1介导的HO-1融合蛋白降低肝脏TNF-αmRNA表达,可能减轻肝缺血再灌注损伤程度。     

细胞穿透肽PEP-1介导过氧化氢酶转导大鼠心肌H9C2细胞

目的:探索细胞穿透肽PEP-1介导的人过氧化氢酶转导入H9C2细胞的能力。方法:利用基因工程方法表达和纯化His-tag-PEP-1-CAT及His-tag-CAT融合蛋白后,与体外培养的H9C2细胞株共孵育,利用免疫细胞荧光技术和Westernblot检测PEP-1-CAT融合蛋白是否转导入H9C2细胞内;并检测H9C2细胞内的过氧化氢酶活性。结果:制备的PEP-1-CAT融合蛋白纯度为90%以上,其浓度达0.501mg/mL;PEP-1介导的CAT融合蛋白能高效转导入H9C2细胞内,呈时间及剂量依赖性,6h时达峰值;转导入H9C2细胞内的融合蛋白的过氧化氢酶活性亦呈现出时间及剂量依赖的特点。结论:PEP-1-CAT能高效稳定转导入H9C2细胞内,为PEP-1介导的过氧化氢酶防治心肌缺血/再灌注损伤研究奠定基础。     

PEP-1-SOD1融合蛋白抑制血管紧张素Ⅱ诱导的大鼠心脏成纤维细胞Ⅰ型胶原的合成

目的研究穿透肽(PEP-1)介导的铜-锌超氧化物歧化酶1(SOD1)(PEP-1-SOD1)融合蛋白对血管紧张素Ⅱ(ANGⅡ)诱导的大鼠心脏成纤维细胞(CFbs)Ⅰ型胶原合成的影响,并探讨其机制。方法利用基因工程技术表达和纯化PEP-1-SOD1融合蛋白。提取原代大鼠CFbs并传代培养,采用2～5代细胞进行实验,实验分为对照组、ANGⅡ诱导组、SOD1预处理组和PEP-1-SOD1预处理组。SOD1预处理组和PEP-1-SOD1预处理组细胞分别以2μmol.L-1的SOD1和PEP-1-SOD1预处理2 h后,再给1μmol.L-1的ANGⅡ诱导24 h,用免疫荧光法检测细胞内超氧阴离子(O2-)水平,微量丙二醛(MDA)检测试剂盒检测各组细胞MDA含量。结果 Western blot和细胞免疫荧光结果显示PEP-1-SOD1成功穿透入CFbs;Western blot结果显示,与ANGⅡ诱导组比较,PEP-1-SOD1预处理组Ⅰ型胶原和α平滑肌肌动蛋白表达显著降低(P<0.01),细胞内O2-和MDA水平也显著降低(P<0.01)。结论 PEP-1-SOD1融合蛋白穿透入大鼠心脏CFbs内,通过降低细胞内O2-水平,抑制CFbs的激活,减少Ⅰ型胶原的合成。     

PEP-1肽介导人过氧化氢酶转导入人脐静脉内皮细胞

目的:采用体外培养的人脐静脉内皮细胞株(CRL-1730),研究PEP-1肽介导人过氧化氢酶穿透细胞的能力。方法:构建原核表达质粒pET15b-PEP-1-CAT,将其在基因工程菌中表达出N端带有6个组氨酸“标签”(His-tag)的重组蛋白,并通过金属螯合亲和层析对其进行纯化,然后将纯化得到的PEP-1-CAT融合蛋白加入体外培养的人脐静脉内皮细胞,通过Western blot来分析其转导能力。结果:测序分析证实,原核表达质粒pET15b-PEP-1-CAT重组成功。SDS-PAGE和Western blot结果表明,PEP-1-CAT在E.coli中获得了高效表达,经Ni2+-NTA-树脂柱亲和层析纯化得到了融合蛋白PEP-1-CAT,并在体外检测到其具有特异的过氧化氢酶活性,活性值为77.1 U/g。将其加入到体外培养的内皮细胞培养基中,发现它能以剂量依赖及时间依赖的方式转导入细胞内,并能保持酶活性达48 h。结论:PEP-1-CAT融合蛋白能高效地转导入人脐静脉内皮细胞,为防治各种与氧化应激损伤有关的疾病开辟了新的途径。     

PEP-1-CAT抑制氧化应激条件下大鼠骨髓间充质干细胞的凋亡

目的:研究PEP-1-CAT融合蛋白转导入大鼠骨髓间充质干细胞(Bone marrow mesenchymal stem cells,MSC)的能力,以及其预处理对MSC在氧化应激损伤条件下凋亡的影响及其机制。方法:采用流式细胞仪检测MSC表面标记物CD29、CD90、CD45、CD34,并检测成脂肪细胞和成骨细胞的诱导分化能力。采用免疫荧光染色和Western blot检测融合蛋白His-CAT和His-PEP-1-CAT转导入MSC的能力。DAPI染色和流式细胞仪检测细胞的凋亡率,采用相应的试剂盒分别检测丙二醛(MDA)含量、乳酸脱氢酶(LDH)活性的改变和线粒体膜电位的变化。结果:MSC低表达CD34(1.78%)、CD45(1.41%),高表达CD29(94.3%)、CD90(95.5%),具有成脂、成骨多向分化的潜能。PEP-1-CAT转导入MSC中呈现时间和剂量依赖性特征,而His-CAT不能进入细胞内。与His-CAT组相比较,PEP-1-CAT融合蛋白预处理组MSC的凋亡率明显降低,LDH和MDA含量明显下降,减轻了因氧化应激引起的线粒体膜电位的下降。结论:PEP-1-CAT融合蛋白通过清除活性氧,维持线粒体膜电位的稳定,显著抑制了MSC在氧化应激损伤情况下的凋亡。     

pET15b-PEP-1-CAT原核表达质粒的构建及PEP-1-CAT融合蛋白的表达与纯化

目的构建pET15b-PEP-1-CAT原核表达质粒,并表达、纯化得到融合蛋白PEP-1-CAT,为防治与氧化应激有关的疾病奠定基础。方法设计并合成两端分别带5出l和Bgl II酶切位点的CAT引物,用PCR方法以pZeoSV2（＋）-CAT质粒为模板,特异性扩增CAT会长cDNA。将扩增的CATcDNA与dATP反应,利用TaqDNA聚合酶具有的非模板依赖性末端转移酶活性在CATcDNA的3＇末端加“A”并纯化．然后应用TA克隆策略将纯化后的CATcDNA插入至中间载体pGEM-TEasy Vector中得到pGEM-T-CAT。人工合成编码PEP-1的双链寡核甘酸,两端分别引入Nde I和Xho I酶切位点,将其插入pET15b中得到重组质粒pET15b-PEP-1。pGEM-T-CAT和pET15b-PEP-1分别经Sal I-Bgl II和Xho I-BamH I双酶切,利用同尾酶（Sol I与Xho I,Bgl II与BamH I）能酶切产生相同黏性末端的特性,将回收得到的CATcDNA片段与pET15b-PEP-1相连,构建出重组质粒pET15b-PEP-1-CAT,经PCR及酶切鉴定,并通过核苷酸序列测序证实。将鉴定正确的pET15b-PEP-1．CAT重组质粒转化BL21（DE3）,用IPTG诱导目的蛋白表达。然后利用重组蛋白N端的组氨酸“标签”（His-tag）对其进行金属螯合亲和层析纯化。结果测序分析证实,克隆入pET15b的PEP-1序列与设计合成的PEP-1由序列一致,CAT序列与GeneBank中登录号为“AY028632”的CATcDNA序列一致。SDS-PAGE和Westernblot结果表明,pET15b-PEP-1-CAT在E-coli中获得可溶性高表达,经Ni^2＋-NTA-树脂柱亲和层析纯化得到了PAGE纯的融合蛋白PEP-1-CAT,并在体外检测到其具有特异的过氧化氢酶活性,活性值为77.15U／g,结论成功构建了原核表达载体pET15b-PEP-1-CAT,并经表达、纯化得到可以天然活性形式穿透细胞的重组过氧化氢酶蛋白,从而为防治心肌缺血再灌注损伤等与氧化应激有关的疾病奠定了基础。