应用CRISPR/Cas9技术制备Vasohibin-2基因敲除小鼠模型及验证

目的:利用Cas9/RNA system gene targeting技术高效构建Vash2基因敲除小鼠模型?方法:根据Vash2基因序列,设计2对Vsah2基因的单链向导RNA(single-guide RNA,sgRNA)引物序列并克隆进入pU57-T7-GDNA载体?利用T7 RNA聚合酶体外转录sgRNA和Cas9 mRNA?将体外转录的gRNA/Cas9 mRNA显微注射入小鼠受精卵,通过PCR和基因测序对Vash2移码突变进行检测和鉴定?繁育Vash2基因敲除小鼠并分析后代突变情况?结果:顺利构建表达sgRNA载体并体外转录,成功将有活性的sgRNA和Cas9 mRNA直接注射入受精卵?基因测序鉴定获得5只F0代初建鼠?选取5号鼠与野生型鼠回交,得到F1代鼠,再相互交配得到F2代鼠?PCR显示F2代鼠Vash2基因移码突变,成功建立Vash2基因敲除小鼠模型并传代繁育? 结论:通过Cas9/RNA systemgene targeting技术可以成功制备Vash2基因敲除鼠模型,是用于Vash2研究的有效工具?     

基于CRISPR/Cas9技术构建GP73基因敲除小鼠模型及表型验证

目的：基于CRISPR/Cas9技术构建高尔基体73(GP73)基因敲除小鼠模型并对其表型进行初步验证。方法：利用非同源末端连接(NHEJ)修复引入突变的方式,造成GP73基因蛋白读码框移码,使其功能缺失,针对GP73基因外显子4设计sgRNA靶位点,体外转录获得sgRNA,与编码Cas9的mRNA混合后通过受精卵显微注射方法获得F0代阳性敲除小鼠,通过繁育及基因型鉴定获得GP73基因敲除纯合子小鼠(GP73^-/-小鼠)。采用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)法检测肝、肾、皮下脂肪、棕色脂肪组织中GP73 mRNA表达,采用酶联免疫吸附试验(ELISA)法检测血清GP73蛋白水平。结果：与野生型(WT)小鼠相比,GP73^-/-小鼠肝、肾、皮下脂肪、棕色脂肪组织GP73 mRNA及蛋白表达水平降低,血清GP73蛋白水平降低(均P<0.05)。结论：基于CRISPR/Cas9技术成功构建了GP73基因敲除小鼠。     

利用CRISPR/Cas9技术建立RelB敲除小鼠模型

目的：利用CRISP/Cas9技术敲除C57BL/6小鼠中的RelB基因,为核因子（nuclear factor,NF）?κB转录因子蛋白家族的RelB基因与肿瘤转移等方面的研究提供RelB基因敲除实验动物模型。方法：利用基因编辑技术CRISPR/Cas9系统,设计并构建针对目的基因RelB第4外显子sgRNA,同时利用T7 RNA聚合酶体外转录Cas9 mRNA。取C57BL/6小鼠受精卵体外注射sgRNA和Cas9 mRNA后,进行胚胎移植,实现靶基因敲除。待小鼠出生后提取DNA并进行PCR鉴定,获得F0代,后与野生型交配后繁殖,取样提取DNA,测序分析鉴定后获得F1代小鼠,并在蛋白质水平和基因组水平分别验证敲除效果。结果：获得了4个在RelB基因突变的首建鼠,并得到了稳定遗传的RelB基因敲除小鼠。基因组测序结果示,敲除实验组中RelB的mRNA出现无义突变,令其mRNA翻译终止。与对照组相比,敲除实验组检测不到RelB蛋白表达。同时,Western blot结果显示,NF?κB家族中其他成员RelA、p50和p52的蛋白表达不受影响。结论：成功获得特异性敲除RelB的C57BL/6小鼠,为RelB在肿瘤转移、耐药中的研究提供了重要工具。     

利用CRISPR/Cas9技术构建Bpi基因敲除小鼠

目的利用CRISPR/Cas9基因编辑技术高效构建Bpi基因敲除的小鼠模型,并继续繁殖、鉴定及建立稳定遗传的Bpi基因敲除小鼠品系。方法针对C57BL/6小鼠Bpi基因的第2～3外显子两端设计敲除靶点,筛选高活性gRNA(guide RNA)靶点,体外转录得到sgRNA(small guide RNA)并与Cas9 mRNA一起显微注射到C57BL/6小鼠的受精卵内,经胚胎移植至代孕母鼠体内,获得F0代小鼠后,通过基因型鉴定和DNA测序获得基因突变的阳性子代鼠。结果筛选到高活性gRNA靶点并成功获得体外转录产物sgRNA;与Cas9 mRNA一起通过显微注射的方式获得了64枚状态良好的受精卵并成功移植到2只代孕母鼠体内;获得了22只F0代小鼠,经PCR鉴定和DNA测序后选择一只单链缺失708 bp碱基的阳性小鼠进行扩繁,并在F1、F2代检测到该突变,且F2代成功繁育出纯合子小鼠。结论成功构建Bpi基因敲除小鼠模型,为进一步研究Bpi基因及其表达产物的生物学功能奠定了基础。     

Gata4基因H435Y突变型小鼠模型的建立及验证

目的选择野生型C57BL/6J 小鼠为研究模型,利用CRISPR/Cas9 技术建立Gata4 基因H435Y突变型小鼠。方法针对 Gata4基因的基因序列信息设计针对Gata4基因H435Y位点的单链向导RNA（single-guideRNA,sgRNA）,经活性检测后,将具 有活性的sgRNA和Cas9体外转录成RNA,通过显微注射将sgRNA、Cas9 mRNA以及含有点突变序列的donor DNA片段注射 到小鼠受精卵中,通过PCR和基因测序方法对Gata4基因突变进行检测及鉴定,培育Gata4基因突变小鼠并分析后代的突变情 况。结果顺利构建sgRNA载体并体外转录,成功sgRNA、Cas9 mRNA以及含有点突变序列的donor DNA片段注射到受精卵 中。基因测序鉴定获得4只F0代初建鼠。选取阳性F0代小鼠与野生型C57BL/6J小鼠杂交,得到F1代鼠,再相互交配获得F2 代鼠。PCR显示F2代鼠Gata4基因H435Y突变,成功建立Gata4基因H435Y突变小鼠模型并传代繁育。结论通过CRISPR/ Cas9技术可以成功建立Gata4基因H435Y突变小鼠动物模型。     

基于CRISPR/Cas9技术构建严重联合免疫缺陷小鼠的实验研究

目的：应用CRISPR/Cas9技术靶向敲除编码小鼠T、B细胞的Rag2基因及编码NK细胞的IL2rg基因,构建T、B细胞及NK细胞联合免疫缺陷小鼠。方法：根据Genbank报道的Rag2及IL2rg基因序列,分别针对其外显子设计25bp左右的sgRNA并进行合成, sgRNA退火后克隆入pX330载体。Rag2-sgRNA、IL2rg-sgRNA及Cas9重组质粒体外转录为mRNA后显微注射入BALB/c小鼠受精卵细胞,受精卵细胞移植到受体动物获得子代小鼠,首建鼠（F0）与野生型小鼠交配获得F1代小鼠,突变的F1代小鼠互交后筛选F2代纯合子小鼠。通过基因测序、流式细胞术及接种人源性肿瘤细胞系方法检测子代小鼠基因型和表型。结果：成功构建了Rag2-sgRNA、IL2rg-sgRNA重组质粒并对其进行了体外转录,mRNA显微注射并移植后获得57只F0小鼠。连续交配后,获得F2代纯合子小鼠。序列分析表明子代小鼠中IL2rg有两个基因型,分别是10bp和11bp的缺失突变;而Rag2只有一个基因型,为8bp的缺失突变。与野生型BALB/c小鼠相比,小鼠外周血中CD3、B220及NKp46阳性细胞数量明显降低。接种人乳腺癌细胞系SKBR-2HL后,肿瘤生长良好,且随着时间延长肿瘤组织逐渐增大。结论：利用CRISPR/Cas9技术可有效实现BABL/c小鼠体内Rag2、IL2rg基因突变,并导致小鼠T、B及NK细胞功能异常。     

基于CRISPR/Cas9技术PCSK9基因敲除小鼠模型的构建及表型验证

目的 基于CRISPR/Cas9技术构建前枯草杆菌蛋白原转换酶9(Preprotein convertase subtilisin/kexin type9,PCSK9)基因敲除小鼠模型并对其表型进行初步验证。方法 利用非同源末端连接(NHEJ)修复引入突变的方式,针对PCSK9基因靶序列设计单链向导RNA(sgRNA),将sgRNA和Cas9 mRNA显微注射到C57BL/6J小鼠受精卵,获得F0代敲除小鼠,通过繁育及基因型鉴定获得PCSK9基因敲除(PCSK9 KO)纯合子小鼠。采用PCR方法对PCSK9 KO小鼠进行基因鉴定,Western Blot检测肝组织PCSK9及低密度脂蛋白受体(LDL-R)蛋白的表达,同时检测心、脑、肾、脂肪组织中的PCSK9蛋白表达水平,q-PCR检测PCSK9的mRNA表达水平。采用酶法检测血清中总胆固醇(TC)及甘油三酯(TG)水平。结果 PCR产物凝胶电泳以及PCSK9蛋白及mRNA表达结果表明成功获得全身性PCSK9基因敲除小鼠,肝组织LDL-R(3.42±0.56)蛋白表达显著增高。与WT组相比,PCSK9小鼠血清TC(90.75±17.81...     

利用CRISPR/Cas9技术构建miRNA-29b1基因敲除小鼠

目的应用CRISPR/Cas9技术构建miRNA-29b1基因敲除小鼠。方法针对miRNA-29b1基因设计一段sgRNA,sgRNA和Cas9体外转录后显微注射至C57BL/6小鼠受精卵细胞。小鼠出生后取其基因组DNA进行测序以鉴定基因型,同时取小鼠心、肝、脾、肺、肾等脏器研磨后提取总RNA,通过real-time PCR分析miRNA-29b1在这些脏器中的表达。结果设计了20 bp的miRNA-29b1sgRNA并与Cas9一起进行了体外转录,显微注射小鼠受精卵细胞后获得miRNA-29b1基因突变小鼠。测序结果表明突变小鼠有两种基因型,一种为10 bp的缺失突变;另一种为22 bp的缺失突变,同时伴有3 bp的插入突变。与野生型小鼠相比,基因突变小鼠心、肝、脾、肺、肾等组织中miRNA-29b1表达量下降明显。结论应用CRISPR/Cas9技术成功构建miRNA-29b1基因敲除小鼠。     

应用CRISPR/Cas9技术制备MrgD基因敲除小鼠模型

目的 利用CRISPR/Cas9基因编辑技术建立MrgD基因敲除的小鼠模型,为研究MrgD基因在糖、脂代谢中的作用提供实验工具。方法 根据MrgD基因第一外显子碱基序列,设计针对MrgD基因的sgRNA（single guide RNA）,构建sgRNA表达质粒,利用T7RNA聚合酶体外转录sgRNA和Cas9后,将Cas9 mRNA和sgRNA对C57BL/6J小鼠的受精卵进行显微注射。使用基因测序检测MrgD基因碱基的突变情况。结果 获得了MrgD基因突变的F2代纯合子小鼠,即MrgD基因缺失173bp的小鼠。并且,初步研究显示MrgD基因纯合突变小鼠在普通饲料喂养下糖、脂代谢正常。结论 成功构建了MrgD基因敲除小鼠动物模型,为探讨MrgD基因在糖尿病发生发展中的作用提供研究平台。     

利用CRISPR/Cas9敲除大鼠胰岛素受体底物1（Irs1）基因

目的为研究胰岛素受体底物1(Irs1)基因与代谢病之间的关系,我们利用CRISPR/Cas9系统敲除大鼠Irs1基因,为研究代谢病提供基因敲除大鼠。方法针对Irs1第一外显子,设计CRISPR/Cas9作用靶点,构建sgRNA表达质粒。利用T7 RNA聚合酶体外转录sgRNA和Cas9。将Cas9 mRNA和sgRNA混合物注射入SD大鼠的受精卵中,实现靶基因敲除。用T7EN1实验初步检测靶基因的修饰情况,再经过测序分析确定突变。结果获得了5个在Irs1基因突变的首建鼠,突变效率为83%。结论得到了稳定遗传的Irs1基因敲除大鼠。     

利用CRISPR/Cas9技术构建miRNA-29b1基因敲除小鼠的研究

目的 应用CRISPR/Cas9技术构建miRNA-29b1基因敲除小鼠。方法 针对miRNA-29b1基因设计一段sgRNA,sgRNA和Cas9体外转录后显微注射至C57BL/6小鼠受精卵细胞。小鼠出生后取其基因组DNA进行测序以鉴定基因型,同时取小鼠心、肝、脾、肺、肾等脏器研磨后提取总RNA,通过real-time PCR分析miRNA-29b1在这些脏器中的表达。结果 设计了20 bp的miRNA-29b1sgRNA并与Cas9一起进行了体外转录,显微注射小鼠受精卵细胞后获得miRNA-29b1基因突变小鼠。测序结果表明突变小鼠有两种基因型,一种为10 bp的缺失突变;另一种为22 bp的缺失突变,同时伴有3 bp的插入突变。与野生型小鼠相比,基因突变小鼠心、肝、脾、肺、肾等组织中miRNA-29b1表达量下降明显。结论 应用CRISPR/Cas9技术成功构建miRNA-29b1基因敲除小鼠。     

利用CRISPR/Cas9系统快速建立APPswe/PS1dE9双转基因阿尔茨海默病小鼠模型

目的利用CRISPR/Cas9系统构建APPswe/PS1dE9双转基因阿尔茨海默病（AD）小鼠模型,为开展AD的病因治疗提供载体。方法采用CRISPR/Cas9系统,选择H11作为插入位点,将有活性的sgRNA、Cas9RNA和含有目标同源重组序列的载体显微注射入C57BL/6品系野生雌性小鼠的受精卵中,鉴定得到的F0代阳性小鼠再与C57BL/6野生小鼠交配,从而获得F1代小鼠。对鉴定得到的F1代杂合子小鼠,选择来自同一只F0代小鼠基因型一致的F1代杂合子小鼠,达到性成熟后进行同胞交配,获得F2代小鼠。采用PCR方法鉴定F2代小鼠的基因型结果,采用Westernblot检测APP和PS1在F2代小鼠脑组织中的蛋白表达水平。结果27只F2代小鼠经PCR鉴定基因型,5只F2代小鼠出现约344bp和608bp的目的基因条带,表明成功构建出转入APP和PS1基因的APPswe/PS1dE9双转基因AD小鼠。Westernblot检测显示APPswe/PS1dE9双转基因AD小鼠的APP和PS1的表达水平均明显高于同窝野生型小鼠。结论利用CRISPR/Cas9系统可成功构建APPswe/PS1dE9双转基因AD小鼠。     

基于CRISPR/Cas9技术构建严重联合免疫缺陷小鼠

目的 应用CRISPR/Cas9技术靶向敲除编码小鼠T、B细胞的Rag2基因及编码NK细胞的IL2rg基因,构建T、B细胞及NK细胞联合免疫缺陷小鼠。方法 根据Genbank报道的Rag2及IL2rg基因序列,分别针对其外显子设计25 bp左右的sgRNA并进行合成, sgRNA退火后克隆入pX330载体。Rag2-sgRNA、IL2rg-sgRNA及Cas9重组质粒体外转录为mRNA后显微注射入BALB/c小鼠受精卵细胞,受精卵细胞移植到受体动物获得子代小鼠,首建鼠（F0）与野生型小鼠交配获得F1代小鼠,突变的F1代小鼠互交后筛选F2代纯合子小鼠。通过基因测序、流式细胞技术及接种人源性肿瘤细胞系方法检测子代小鼠基因型和表型。结果 成功构建了Rag2-sgRNA、IL2rg-sgRNA重组质粒并对其进行了体外转录,mRNA显微注射并移植后获得57只F0小鼠。连续交配后,获得F2代纯合子小鼠。序列分析表明子代小鼠中IL2rg有两个基因型,分别是10 bp和11 bp的缺失突变;而Rag2只有一个基因型,为8 bp的缺失突变。与野生型BALB/c小鼠相比,小鼠外周血中CD3、B220及NKp46阳性细胞数量明显降低。接种人乳腺癌细胞系SKBR-2HL后,肿瘤生长良好,且随着时间延长肿瘤组织逐渐增大。结论 利用CRISPR/Cas9技术可有效实现BABL/c小鼠体内Rag2、IL2rg基因突变,并导致小鼠T、B及NK细胞功能异常。     

利用CRISPR/Cas9技术制备敲除AR和IRS2基因大鼠

目的探讨应用CRISPR/Cas9技术制备敲除雄激素受体(AR)和胰岛素受体底物2(IRS2)基因大鼠,构建可用于研究的稳定遗传的基因敲除大鼠品系。方法针对与雄激素表达相关基因-AR基因和胰岛素表达有关的胰岛素受体底物(IRS)基因设计出了20 bp的AR/IRS2 sgRNA和30 bp AR/IRS2 sgRNA,设计出的sgRNA和Cas9体外转录后显微注射至SD大鼠受精卵细胞,F0代大鼠出生后取其基因组DNA测序鉴定基因型后,对确认敲除的大鼠F0与野生型交配,获得杂合子F1代。结果设计了20 bp AR/IRS2 sgRNA和30 bp AR/IRS2 sgRNA,与Cas9一起进行了体外转录后显微注射至SD大鼠受精卵细胞,共获得2个受精卵并移植到1只雌性代孕大鼠。繁殖出嵌合体大鼠F0 2只(#51,#56),F0#51、#56与野生型大鼠合笼,繁殖出F1大鼠9只,其中F0#51繁殖出3只为双敲大鼠(#12,#13,#18),其余6只为单敲大鼠,F0#51产生的3只双敲大鼠发生不同程度的碱基插入或缺失,其中#12,#18大鼠在AR基因上缺失7个碱基(CCCCGGC),在IRS2基因上缺失4个碱基(GCGC)。#13大鼠在AR基因上插入2个碱基(CG),在IRS2基因上缺失4个碱基(GCGC)。大鼠的AR、IRS2基因表达被破坏。结论采用CRISPR/Cas9技术成功获得敲除基因AR、IRS2大鼠,经基因测序和蛋白质免疫印迹鉴定AR、IRS2,证明正确,为下一步鉴定是否表现出多囊卵巢综合征表型特征打下基础。     

利用CRISPR/Cas9系统构建Lrtm1基因敲除的C2C12细胞系

目的：利用CRISPR/Cas9技术构建稳定敲除Lrtm1（leucine-rich repeats and transmenbrane domains 1）基因的C2C12细胞系,为研究Lrtm1基因的作用提供实验基础。方法：设计3对针对Lrtm1基因的向导RNA（sgRNA）,将sgRNA插入载体pCRISPR-LvSG06中;利用慢病毒包装系统包装含有sgRNA的重组质粒pCRISPR-LvSG06;将病毒感染C2C12细胞,并加入嘌呤霉素筛选,将筛选嘌呤霉素阳性的细胞提取RNA,逆转录成cDNA;设计Cas9引物,利用cDNA为模版,PCR验证C2C12细胞中Cas9的表达,确认慢病毒成功感染C2C12细胞;利用96孔板挑选单克隆细胞的方法筛选得到单克隆细胞;将扩增的单克隆细胞提取基因组DNA,测序Lrtm1基因相关序列并与野生型Lrtm1基因进行对比,确认敲除成功的克隆细胞株;诱导敲除Lrtm1稳定细胞株成肌分化,检测成肌分化标志因子Myosin的蛋白表达,RT-PCR检测转录因子PAX7的mRNA表达,Western blot检测H3K27me3蛋白水平。结果：测序结果显示向导RNA（sgRNA）成功插入载体质粒;将单克隆细胞DNA测序结果显示A和C克隆成功敲除Lrtm1基因;敲除Lrtm1基因后成肌分化标志因子Myosin蛋白表达降低,成肌转录因子PAX7 mRNA的表达降低,在分化72和96 h组,H3K27me3蛋白水平较野生型组增高。结论：利用CRISPR/Cas9技术成功敲除Lrtm1基因,稳定敲除Lrtm1基因的C2C12细胞系构建成功;敲除Lrtm1后能抑制C2C12细胞成肌分化,并且抑制成肌转录因子PAX7的mRNA表达,PAX7 mRNA表达降低的原因可能为H3K27me3水平增高。     

利用CRISPR/Csa9技术构建溶酶体运输调节因子基因缺陷C57BL/6小鼠

目的获得自然杀伤(NK)细胞缺陷的小鼠动物模型,并研究溶酶体运输调节因子(Lyst)基因的功能。方法采用CRISPR/Cas9技术敲除C57BL/6小鼠的Lyst基因:针对小鼠Lyst基因编码区第50个外显子,设计CRISPR/Cas9靶点引物(sgRNA),并重组构建pUC57-Lyst-sg RNA载体。将重组质粒体与Cas9质粒分别利用T7 RNA聚合酶体外转录为mRNA,并按比例显微注射入小鼠受精卵,将受精卵移植到受体动物。获得子代小鼠后,利用PCR扩增和测序方法筛选Lyst基因发生改变的动物个体。结果显微注射移植后获得7只F0代基因敲除小鼠,且毛色均发生了明显的变化。结论利用CRISPR/Cas9技术可以构建Lyst基因缺陷小鼠,外观表型与已有的文献报道一致。     

利用双引导RNA的CRISPR-Cas9技术构建Nudt3基因敲除小鼠及其验证研究

一项针对肥胖人群的全基因组关联分析（Genome-wide Association Study, GWAS）研究提示,NUDT3在肥胖的发生发展过程中有潜在的重要功能,但是缺乏基因敲除小鼠模型进行进一步的研究。目的：利用CRISPR/Cas9介导的基因编辑技术构建Nudix水解酶家族成员核苷二磷酸连接的部分X基序3（Nudix (nucleotide diphosphate linked moiety X)-type motif 3, Nudt3）基因敲除C57BL/6小鼠模型。方法：根据CRISPR/Cas9介导的基因编辑技术的原理,在Nudt3基因第二个外显子位置及第二个外显子与第三个外显子间的区域分别设计两个引导RNA(guide RNA, gRNA),结合早期胚胎显微注射技术构建生殖系基因编辑嵌合体小鼠,并从中筛选出合适的基因敲除小鼠。在此基础上,采用反转录PCR（RT-PCR）和蛋白质免疫印迹法（Western Blot）技术验证Nudt3基因在mRNA和蛋白水平的表达。结果：我们以较高效率获得了F0代基因编辑小鼠,通过繁育获得了F1代杂合子小鼠和F2代纯合子小鼠。检测结果显示: F2代纯合子小鼠的若干代谢调控组织（如肝脏、下丘脑等）中均无Nudt3表达。结论：Nudt3基因敲除小鼠构建成功。该小鼠模型为下一步的代谢表型鉴定以及机理研究提供了理想的动物模型。 [关键词] CRISPR/Cas9, NUDT3, 小鼠模型,肥胖,基因敲除     

利用CRISPR/Cas9 系统构建稳定敲除CBX2基因的A549细胞系

目的:利用CRISPR/Cas9系统构建稳定敲除CBX2基因的A549细胞系。方法:设计针对敲除CBX2的short guide RNA（sgRNA）,并克隆到载体PX459中。将测序正确的重组质粒转染到A549细胞中,利用嘌呤霉素筛选转染阳性细胞并分离得到5个单克隆细胞系,通过Western blot方法检测构建的细胞系中CBX2蛋白表达情况。结果:成功构建了靶向CBX2的CRISPR/Cas9重组质粒,筛选出的5个单克隆细胞系中CBX2蛋白表达水平均显著下降。结论:成功利用CRISPR/Cas9 系统构建了稳定敲除CBX2基因的A549细胞系。     

CRISPR/Cas9系统介导Slc6a6基因敲除大鼠的繁殖与鉴定

目的利用CRISPR/Cas9技术构建牛磺酸转运体基因(solute carrier family 6 member 6,Slc6a6)敲除大鼠,繁殖并鉴定,为研究牛磺酸缺失对神经系统疾病的影响提供稳定的大鼠模型。方法针对Slc6a6基因第5外显子,设计向导RNA(single-guide RNA,sgRNA)介导Cas9核酸酶与靶点DNA特异性结合,并切割基因组DNA,被切割后的DNA进行重组修复,从而实现基因的敲除。通过基因型鉴定和测序分析检测新生大鼠基因型。利用Real-time PCR、Western blot技术和免疫组化等方法,分析大鼠脑组织的牛磺酸转运体(taurine transporter,TauT)的mRNA表达和蛋白表达,建立Slc6a6基因敲除大鼠模型。结果 F3代出现21只Slc6a6基因敲除纯合子(TauT~(-/-)),54只杂合子(TauT~(+/-)),27只阴性(TauT~(+/+)),F3代纯合率约为20.59%,基本符合孟德尔遗传定律。Slc6a6基因敲除纯合子大鼠脑组织mRNA水平基本不表达,TauT蛋白表达水平显著低于同窝阴性大鼠。结论本研究利用CRISPR/Cas9系统定向敲除Slc6a6基因,成功构建Slc6a6基因敲除大鼠模型。