利用双引导RNA的CRISPR-Cas9技术构建Nudt3基因敲除小鼠及其验证研究

一项针对肥胖人群的全基因组关联分析（Genome-wide Association Study, GWAS）研究提示，NUDT3在肥胖的发生发展过程中有潜在的重要功能，但是缺乏基因敲除小鼠模型进行进一步的研究。目的：利用CRISPR/Cas9介导的基因编辑技术构建Nudix水解酶家族成员核苷二磷酸连接的部分X基序3（Nudix (nucleotide diphosphate linked moiety X)-type motif 3, Nudt3）基因敲除C57BL/6小鼠模型。方法：根据CRISPR/Cas9介导的基因编辑技术的原理，在Nudt3基因第二个外显子位置及第二个外显子与第三个外显子间的区域分别设计两个引导RNA(guide RNA, gRNA)，结合早期胚胎显微注射技术构建生殖系基因编辑嵌合体小鼠，并从中筛选出合适的基因敲除小鼠。在此基础上，采用反转录PCR（RT-PCR）和蛋白质免疫印迹法（Western Blot）技术验证Nudt3基因在mRNA和蛋白水平的表达。结果：我们以较高效率获得了F0代基因编辑小鼠，通过繁育获得了F1代杂合子小鼠和F2代纯合子小鼠。检测结果显示: F2代纯合子小鼠的若干代谢调控组织（如肝脏、下丘脑等）中均无Nudt3表达。结论：Nudt3基因敲除小鼠构建成功。该小鼠模型为下一步的代谢表型鉴定以及机理研究提供了理想的动物模型。 关键词] CRISPR/Cas9, NUDT3, 小鼠模型，肥胖，基因敲除

Construction and validation of NUDT3 gene knockout mice using CRISPR-Cas9 technique with double-guided RNA