肠出血性大肠埃希菌O157∶H7黏附HeLa细胞模型的建立

目的建立肠出血性大肠埃希菌O157：H7体外黏附HeLa细胞模型，为进一步研究其致病机制奠定基础。方法以细菌黏附HeLa细胞数量为指标，分别评价细菌数量、细菌与细胞孵育时间对细菌黏附数量的影响，得到最佳条件，最后肌动蛋白荧光染色（FAS）试验鉴定模型。结果加入细菌为1×10^5CFU，细菌与细胞孵育4h时，黏附细胞的数量最佳，FAS检测发现该条件下细菌能够引起细胞特异性黏附、擦拭（attaching＆effacing，A／E）损伤，模型建立成功。结论成功建立O157：H7体外黏附HeLa细胞模型，为进一步研究其致病机制提供了条件。     

肠出血性大肠埃希菌O157∶H7菌株的细胞毒性比较

目的 比较肠出血性大肠埃希菌流行菌株的细胞毒性,筛选强毒株,为进一步研究细菌的致病机理提供理论依据.方法 采用PCR技术鉴定菌株的毒力基因E-hlyA、stx2、stxl,Giemsa染色观察细菌的黏附情况,通过测定感染后Vero细胞的乳酸脱氢酶释放情况了解细菌的Vero细胞毒性强弱.结果 肠出血性大肠埃希菌O157∶H7菌株含有的毒力基因不同,均具有较强的黏附能力和Vero细胞毒性,其中国际菌株933W/O,中国流行菌株882364、01H112和日本菌株Cua9的Vero细胞毒性较强.结论 筛选出的流行菌株强毒株,可用于进一步的细菌感染模型构建和毒力基因致病机制研究.     

肠出血性大肠埃希菌O157:H7菌影生物学活性的初步研究

目的制备肠出血性大肠埃希菌O157∶H7细菌菌影,在细胞及动物水平对其生物学活性进行初步评价。方法将包含噬菌体phiX174裂解基因E的重组质粒pLSE转化肠出血性大肠埃希菌O157∶H7 EDL933及大肠埃希菌DH5α,42℃诱导制备菌影。利用间接免疫荧光实验观察菌影主要抗原结构,并利用电镜观察菌影对Hep-2细胞的黏附。将菌影免疫小鼠后,采用间接ELISA法检测小鼠特异性抗体,并通过小鼠攻毒实验考察菌影的保护效果。结果成功构建了重组质粒pLSE,制备出O157∶H7及DH5α菌影。O157∶H7菌影保留了病原菌的主要外膜抗原,能紧密黏附细胞Hep-2但并不侵入细胞。O157∶H7菌影免疫雄性BALB/c小鼠诱导特异性IgG抗体的产生。攻击试验结果显示小鼠对致死剂量O157∶H7 EDL933强毒株的保护率达到80%。结论 O157∶H7菌影的成功制备及生物学活性的初步析为研制O157∶H7菌影疫苗奠定了基础。     

鼠李糖乳杆菌效应蛋白HM0539增强小鼠对大肠杆菌O157:H7肠道感染的抵抗力

目的 探究鼠李糖乳杆菌LGG的效应蛋白HM0539对大肠杆菌O157∶H7肠道感染的预防效果。方法 采用黏附、侵袭实验评价HM0539处理后,大肠杆菌O157∶H7对HT-29细胞的黏附侵袭能力。通过免疫荧光、免疫印迹等方法进一步检测在使用HM0539治疗过程中对HT-29细胞中黏蛋白（MUC2）、紧密连接蛋白（ZO-1）表达的影响;通过动物实验,观察小鼠的生存率及体质量变化,检测攻毒小鼠的肠道病理及肠道屏障功能的改变。结果 HM0539呈浓度依赖性地抑制大肠杆菌O157∶H7黏附和侵袭HT-29,且HM0539的预处理效果优于共同处理（P<0.05）;免疫荧光和免疫印迹等结果显示,HM0539不仅可以明显降低大肠杆菌O157∶H7感染后MUC2的表达水平（P<0.05）,还可显著抑制其对细胞间紧密连接蛋白的破坏（P<0.05）。动物实验结果证 明HM0539可抑制攻毒小鼠的体质量下降（P<0.05）和空肠的损伤;HM0539可抑制大肠杆菌O157∶H7诱导的空肠杯状细胞的破坏（P<0.05）;此外,HM0539可上调攻毒小鼠空肠中的MUC2、ZO-1蛋白的表达（P<0.05）。结论 HM0539可抑制大肠杆菌O157∶H7黏附和侵袭HT-29细胞,而且增强了小鼠对大肠杆菌O157∶H7感染的抵抗力,其机制可能是通过抑制大肠杆菌O157∶ H7破坏黏蛋白和细胞间紧密连接蛋白。     

Initial research on bioactive of EHEC O157:H7 bacterial ghosts

目的 制备肠出血性大肠埃希菌 O157:H7细菌菌影,在细胞及动物水平对其生物学活性进行初步评价.方法 将包含噬菌体phiX174裂解基因E的重组质粒pLSE转化肠出血性大肠埃希菌O157:H7 EDL933及大肠埃希菌DH5α,42℃诱导制备菌影.利用间接免疫荧光实验观察菌影主要抗原结构,并利用电镜观察菌影对Hep-2细胞的黏附.将菌影免疫小鼠后,采用间接ELISA法检测小鼠特异性抗体,并通过小鼠攻毒实验考察菌影的保护效果.结果 成功构建了重组质粒pLSE,制备出O157:H7及DH5α菌影.O157:H7菌影保留了病原菌的主要外膜抗原,能紧密黏附细胞Hep-2但并不侵入细胞.O157:H7菌影免疫雄性BALB/c小鼠诱导特异性IgG抗体的产生.攻击试验结果显示小鼠对致死剂量O157:H7 EDL933强毒株的保护率达到80%.结论 O157:H7菌影的成功制备及生物学活性的初步析为研制O157:H7菌影疫苗奠定了基础.     

空肠弯曲菌对HeLa细胞粘附的最佳条件和影响因素

作者利用HeLa细胞为模型,研究体外空肠弯曲菌粘附作用的最佳条件和影响因素。结果表明,细菌-细胞相互作用的最佳条件是:细菌在42℃培养24小时;细菌-细胞在37℃共同孵育4小时;细菌悬液的浓度为1×10~9CFU/ml。加热、抗血清抑制试验表明:细菌细胞外膜中某些不耐热的成分在细菌粘附中起重要作用。     

肠出血性大肠杆菌O157:H7的紧密黏附素基因eae的测序及生物信息学分析

目的 克隆编码肠出血型大肠杆菌O157:H7的紧密黏附素eae基因,并对其进行测序及生物信息学分析,为研究EHEC与宿主细胞相互作用奠定基础.方法 利用PCR技术扩增eae基因,经过纯化,将其定向插入克隆载体PMD19-T simple vector并进行测序,应用生物信息学软件分析其生物学特性.结果 用PCR方法扩增eae基因,大小为2802 bp,编码934个氨基酸,用DNAstar5.0软件分析紧密黏附素(Intimin)蛋白的生物活性,在202～210、510～520、716～735个氨基酸残基的肽链上,显示该蛋白具有良好的亲水性,在175～220、300～315、550～610、710～780、825～880个氨基酸残基的肽链上具有良好的柔韧性,在220～300、615～710个氨基酸残基的肽链上,显示该蛋白具有良好的抗原性.结论 本研究用PCR法扩增出了O157:H7的eae基因,成功构建了肠出血性大肠杆菌O157:H7紧密黏附素eae基因的重组质粒,并分析了黏附素蛋白的亲水性、柔韧性、抗原性,为进一步研究大肠杆菌O157:H7黏附素的致病机制奠定了基础,为下一步表达出Intimin蛋白,进一步研究该蛋白与宿主细胞的粘附、免疫原性、抗原抗体反应提供了理论依据.     

致病性大肠杆菌引发宿主细胞A/E损伤分析方法的建立

目的 建立一种能够对由致病性大肠杆菌引发的宿主细胞黏附及擦拭性损伤(A/E损伤)进行半定量分析的方法,为进一步研究其致病性提供评价手段.方法 以大肠杆菌黏附HeLa细胞作为感染模型.采用姬姆萨染色和荧光肌动蛋白染色实验,通过菌落计数及肌动蛋白聚集数量定量分析,统计学处理,比较EPEC 43095、EHEC 0157:H7 Sakai株和弱毒株EHEC 0157:H7 0013015以及E. coli DH5α对HeLa细胞的黏附能力,评价它们对细胞的损伤程度.结果 EPEC对细胞的黏附及擦拭性损伤程度大于EHEC(P<0.05).EHEC Sakai和00B015在黏附能力上差异不大(P>0.05),但是,Sakai在肌动蛋白聚集形成能力方面却明显强于00B015(P<0.05).结论 成功建立了一种能够对EPEC或EHEC所引发的宿主细胞黏附及擦拭性损伤进行半定量分析的方法.     

HMGN2对大肠埃希氏菌黏附Hela细胞的影响

目的探讨HMGN2对大肠埃希氏菌黏附Hela细胞的影响。方法采用Hela细胞模型,光镜以及扫描电镜观察大肠埃希氏菌ATCC25922黏附Hela细胞模型的建立。用以下三组不同方式,观察梯度抑菌浓度下（分别为5、10、15μg／ml）HMGN2对细菌黏附的影响。黏附抑制组：HMGN2、细菌、细胞共同孵育1小时;干扰模型组：细菌、细胞孵育1小时后,PBS洗去未黏附细菌,再加入HMGN2孵育2小时;细菌预处理组：HMGN2、细菌孵育2小时,离心洗去HMGN2,收集细菌,所得细菌再与细胞孵育1小时。用平板菌落计数法观测细胞内、外活茼数,并计算黏附指数以及黏附抑制率。结果光镜及扫描电镜可见细菌黏附于细胞表面,黏附模型构建成功。三组的结果均提示：在HMGN2梯度抑菌浓度下,细菌的黏附指数随着HMGN2的浓度的升高而减小;黏附抑制率则随着其浓度的升高而逐渐增大（P〈0．05）。结论抑菌浓度下的HMGN2：对大肠埃希氏菌ATCC25922黏附Hela细胞有明显的抑制作用;可减低已经黏附于细胞表面的细菌的黏附能力;可能直接作用于细菌,导致其黏附能力降低。     

大肠杆菌O157∶H7异硫氰酸荧光素标记抗体的制备及评价

目的:制备高效价、高纯度、特异性好、荧光强度高及稳定的抗大肠杆菌O157∶H7 异硫氰酸荧光素(FITC)标记抗体,初步探讨其在大肠杆菌荧光免疫检测试验中的应用。方法：复苏培养E.coli O157∶H7标准菌株,甲醛灭活制备疫苗免疫家兔。4次免疫后,颈动脉采血分离血清,经辛酸-饱和硫酸铵法粗提后应用蛋白亲和层析柱HiTrap Protein G HP进行 gG纯化,借助SDS-PAGE电泳、BCA试剂盒法、间接ELISA法分别对蛋白纯度、蛋白含量及抗体效价进行测定。应用不同FITC与蛋白量比值以及不同标记反应条件对多克隆抗体进行标记。比较荧光抗体F485/535,结合差异性显著分析对FITC与蛋白量比值及反应条件进行合
理选择,应用标记抗体与E.coli O157∶H7和金黄色葡萄球菌混合菌液反应验证标记效果。结果：HiTrap Protein G进行E.coli O157∶H7多克隆抗体纯化的最佳纯化方法为35%、100%二梯度洗脱,制备抗体效价为1∶25　600,与沙门氏菌、阴沟肠杆菌等8种肠杆菌无交叉反应,最佳FITC与蛋白量比值为1∶10,最佳标记反应条件为20℃、2 h。由最佳条件制得的荧光抗体与E.coliO157∶H7反应明显 ,强荧光连续照射15 min后仍显示高亮度荧光反应,且不与金黄色葡
萄球菌反应。结论：本实验首次制备出纯度高、荧光强度高、持续时间长的E.coli O157：H7 FITC标记多克隆抗体,为E.coli O157：H7荧光免疫检测方法的建立完成了关键步骤。
     

Twist shRNA对人宫颈癌细胞体外黏附、铺展及迁移能力的影响

目的通过RNA干扰抑制Twist基因在人宫颈癌HeLa细胞中的表达,观察Twist基因沉默对HeLa细胞体外黏附、铺展及迁移能力的影响。方法根据shRNA设计原则,构建两种靶向Twist基因的短发夹RNA（shRNA）干扰质粒,稳定转染HeLa细胞。通过荧光定量PCR及Western印迹法检测HeLa细胞中Twist基因mRNA和蛋白的表达水平,利用黏附实验、铺展实验和划痕实验检测其对细胞黏附力和迁移力的影响。结果成功构建的Twist shRNA真核表达载体稳定转染HeLa细胞后可显著降低Twist基因的表达。与对照组相比,Twist基因沉默组细胞的黏附、铺展及迁移能力明显下降（P〈0.05）。结论成功构建的Twist shRNA真核表达载体,能有效抑制HeLa细胞黏附、铺展及迁移能力。     

分离病鸡3株大肠埃希菌的鉴定及毒力和细胞毒测定

目的分离病鸡中3株大肠埃希菌和鉴定其对小鼠的致病力及对Vero细胞毒性作用.方法将按常规细菌的分离并鉴定的3株大肠埃希菌,接种至昆明系小鼠体内做毒力试验,计算死亡率和LD50(50%致死量).采用微量单层细胞培养法测定细菌上清液的细胞毒性作用.结果分离的3株细菌生物学性状均符合大肠埃希菌.分离的3株细菌对小鼠致病率为100%;菌量达6×1011CFU/L时死亡率为100%;LD50为1.5×1010 CFU/L.分离的3株细菌对2株细胞均无细胞毒性作用.结论分离的3株致病性大肠埃希菌与O157∶H7 株对小鼠致病力相似,可能是潜在的人类的传染源.     

大肠埃希菌O157∶H7分离鉴定及毒素基因多重PCR检测

目的 了解大肠埃希菌O157∶H7(EHEC O157∶H7)在云南战区感染性腹泻患者及猪粪便中检出情况.方法 将标本接种mEC增菌液中增菌,免疫磁珠磁珠富集后,分别接种科玛嘉显O157显色琼脂和山梨醇麦康凯(SMAC)琼脂平板培养,MUG初筛,肠杆菌科细菌生化鉴定编码系列(API-20E)和VITEK32全自动微生物生化分析仪鉴定.应用多重PCR扩增检测志贺毒素1、2(SLT1/SLT2)和侵袭相关基因.小白鼠腹腔注射法测定其毒力.K-B法做抗生素药敏试验.结果 从腹泻患者和猪中均检出EHEC O157∶H7,具有志贺毒素SLT1/SLT2和侵袭相关基因的三个毒素基因.毒力试验使小白鼠发病死亡.药敏试验对14种抗生素敏感.结论 云南战区存在EHEC O157∶H7感染.建立和优化的多重PCR方法,能快速、敏感特异的检测EHEC O157∶H7毒素基因,为重大食源性疾病处理、诊治及流行病学调查提供了强有力的技术手段.     

过氧化氢诱导大鼠主动脉内皮细胞氧化损伤模型的建立

目的采用过氧化氢(H2O2)诱导大鼠主动脉内皮细胞(SVAREC)氧化损伤,建立SVAREC氧化损伤模型。方法体外培养SVAREC细胞,绘制细胞生长曲线,用不同浓度的H2O2刺激细胞,并在不同时间点用MTS法测定细胞存活率,以确定SVAREC氧化损伤模型条件。倒置显微镜下观察细胞形态学变化,微孔酶标法测乳酸脱氢酶(LDH)活力,流式细胞术检测细胞凋亡率,WB检测细胞中半胱氨酸蛋白酶(Caspase-3)的表达情况。结果与空白对照组细胞比较,当H2O2浓度为100μM,作用时间为2 h时,造成细胞损伤,其细胞凋亡率和Caspase-3蛋白表达量明显高于空白对照组。结论该实验条件下H2O2浓度为100μmol/L,作用时间为2 h是模型的最佳复制条件。     

金乡县2005～2008年动物粪便O_(157)∶H7大肠杆菌带菌监测情况分析

目的为进一步摸清O157∶H7大肠杆菌在本地区动物携带情况,于2005～2008年采集金乡县部分农家动物粪便共计1654份。方法用免疫磁珠富集方法捕获O157∶H7,接种于山梨醇—麦康凯培养基,可疑菌落转种科玛嘉大肠杆菌O157∶H7显色培养基之后进行生化和血清学鉴定。结果4年从牛、鸡、猪、羊等动物粪便中共检出O157∶H7大肠杆菌59株,检出率为3.57%,其中牛携带率最高为8.02%,结论提示本地区有肠出血性大肠杆菌O157:H7感染的可能,应加强动物管理和疫情监测,防止疫情扩散蔓延。     

滋阴益气活血解毒中药含药血清对脂肪变性HepG2细胞SREBP-1c和FAS表达的影响

目的 探讨滋阴益气活血解毒中药含药血清对脂肪酸孵育HepG2细胞中固醇调节元件结合蛋白-1c(SREBP-1c)和脂肪酸合成酶(FAS)表达的影响.方法 HepG2细胞分为对照组、模型组、15％含药血清组;对照组和模型组用正常大鼠血清DMEM培养,15％含药血清组用15％含药血清DMEM培养,模型组、15％含药血清组同时加0.5 mmol/L混合脂肪酸(油酸∶棕榈酸=2∶1);油红O染色法检测细胞内脂质沉积,RT-PCR检测HepG2细胞SREBP-1c和FAS mRNA表达,免疫组化检测HepG2细胞SREBP-1c和FAS蛋白表达.结果 15％含药血清能减少模型细胞脂质沉积,降低模型细胞SREBP-1c和FAS的mRNA及蛋白表达,差异具有统计学意义(P＜0.01).结论 滋阴益气活血解毒中药含药血清能够调节SREBP-1c和FAS表达,改善混合脂肪酸诱导的HepG2细胞脂肪性变.     

石花菜提取物对宫颈癌细胞凋亡及Caspase-3活性的影响

目的 探讨石花菜提取物对宫颈癌HeLa细胞凋亡及Caspase-3活性的影响.方法 不同浓度石花菜乙酸乙酯提取物与HeLa细胞孵育后,MTT法检测细胞活性,Hoechst检测细胞凋亡,以及比色法检测细胞内Caspase-3活性.结果 石花菜提取物以时间及剂量依赖性的方式抑制HeLa细胞的生长增殖,降低细胞活性.Hoechst33258染色可见石花菜提取物作用后细胞核出现固缩、边集等凋亡现象.经石花菜提取物孵育,细胞内Caspase-3活性也比对照组显著升高(P<0.05).结论 石花菜乙酸乙酯提取物可抑制宫颈癌HeLa细胞生长增殖,其机制可能是增强Caspase-3活性启动细胞凋亡,从而发挥其抗瘤作用.     

体外呼吸道上皮细胞细菌黏附模型的建立

目的 基于流动小室的构架,建立一种用以研究细菌在呼吸道上皮细胞黏附的体外模型.方法 以2 mg/mL牛胶原蛋白预包被流动小室后,接种1 × 105个HBE细胞,含20％ 血清的RPMI1640培养基,37 ℃,5 ％CO2孵箱培养24 h铺满底部后用于实验;以流动小室中细胞数量为评价指标,正交设计考察流速、流动时长和流动相成分对细胞模型的影响,筛选最优实验条件;以正交实验结果 为条件,细菌黏附量为指标,与常规用于细菌细胞黏附的培养板方法 相比较,分别于2 × 108、108、5 ×107、2.5 × 107CFU/mL接种浓度下与细胞进行黏附实验,判定流动小室是否为细菌细胞黏附研究的可靠模型;以SYTO9荧光标记细菌的方法 表征黏附于细胞的细菌量.结果 优化得到最佳实验条件,影响因素主次为流速＞ 流动时长＞ 流动相组成,方差分析结果 显示,流速和流动时长影响因素有显著差异(P＜ 0.05) ,流动相组成无显著差异(P＞ 0.05) .荧光染色后,该模型可实现细菌在呼吸道上皮细胞上黏附的荧光实时观察;细菌黏附的定量结果 显示,随着感染复数增大,流动小室模型与常规培养板方法均检测出黏附细菌的增多,且呈线性关系;但同一感染复数下常规培养板方法 所检测出的黏附菌量与流动小室模型相比显著增多(P＜ 0.05) .结论 在适宜的流速、流动时长下,该模型可用于研究细菌在呼吸道上皮细胞上黏附,并且较常规培养板方法 具有更贴近体内环境、准确度高、可实时观察等优点.     

免疫磁珠富集-实时荧光PCR检测生畜肉中大肠埃希菌O157∶H7的实验研究

目的 建立免疫磁珠富集(immunomagnetic separation,IMS)-实时荧光PCR(q PCR)技术快速检测肠出血性大肠埃希菌O157∶H7的方法。方法 根据肠出血性大肠埃希菌O157∶H7抗原特异性基因rfb EO157设计引物和Taq Man探针,建立q PCR检测体系;对样品中的O157∶H7大肠埃希菌用出血性大肠O157抗体标记免疫磁珠进行特异性捕获,再利用q PCR技术对磁珠吸附的菌株进行检测。结果 采用IMS-q PCR方法检测,当25 g样本中菌量为100cfu,样品被1∶2稀释时,检测结果呈阳性,检测全过程需时2~3 h。结论 IMS-q PCR检测O157∶H7大肠埃希菌的方法具有灵敏度高、特异性强、快速等优点,可用于大肠埃希菌O157∶H7食物中毒的快速诊断和食品微生物检测,为食源性疾病的分子流行病学调查提供新的检测手段。     

微流控免疫芯片富集/捕获肠出血性大肠杆菌O157∶H7的研究

目的 探讨基于免疫微珠的微流控芯片识别捕获EHEC O157:H7的效率.方法 采用化学共价连接的方法将抗EHEC O157:H7抗体固定于粒径为50 μm的玻璃微珠上,再将微珠填充于PDMS/玻璃复合芯片中,建立由流体控制、免疫反应构成的细菌分选芯片;通过对进样流速、冲洗流速及冲洗时间的优化,在降低芯片对细菌的非特异性吸附的同时,增加芯片的特异性捕获效率.结果 在10μl/min和5 min的最佳冲洗流速和冲洗时间下,该芯片在10 min内可完成对EHEC O157:H7的捕获,捕获效率达到40.00%～63.96%,且实验组与对照组有统计学差异(P<0.01).结论 本研究构建的 EHEC O157:H7识别芯片具有较高的捕获效率.