应用CRISPR/Cas9技术制备Vasohibin-2基因敲除小鼠模型及验证

目的:利用Cas9/RNA system gene targeting技术高效构建Vash2基因敲除小鼠模型?方法:根据Vash2基因序列,设计2对Vsah2基因的单链向导RNA(single-guide RNA,sgRNA)引物序列并克隆进入pU57-T7-GDNA载体?利用T7 RNA聚合酶体外转录sgRNA和Cas9 mRNA?将体外转录的gRNA/Cas9 mRNA显微注射入小鼠受精卵,通过PCR和基因测序对Vash2移码突变进行检测和鉴定?繁育Vash2基因敲除小鼠并分析后代突变情况?结果:顺利构建表达sgRNA载体并体外转录,成功将有活性的sgRNA和Cas9 mRNA直接注射入受精卵?基因测序鉴定获得5只F0代初建鼠?选取5号鼠与野生型鼠回交,得到F1代鼠,再相互交配得到F2代鼠?PCR显示F2代鼠Vash2基因移码突变,成功建立Vash2基因敲除小鼠模型并传代繁育? 结论:通过Cas9/RNA systemgene targeting技术可以成功制备Vash2基因敲除鼠模型,是用于Vash2研究的有效工具?     

Gata4基因H435Y突变型小鼠模型的建立及验证

目的选择野生型C57BL/6J 小鼠为研究模型,利用CRISPR/Cas9 技术建立Gata4 基因H435Y突变型小鼠。方法针对 Gata4基因的基因序列信息设计针对Gata4基因H435Y位点的单链向导RNA（single-guideRNA,sgRNA）,经活性检测后,将具 有活性的sgRNA和Cas9体外转录成RNA,通过显微注射将sgRNA、Cas9 mRNA以及含有点突变序列的donor DNA片段注射 到小鼠受精卵中,通过PCR和基因测序方法对Gata4基因突变进行检测及鉴定,培育Gata4基因突变小鼠并分析后代的突变情 况。结果顺利构建sgRNA载体并体外转录,成功sgRNA、Cas9 mRNA以及含有点突变序列的donor DNA片段注射到受精卵 中。基因测序鉴定获得4只F0代初建鼠。选取阳性F0代小鼠与野生型C57BL/6J小鼠杂交,得到F1代鼠,再相互交配获得F2 代鼠。PCR显示F2代鼠Gata4基因H435Y突变,成功建立Gata4基因H435Y突变小鼠模型并传代繁育。结论通过CRISPR/ Cas9技术可以成功建立Gata4基因H435Y突变小鼠动物模型。     

应用CRISPR/Cas9基因编辑技术建立miRNA-301a敲除小鼠

目的 利用CRISPR/Cas9基因编辑技术建立miRNA敲除小鼠模型.方法 根据miRNA基因序列,设计针对miR-301a的gRNA引物序列(双靶点),PCR扩增获得针对miR-301a的体外转录模板DNA和构建Cas9体外转录模板,然后进行Cas9和gRNA体外转录.利用体外转录的gRNA/Cas9 mRNA对小鼠受精卵显微注射,并利用T7E1酶切和基因测序对miR-301a突变进行检测和鉴定.结果 PCR扩增、凝胶电泳和基因测序鉴定证实,获得序列正确的用于体外转录的模板DNA;体外转录获得gRNA/Cas9 mRNA,顺利完成对小鼠受精卵的显微注射;利用T7E1酶切对miR-301a突变进行检测,发现8只新生小鼠中有7只(87.5％)被鉴定在miR-301a位点携带突变;基因测序结果显示,各小鼠均有不同程度的碱基插入或缺失突变,其中缺失碱基数目最多的4号小鼠产生31个碱基缺失.结论 成功建立miR-301a基因高效敲除小鼠模型.     

小鼠TDO2基因条件性敲除打靶载体的构建

目的 构建小鼠TDO2基因条件性敲除打靶载体,为建立TDO2基因条件性敲除小鼠奠定基础。方法 根据CRISPR/Cas9技术原理,设计并构建单链向导RNA(sgRNA)和Donor载体,以TDO2-201(ENSMUST00000029645.13)转录本的外显子3作为敲除区,在打靶基因两侧各放置一个Loxp元件,建立条件性敲除TDO2第3号外显子的条件性基因打靶载体。将CRISPR/Cas9复合体和Donor载体显微注射到C57BL/6小鼠的受精卵中,获得阳性F0小鼠,再将阳性F0代小鼠与C57BL/6小鼠交配获得F1代小鼠,并经PCR和基因测序鉴定F1代小鼠基因型。结果 结果证实所构建的TDO2基因条件性敲除打靶载体符合设计要求,成功繁育并鉴定出B6/JGpt-TDO2^em1Cflox/Gpt小鼠。结论 成功构建了小鼠TDO2基因条件性敲除打靶载体,为后续进一步构建TDO2基因条件敲除小鼠奠定了基础。     

利用CRISPR/Csa9技术构建溶酶体运输调节因子基因缺陷C57BL/6小鼠

目的获得自然杀伤(NK)细胞缺陷的小鼠动物模型,并研究溶酶体运输调节因子(Lyst)基因的功能。方法采用CRISPR/Cas9技术敲除C57BL/6小鼠的Lyst基因:针对小鼠Lyst基因编码区第50个外显子,设计CRISPR/Cas9靶点引物(sgRNA),并重组构建pUC57-Lyst-sg RNA载体。将重组质粒体与Cas9质粒分别利用T7 RNA聚合酶体外转录为mRNA,并按比例显微注射入小鼠受精卵,将受精卵移植到受体动物。获得子代小鼠后,利用PCR扩增和测序方法筛选Lyst基因发生改变的动物个体。结果显微注射移植后获得7只F0代基因敲除小鼠,且毛色均发生了明显的变化。结论利用CRISPR/Cas9技术可以构建Lyst基因缺陷小鼠,外观表型与已有的文献报道一致。     

应用CRISPR/Cas9技术制备MrgD基因敲除小鼠模型

目的 利用CRISPR/Cas9基因编辑技术建立MrgD基因敲除的小鼠模型,为研究MrgD基因在糖、脂代谢中的作用提供实验工具。方法 根据MrgD基因第一外显子碱基序列,设计针对MrgD基因的sgRNA（single guide RNA）,构建sgRNA表达质粒,利用T7RNA聚合酶体外转录sgRNA和Cas9后,将Cas9 mRNA和sgRNA对C57BL/6J小鼠的受精卵进行显微注射。使用基因测序检测MrgD基因碱基的突变情况。结果 获得了MrgD基因突变的F2代纯合子小鼠,即MrgD基因缺失173bp的小鼠。并且,初步研究显示MrgD基因纯合突变小鼠在普通饲料喂养下糖、脂代谢正常。结论 成功构建了MrgD基因敲除小鼠动物模型,为探讨MrgD基因在糖尿病发生发展中的作用提供研究平台。     

利用CRISPR/Cas9技术建立RelB敲除小鼠模型

目的：利用CRISP/Cas9技术敲除C57BL/6小鼠中的RelB基因,为核因子（nuclear factor,NF）?κB转录因子蛋白家族的RelB基因与肿瘤转移等方面的研究提供RelB基因敲除实验动物模型。方法：利用基因编辑技术CRISPR/Cas9系统,设计并构建针对目的基因RelB第4外显子sgRNA,同时利用T7 RNA聚合酶体外转录Cas9 mRNA。取C57BL/6小鼠受精卵体外注射sgRNA和Cas9 mRNA后,进行胚胎移植,实现靶基因敲除。待小鼠出生后提取DNA并进行PCR鉴定,获得F0代,后与野生型交配后繁殖,取样提取DNA,测序分析鉴定后获得F1代小鼠,并在蛋白质水平和基因组水平分别验证敲除效果。结果：获得了4个在RelB基因突变的首建鼠,并得到了稳定遗传的RelB基因敲除小鼠。基因组测序结果示,敲除实验组中RelB的mRNA出现无义突变,令其mRNA翻译终止。与对照组相比,敲除实验组检测不到RelB蛋白表达。同时,Western blot结果显示,NF?κB家族中其他成员RelA、p50和p52的蛋白表达不受影响。结论：成功获得特异性敲除RelB的C57BL/6小鼠,为RelB在肿瘤转移、耐药中的研究提供了重要工具。     

利用CRISPR/Cas9技术构建miRNA-29b1基因敲除小鼠

目的应用CRISPR/Cas9技术构建miRNA-29b1基因敲除小鼠。方法针对miRNA-29b1基因设计一段sgRNA,sgRNA和Cas9体外转录后显微注射至C57BL/6小鼠受精卵细胞。小鼠出生后取其基因组DNA进行测序以鉴定基因型,同时取小鼠心、肝、脾、肺、肾等脏器研磨后提取总RNA,通过real-time PCR分析miRNA-29b1在这些脏器中的表达。结果设计了20 bp的miRNA-29b1sgRNA并与Cas9一起进行了体外转录,显微注射小鼠受精卵细胞后获得miRNA-29b1基因突变小鼠。测序结果表明突变小鼠有两种基因型,一种为10 bp的缺失突变;另一种为22 bp的缺失突变,同时伴有3 bp的插入突变。与野生型小鼠相比,基因突变小鼠心、肝、脾、肺、肾等组织中miRNA-29b1表达量下降明显。结论应用CRISPR/Cas9技术成功构建miRNA-29b1基因敲除小鼠。     

利用CRISPR/Cas9技术构建miRNA-29b1基因敲除小鼠的研究

目的 应用CRISPR/Cas9技术构建miRNA-29b1基因敲除小鼠。方法 针对miRNA-29b1基因设计一段sgRNA,sgRNA和Cas9体外转录后显微注射至C57BL/6小鼠受精卵细胞。小鼠出生后取其基因组DNA进行测序以鉴定基因型,同时取小鼠心、肝、脾、肺、肾等脏器研磨后提取总RNA,通过real-time PCR分析miRNA-29b1在这些脏器中的表达。结果 设计了20 bp的miRNA-29b1sgRNA并与Cas9一起进行了体外转录,显微注射小鼠受精卵细胞后获得miRNA-29b1基因突变小鼠。测序结果表明突变小鼠有两种基因型,一种为10 bp的缺失突变;另一种为22 bp的缺失突变,同时伴有3 bp的插入突变。与野生型小鼠相比,基因突变小鼠心、肝、脾、肺、肾等组织中miRNA-29b1表达量下降明显。结论 应用CRISPR/Cas9技术成功构建miRNA-29b1基因敲除小鼠。     

髓系特异性Spi1基因敲除小鼠的构建和基因鉴定

目的 构建髓系特异性Spi1基因敲除小鼠并分析其基因型,为疾病病理机制及药物靶点研究提供动物模型基础。方法 根据CRISPR/Cas9技术原理和Cre/LoxP系统,设计并构建sgRNA和Donor载体,以第2号外显子(Exon 2)所在的转录本为敲除区域,在Exon 2两侧各放置同向Loxp元件;将Cas9蛋白、sgRNA和Donor载体混合显微注射到C57BL/6J小鼠的受精卵中,移植受精卵到假孕的C57BL/6J母鼠的子宫中,19～20 d后获得F0代。将阳性F0代小鼠与C57BL/6J小鼠交配,得到稳定的F1代Spi1^flox/+小鼠。F1代Spi1^flox/+小鼠雌雄自交得到Spi1^flox/flox小鼠。Spi1^flox/flox与Lyz2-Cre⁺小鼠交配得到Spi1^flox/+/Lyz2-Cre⁺小鼠,再将其与Spi1^flox/flox交配,得到的Spi1^flox/flox/...     

采用CRISPR/Cas9技术构建新品系HBeAg转基因小鼠

目的培育一种HBeAg转基因小鼠新品系。方法克隆乙型肝炎病毒HBeAg基因;采用CRISPR/Cas9技术,通过同源重 组的方式分别在Rosa26基因位点定点插入pliver-HBeAg表达框,获得含有HBeAg基因的表达载体pliver-HBeAg,经酶切得到 含有HBeAg基因的线性DNA 片段,将Cas9 mRNA、gRNA和donor vector显微注射到C57BL/6J小鼠的受精卵中,再将其移植 入C57BL/6J雌性代孕小鼠子宫,获得F0代建系小鼠;采用长片段PCR对出生小鼠进行鉴定,共获得HBeAg基因正确同源重组 的F0代建系小鼠;F0代阳性小鼠与野生型C57BL/6J小鼠交配,繁育获得F1代小鼠,经PCR鉴定及测序确认阳性F1代小鼠;将 携带HBeAg基因的F1代转基因小鼠再次回交,对子代小鼠进行PCR基因型鉴定,直至获得纯合子子代转基因小鼠;采用全自 动化学发光免疫分析仪、胶体金法和免疫组织化学方法分别检测HBeAg转基因鼠血浆和肝组织中HBeAg和HBeAb的表达。 结果采用CRISPR/Cas9技术共获得56只F0代小鼠,其中2只为正确同源重组的F0代小鼠;F1代小鼠中6只阳性F1代小鼠。 截至目前,共获得22只F2代纯合子和29只杂合子HBeAg转基因小鼠。所有HBeAg转基因小鼠外周血中均可检出高浓度的 HBeAg蛋白,但未检出HBeAb的表达。而且免疫组化结果显示HBeAg转基因小鼠肝脏肝细胞中可特异性表达HBeAg蛋白。 结论采用CRISPR/Cas9技术成功构建了能在肝脏肝细胞中稳定表达HBeAg蛋白且对HBeAg免疫耐受的新品系HBeAg转基 因小鼠,为HBV的研究提供了新的实验动物模型。     

利用CRISPR/Cas9技术制备敲除AR和IRS2基因大鼠

目的探讨应用CRISPR/Cas9技术制备敲除雄激素受体(AR)和胰岛素受体底物2(IRS2)基因大鼠,构建可用于研究的稳定遗传的基因敲除大鼠品系。方法针对与雄激素表达相关基因-AR基因和胰岛素表达有关的胰岛素受体底物(IRS)基因设计出了20 bp的AR/IRS2 sgRNA和30 bp AR/IRS2 sgRNA,设计出的sgRNA和Cas9体外转录后显微注射至SD大鼠受精卵细胞,F0代大鼠出生后取其基因组DNA测序鉴定基因型后,对确认敲除的大鼠F0与野生型交配,获得杂合子F1代。结果设计了20 bp AR/IRS2 sgRNA和30 bp AR/IRS2 sgRNA,与Cas9一起进行了体外转录后显微注射至SD大鼠受精卵细胞,共获得2个受精卵并移植到1只雌性代孕大鼠。繁殖出嵌合体大鼠F0 2只(#51,#56),F0#51、#56与野生型大鼠合笼,繁殖出F1大鼠9只,其中F0#51繁殖出3只为双敲大鼠(#12,#13,#18),其余6只为单敲大鼠,F0#51产生的3只双敲大鼠发生不同程度的碱基插入或缺失,其中#12,#18大鼠在AR基因上缺失7个碱基(CCCCGGC),在IRS2基因上缺失4个碱基(GCGC)。#13大鼠在AR基因上插入2个碱基(CG),在IRS2基因上缺失4个碱基(GCGC)。大鼠的AR、IRS2基因表达被破坏。结论采用CRISPR/Cas9技术成功获得敲除基因AR、IRS2大鼠,经基因测序和蛋白质免疫印迹鉴定AR、IRS2,证明正确,为下一步鉴定是否表现出多囊卵巢综合征表型特征打下基础。     

基于CRISPR/Cas9技术PCSK9基因敲除小鼠模型的构建及表型验证

目的 基于CRISPR/Cas9技术构建前枯草杆菌蛋白原转换酶9(Preprotein convertase subtilisin/kexin type9,PCSK9)基因敲除小鼠模型并对其表型进行初步验证。方法 利用非同源末端连接(NHEJ)修复引入突变的方式,针对PCSK9基因靶序列设计单链向导RNA(sgRNA),将sgRNA和Cas9 mRNA显微注射到C57BL/6J小鼠受精卵,获得F0代敲除小鼠,通过繁育及基因型鉴定获得PCSK9基因敲除(PCSK9 KO)纯合子小鼠。采用PCR方法对PCSK9 KO小鼠进行基因鉴定,Western Blot检测肝组织PCSK9及低密度脂蛋白受体(LDL-R)蛋白的表达,同时检测心、脑、肾、脂肪组织中的PCSK9蛋白表达水平,q-PCR检测PCSK9的mRNA表达水平。采用酶法检测血清中总胆固醇(TC)及甘油三酯(TG)水平。结果 PCR产物凝胶电泳以及PCSK9蛋白及mRNA表达结果表明成功获得全身性PCSK9基因敲除小鼠,肝组织LDL-R(3.42±0.56)蛋白表达显著增高。与WT组相比,PCSK9小鼠血清TC(90.75±17.81...     

应用CRISPR/Cas9和Cas9⁃D10A建立Nsun5基因敲除小鼠模型并分析脱靶效应

目的：为了检测CRISPR/Cas9系统的潜在脱靶效应,分别利用野生型Cas9和切口酶Cas9?D10A构建了RNA甲基转移酶Nsun5基因敲除小鼠模型,并对两种策略得到的F0小鼠进行脱靶分析,以比较两种敲除策略的特异性。方法：针对Nsun5基因第3外显子,设计1对sgRNA,将野生型Cas9 mRNA和切口酶Cas9?D10A mRNA分别同这对sgRNA混合后注入小鼠一细胞期受精卵中,实现靶基因敲除,比较两种Cas9得到的F0代敲除小鼠的脱靶效应。结果：利用CRISPR/Cas9和Cas9?D10A成功建立Nsun5基因敲除小鼠模型,对两种Cas9得到的F0代突变小鼠进行潜在脱靶位点分析,均未检测到脱靶位点的存在。结论：两种策略都成功构建了不含脱靶位点的Nsun5基因敲除小鼠模型,为进一步研究Nsun5的生物学功能打下基础。     

盘状结构域受体1对实验性结肠炎小鼠肠道炎症及纤维化的影响

目的 探究盘状结构域受体1(discoidin domain receptors,DDRl)在慢性结肠炎小鼠肠道炎症及肠纤维化中的功能.方法 针对DDR1基因exon4设计并合成gRNA序列,与编码Cas9的mRNA混合显微注射入C57BL/6小鼠受精卵内,构建DDR1基因突变小鼠.选择F4代基因敲除纯合子小鼠(DDR...     

利用双引导RNA的CRISPR-Cas9技术构建Nudt3基因敲除小鼠及其验证研究

一项针对肥胖人群的全基因组关联分析（Genome-wide Association Study, GWAS）研究提示,NUDT3在肥胖的发生发展过程中有潜在的重要功能,但是缺乏基因敲除小鼠模型进行进一步的研究。目的：利用CRISPR/Cas9介导的基因编辑技术构建Nudix水解酶家族成员核苷二磷酸连接的部分X基序3（Nudix (nucleotide diphosphate linked moiety X)-type motif 3, Nudt3）基因敲除C57BL/6小鼠模型。方法：根据CRISPR/Cas9介导的基因编辑技术的原理,在Nudt3基因第二个外显子位置及第二个外显子与第三个外显子间的区域分别设计两个引导RNA(guide RNA, gRNA),结合早期胚胎显微注射技术构建生殖系基因编辑嵌合体小鼠,并从中筛选出合适的基因敲除小鼠。在此基础上,采用反转录PCR（RT-PCR）和蛋白质免疫印迹法（Western Blot）技术验证Nudt3基因在mRNA和蛋白水平的表达。结果：我们以较高效率获得了F0代基因编辑小鼠,通过繁育获得了F1代杂合子小鼠和F2代纯合子小鼠。检测结果显示: F2代纯合子小鼠的若干代谢调控组织（如肝脏、下丘脑等）中均无Nudt3表达。结论：Nudt3基因敲除小鼠构建成功。该小鼠模型为下一步的代谢表型鉴定以及机理研究提供了理想的动物模型。 [关键词] CRISPR/Cas9, NUDT3, 小鼠模型,肥胖,基因敲除     

利用CRISPR/Cas9敲除大鼠胰岛素受体底物1（Irs1）基因

目的为研究胰岛素受体底物1(Irs1)基因与代谢病之间的关系,我们利用CRISPR/Cas9系统敲除大鼠Irs1基因,为研究代谢病提供基因敲除大鼠。方法针对Irs1第一外显子,设计CRISPR/Cas9作用靶点,构建sgRNA表达质粒。利用T7 RNA聚合酶体外转录sgRNA和Cas9。将Cas9 mRNA和sgRNA混合物注射入SD大鼠的受精卵中,实现靶基因敲除。用T7EN1实验初步检测靶基因的修饰情况,再经过测序分析确定突变。结果获得了5个在Irs1基因突变的首建鼠,突变效率为83%。结论得到了稳定遗传的Irs1基因敲除大鼠。     

利用双重sgRNAs构建miR-223全基因敲除小鼠

目的利用双重sgRNAs构建miR-223全基因敲除小鼠。方法针对miR-223基因设计双重sgRNAs,将体外转录的sgRNAs和Cas9 mRNA共同显微注射入C57BL/6小鼠受精卵细胞。小鼠出生后取其基因组DNA进行PCR扩增和测序以鉴定基因型,同时取小鼠肝脏研磨后提取总RNA,通过real-time PCR分析miR-223在肝脏中的表达。结果设计了miR-223基因双重sgRNAs并对其进行了体外转录,纯化后显微注射小鼠受精卵细胞获得miR-223基因突变小鼠。测序结果表明突变小鼠有3种基因型,一种为6 bp的缺失突变,但未对miR-223序列产生影响;另外两种为162 bp和168 bp的缺失突变,完全删除miR-223前体和成熟区序列。与野生型相比,这两种小鼠肝组织中几乎不能检测到miR-223的表达。结论设计双重sgRNAs并应用CRISPR/Cas9技术成功构建miR-223全基因敲除小鼠。     

利用CRISPR/Cas9系统快速建立APPswe/PS1dE9双转基因阿尔茨海默病小鼠模型

目的利用CRISPR/Cas9系统构建APPswe/PS1dE9双转基因阿尔茨海默病（AD）小鼠模型,为开展AD的病因治疗提供载体。方法采用CRISPR/Cas9系统,选择H11作为插入位点,将有活性的sgRNA、Cas9RNA和含有目标同源重组序列的载体显微注射入C57BL/6品系野生雌性小鼠的受精卵中,鉴定得到的F0代阳性小鼠再与C57BL/6野生小鼠交配,从而获得F1代小鼠。对鉴定得到的F1代杂合子小鼠,选择来自同一只F0代小鼠基因型一致的F1代杂合子小鼠,达到性成熟后进行同胞交配,获得F2代小鼠。采用PCR方法鉴定F2代小鼠的基因型结果,采用Westernblot检测APP和PS1在F2代小鼠脑组织中的蛋白表达水平。结果27只F2代小鼠经PCR鉴定基因型,5只F2代小鼠出现约344bp和608bp的目的基因条带,表明成功构建出转入APP和PS1基因的APPswe/PS1dE9双转基因AD小鼠。Westernblot检测显示APPswe/PS1dE9双转基因AD小鼠的APP和PS1的表达水平均明显高于同窝野生型小鼠。结论利用CRISPR/Cas9系统可成功构建APPswe/PS1dE9双转基因AD小鼠。