CD4~+T细胞新亚群——Th9细胞研究新进展

传统意义上的CD4+T细胞在接受外来抗原刺激后经过两类经典途径分化为Th1和Th2细胞,参与体液和细胞免疫应答。除Th1和Th2细胞外,调节性T细胞(Treg)和Th17细胞属于CD4+T细胞,并参与相应的免疫应答反应的结论也     

抗肠出血性大肠杆菌O157:H7 EspA单克隆抗体的制备及其特性鉴定

目的:制备抗肠出血性大肠杆菌O157:H7EspA单克隆抗体(mAb)。方法:以重组EspA蛋白为免疫原免疫BALB/c小鼠,运用杂交瘤技术并且联合间接ELISA筛选只针对EspA的杂交瘤细胞株。以Ig类与亚类鉴定试剂盒鉴定mAb的Ig亚类,ELISA、Western blot及免疫荧光技术鉴定抗体的免疫学特性。结果:获得3株稳定分泌抗EspA杂交瘤细胞的mAb,Ig亚型分别为IgG1κ型、IgG2aκ型、IgG2bκ型。Western blot和免疫荧光分析表明,3株杂交瘤细胞制备的mAb腹水都能特异地结合重组EspA蛋白和识别O157:H7的EspA成分。结论:成功地制备了抗肠出血性大肠杆菌O157:H7EspA的mAb,并证明了该mAb的生物学活性,为深入研究肠出血性大肠杆菌O157:H7的致病机制提供新的手段。     

幽门螺杆菌感染蒙古沙鼠模型胃黏膜菌群多样性研究

目的对幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,Hp)感染蒙古沙鼠模型胃黏膜菌群多样性进行研究,探讨Hp感染与胃内菌群的关系。方法建立Hp感染的蒙古沙鼠模型,空白对照组、阴性对照组、直接感染组和预处理感染组各15例,4周后采集胃黏膜样本,同时检测HP定植率,并提取细菌基因组DNA,采用聚合酶链反应-变性梯度凝胶电泳技术(PCR-DGGE)对黏膜局部菌群进行指纹图谱分析,并对特异性条带进行测序鉴定分析。结果预处理感染组感染率(93.3%)与直接感染组感染率(26.7%)有明显差异(P<0.05);各实验组PCR-DGGE指纹图谱分析显示条带数量,空白对照组(21.6±2.5)、阴性对照组(3.3±1.1)、直接感染组(14.6±2.4)和预处理感染组(7.2±2.2),经统计学分析,各组间均有明显差异(P<0.05),提示蒙古沙鼠各组间菌群多样性存在显著的差异性。结论 Hp感染与胃黏膜菌群结构的变化密切相关。     

抗幽门螺旋杆菌尿素酶B亚单位(UreB)单克隆抗体抗原识别表位的初步鉴定

目的 初步确定抗幽门螺杆菌尿素酶B亚单位(UreB)单克隆抗体(mAb)6E6识别的抗原表位.方法 采用截短法分段构建含UreB抗原的重组质粒,分别命名为U12,U13,U15,U16,U47.用IPTG诱导表达融合蛋白.对表达产物进行SDS-PAGE蛋白电泳及Western blot 分析.结果 6E6能够分别识别1～300位氨基酸的U12片段,1～260位氨基酸的U16片段,1～230位氨基酸的U15片段,而不能识别1～200位氨基酸的U13片段和251～389位氨基酸的U47片段.结论 mAb 6E6抗体识别的抗原表位位于200～230位氨基酸.     

致病性大肠杆菌引发宿主细胞A/E损伤分析方法的建立

目的 建立一种能够对由致病性大肠杆菌引发的宿主细胞黏附及擦拭性损伤(A/E损伤)进行半定量分析的方法,为进一步研究其致病性提供评价手段.方法 以大肠杆菌黏附HeLa细胞作为感染模型.采用姬姆萨染色和荧光肌动蛋白染色实验,通过菌落计数及肌动蛋白聚集数量定量分析,统计学处理,比较EPEC 43095、EHEC 0157:H7 Sakai株和弱毒株EHEC 0157:H7 0013015以及E. coli DH5α对HeLa细胞的黏附能力,评价它们对细胞的损伤程度.结果 EPEC对细胞的黏附及擦拭性损伤程度大于EHEC(P<0.05).EHEC Sakai和00B015在黏附能力上差异不大(P>0.05),但是,Sakai在肌动蛋白聚集形成能力方面却明显强于00B015(P<0.05).结论 成功建立了一种能够对EPEC或EHEC所引发的宿主细胞黏附及擦拭性损伤进行半定量分析的方法.     

EHEC O157与宿主细胞作用的效应分子和易位分子研究进展

EHEC O157是一种重要的人兽共患病病原菌,人感染后可引发急性腹泻、出血性肠炎（HC）,溶血性尿毒综合征（HUS）及血栓性血小板减少性紫癜（TTP）。重度感染可致死,死亡率达10％。     

IL-8和NGAL在儿童早期尿路感染诊断中的价值探讨

目的探讨尿液中白细胞介素-8(IL-8)和中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(NGAL)的水平变化与尿路感染及早期肾脏损伤的关系。方法一共将6周岁以下儿童120例纳入研究,其中确诊为尿路感染的患儿80例作为尿路感染组,包括40例初次确诊和40例治疗后复发的尿路感染患者,40例未发生急慢性尿路感染的健康儿童。采用发光免疫分析仪分别检测入组儿童尿液标本中IL-8和NAGL的浓度,分析两者在不同临床分组中的表达变化,对结果进行统计学分析。结果与对照组比较,NAGL、IL-8在尿路感染组中均显著升高(P0.05),并且初次诊断组的水平明显高于复发组(P0.05);同时,伴有合并症的尿路感染患儿NAGL水平显著高于单纯尿路感染的患儿(P0.05)。结论 IL-8可作为尿路感染的早期诊断候选指标,NAGL可作为尿路感染伴早期肾脏损伤的特征性指标,为快速诊断儿童尿路感染提供实验依据,并用于开发快速、简单、低成本的儿童尿路感染诊断方法和临床监测方法。     

抗志贺毒素ⅡB亚单位单克隆抗体识别表位的初步鉴定

目的 初步确定抗志贺毒素ⅡB亚单位(Stx2B)单克隆抗体(McAb)1H9、1H10、3E5识别的抗原表位.方法 运用DNAstar Protean软件,对Stx2B(1～72 aa)全抗原进行表位预测;采用截短法分段构建重组质粒Stx2B50(23～72 aa),Stx2B54(1～54 aa).用IPTG诱导表达融合蛋白.对表达产物进行SDS-PAGE蛋白电泳及Western blot 分析.结果 1H9、1H10能够识别Stx2B和Stx2B50;3E5能够识别Stx2B、Stx2B50和Stx2B54.结论 McAb 1H9、1H10识别的抗原表位位于55～72 aa,McAb 3E5识别的抗原表位位于23～54 aa.     

抗重组志贺毒素ⅡB亚基单克隆抗体的制备及生物学特性鉴定

目的 制备出高效价的抗重组志贺毒素ⅡB亚基(rStx2B)单克隆抗体.方法 以融合蛋白EspA-Stx2B作为抗原,免疫Balb/c小鼠,以未免疫的Balb/c小鼠脾细胞为饲养细胞;运用细胞杂交瘤技术制备,运用间接ELISA法筛选产生针对rStx2B的单克隆抗体细胞株;体内诱生法产生腹水,饱和硫酸铵沉淀法初步纯化,再采用HiTrap rProtein A柱进一步纯化,快速定性试纸鉴定McAb的Ig亚型,采用间接ELISA法相加实验鉴定抗原识别表位.结果 获得3株产生针对rStx2B的单克隆抗体细胞株Stx2B-1H9、Stx2B-1H10、Stx2B-3E5,Ig亚型分别为IgG1κ型,IgG2aκ型,IgG2bκ型,亲和力常数分别为7.36×108、6.94×108、5.85×108.结论 成功制备3株稳定分泌抗rStx2B的杂交瘤细胞株,产生的McAb特异性好,亲和力高,为应用这些单克隆抗体建立免疫亲和层析法纯化天然志贺毒素Ⅱ,鉴定Stx2B的表位,研究针对EHEC O157:H7感染的治疗性抗体奠定了基础.     

原核融合表达载体的设计、构建及应用

目的利用EspA(肠出血性大肠杆菌O157:H7Ⅲ型分泌蛋白A)作为融合伴体分子,构建一种高效原核融合表达载体。方法在EspA的羧基端设计一Linker,包括柔韧区,肠激酶酶切位点和多克隆位点。PCR分别扩增EspA、Linker基因,利用重叠延伸PCR技术获得二者融合基因,T-A克隆后插入表达载体pET-28a(+),构建高效原核表达载体-pEspA。分别将IL-24、GFP等六种基因克隆入pEspA,转化E.coli BL21(DE3),IPTG诱导融合蛋白表达,SDS-PAGE检测融合蛋白。以EspA单克隆抗体亲和层析柱纯化融合蛋白,融合蛋白经肠激酶酶切后再通过Ni2+亲和层析柱获得外源蛋白。分别利用MTT法和紫外光激发实验鉴定IL-24、GFP生物学活性。结果构建的表达载体pEspA可高效表达外源目的蛋白,使本身不表达或表达量低的目的蛋白获得高效表达。先以EspA单克隆抗体亲和层析一步纯化获得高纯度的融合蛋白,融合蛋白经肠激酶酶切后再以Ni2+亲和层析柱获得了外源蛋白,同时生物学活性实验显示纯化的IL-24、GFP具有较好的生物学活性。结论成功构建了基于EspA的新型高效原核融合表达载体,为蛋白的融合...