外周血干细胞移植前后骨髓微环境细胞粘附分子的临床研究

目的：初步探讨外周血干细胞移植预处理对骨髓造血微环境影响的分子机制。方法：采用流式细胞仪检测了42例患者接受外周血干细胞移植预处理前及移植后30、90、180d骨髓微环境基质细胞表达血管细胞粘附分子(VCAM-1)、纤维连接素(Fn)、层粘素(Ln)和Ⅳ型胶原(ColⅣ)等细胞粘附分子水平的变化。结果：移植前接受单纯化疗方案预处理的患者(简称单化组)骨髓基质细胞表达VCAM-1、Fn、Lm和ColⅣ的水平以移植后90d最低；移植前接受化疗 全身放疗方案预处理的患者(简称化放组)骨髓基质细胞表达VCAM-1、Fn、Lm和ColⅣ的水平以移植后30d最低；至移植后180d，单化组和化放组患者骨髓基质细胞表达VCAM-1、Fn、Lm和ColⅣ等指标仍未恢复到移植预处理前的水平，且放化组骨髓基质细胞表达上述细胞粘附分子水平的恢复过程较单化组缓慢。结论：造血干细胞移植前接受大剂量化／放疗预处理后骨髓基质细胞表达细胞粘附分子的功能障碍可能与移植后某些患者造血功能恢复过程缓慢有关。     

自体骨髓单个核细胞移植促进移植静脉桥血管再内皮化及抑制内膜增生

目的:探讨自体骨髓单个核细胞(bone marrow mononuclear cells,BMMNCs)移植对自体静脉移植后静脉桥血管再内皮化及内膜增生的作用.方法:抽取成年兔骨髓分离制备BMMNCs,并用DAPI进行体外标记.将成年新西兰大白兔23只随机分为细胞移植组(n=13)和对照组(n=10)2组.取左颈外静脉4～5 cm,上下倒置后移植至颈总动脉,在建模后第3天将100 μl DAPI标记的BMMNCs液(6×108个细胞)经耳缘静脉注入细胞移植组动物体内,对照组注入等量的PBS液.细胞移植4周后处死动物,计算机图像分析系统测量并计算静脉移植段血管内皮的完整性及内膜厚度.结果:移植静脉血管内皮有DAPI标记的细胞;细胞移植后,细胞移植组移植血管内皮细胞覆盖程度明显高于对照组(P＜0.05),内膜厚度明显低于对照组(P＜0.05).结论:自体BMMNCs的移植可以促进移植静脉桥血管的再内皮化及抑制内膜的过度增生.     

大鼠骨髓单个核细胞移植治疗心肌梗死

目的:探讨大鼠骨髓单个核细胞(mononuclear bone marrow cells,MBMCs)移植方法对梗死心肌的治疗效果.方法:无菌条件下取成年雄性近交系Wistar大鼠股骨和胫骨,常规抽取骨髓,分离制备MBMCs悬液.将成年雄性近交系Wistar大鼠46只随机分为空白对照组(组Ⅰ,n=10)、梗死对照组(组Ⅱ,n=18)、细胞移植组(组Ⅲ,n=18).用结扎冠状动脉左前降支的方法建立大鼠心肌梗死模型,在建模后2周分别将10μl MBMCs(6×106)悬液和等量磷酸盐缓冲液(PBS)植入组Ⅱ和组Ⅲ的梗死周边区.用心脏超声观察细胞移植后4周的心脏功能改变,用免疫荧光和免疫组化及电镜观察移植细胞在心肌梗死区及梗死周边区的存活、增殖和分化情况.结果:MBMCs移植4周后,移植组超声检查左室功能重建指标如左室射血分数(EF)、左室短轴缩短率(FS)、左室前壁厚度(LVAWT)均较梗死对照组改善明显(P＜0.05);移植组血流动力学检查指标如左室收缩压(LVSP)、左室舒张末压(LVEDP)和左室舒张压力时间变化最大速率(±dp/dtmax)也优于梗死对照组(P＜0.05).MBMCs移植6周后,大鼠心肌梗死区有移植细胞存活、增殖,并分化为有心肌细胞特征的细胞.结论:实验证实用MBMCs移植治疗心肌梗死,可以明显改善梗死后心脏功能.这一效果可能与MBMCs移植相关的心肌再生和新生血管形成有关.     

大鼠自体平滑肌细胞移植对心肌梗死后心功能恢复的作用

目的:研究自体平滑肌细胞移植到心肌梗死区后对心功能恢复的作用.方法:用酶消化法从SD大鼠的输精管中分离、提取自体平滑肌细胞,进行体外培养、扩增.移植组(n=12)将BrdU标记后的自体平滑肌细胞直接注射移植到左冠脉前降支结扎后2周形成的心肌梗死区瘢痕组织中;对照组(n=12)注射同等剂量的DMEM培养液.超声检查评估移植前和移植后4周的心功能状况.用免疫组化染色的方法,检测心肌瘢痕组织中是否有植入的平滑肌细胞存活以及促血管新生的情况.结果:移植的自体平滑肌细胞能在心肌梗死区内存活并形成肌样组织.与对照组比较,移植组左心室舒张末容积(LVEDV)明显减小[(0.78±0.16) vs (0.92±0.15) ml, P<0.01],左心室射血分数(LVEF)显著提高[(47.6±7.2)％ vs (29.3±6.1)％, P<0.01],心肌瘢痕组织血管新生明显[血管密度:(1.9±0.4)/(0.8 mm2) vs (0.4±0.2)/(0.8 mm2), P<0.01].结论:自体平滑肌细胞移植能防止心肌梗死后的心室腔扩大,促进梗死区血管新生,改善心功能.     

含转表皮细胞生长因子基因人表皮细胞复合皮的构建与移植

目的探讨转染表皮细胞生长因子(EGF)基因的人表皮细胞移植后EGF的表达及对细胞增殖的影响。方法将Balb/c小鼠的表皮细胞和转染EGF基因的人表皮细胞按1∶1、1∶3、1∶5的比例混合,种植于脱细胞真皮替代物表面,于体外培养后形成复合皮,将复合皮移植于Balb/c小鼠全层皮肤缺损创面,抗EGF抗体免疫组织化学染色观察移植后EGF的表达,抗增殖性细胞核抗原(PCNA)免疫组织化学染色观察表皮细胞的增殖情况。结果小鼠表皮细胞与转EGF基因的人表皮细胞按1∶5混合构建的复合皮移植后1～2周,抗EGF染色阳性,1周时,新生表皮基底层中PCNA阳性细胞比含单纯小鼠表皮细胞的复合皮移植后显著增多(P<0.01)。结论转染EGF基因的人表皮细胞在移植后早期可表达外源基因产物,并促进表皮细胞增殖。     

人脐带间充质干细胞向心肌细胞诱导分化并体内移植的研究

目的探讨人脐带间充质干细胞(MSCs)经5-氮杂胞苷(5aza)诱导后能否向心肌样细胞分化及诱导后细胞移植到心肌梗死大鼠心脏后能否存活,为心肌细胞的移植探索新的细胞来源。方法从人脐带华尔通氏胶培养出MSCs,检测人脐带来源的MSCs的细胞表面标记。经5aza诱导,采用免疫组化方法及RT-PCR方法检测诱导后细胞能否表达心肌细胞标记物,诱导后细胞经5-溴-2-脱氧尿苷(BrdU)标记后移植到梗死心肌,观察移植后细胞能否存活。结果人脐带间充质干细胞经5aza诱导后能表达心肌细胞标记物,诱导后细胞移植到心肌梗死模型大鼠心肌后细胞能存活。结论人脐带间充质干细胞经5aza诱导能向心肌样细胞分化,诱导后细胞移植至体内能存活,人脐带间充质干细胞可以作为心肌细胞移植的来源。     

外周血干细胞移植患者骨髓基质细胞粘附功能的变化

目的 :探讨骨髓基质细胞在外周血干细胞移植 (PBSCT)预处理前后粘附功能的改变。　方法 :采用细胞粘附试验和细胞粘附阻断试验 ,观察 2 1例PBSCT患者经单用化疗 (单化 )或放疗、化疗 (放、化 )两种预处理方案后不同时相点骨髓基质细胞贴壁层对骨髓单个核细胞粘附能力的影响。　结果 :基质细胞贴壁层对骨髓单个核细胞的粘附能力 ,放、化预处理后第 30、90天显著低于移植前 (P <0 .0 1 ) ;单化预处理后第 30天显著低于移植前 (P <0 .0 5～ 0 .0 1 )。　结论 :PBSCT患者术前预处理后骨髓基质细胞粘附功能均有不同程度的降低 ,单化组的损伤较轻 ,放、化组损伤较重。预处理对骨髓微环境基质细胞粘附功能的损伤可能是影响移植后造血和免疫功能重建的重要因素之一。     

嗅鞘细胞移植促进脑损伤大鼠神经功能恢复及其作用机制研究

目的 观察嗅鞘细胞移植对脑损伤大鼠神经功能恢复及神经元存活的影响并探讨其作用机制.方法 对经培养纯化的嗅鞘细胞作NGFRp75免疫细胞化学染色鉴定并制备移植用细胞悬液,部分细胞预作荧光标记用于移植后观察存活情况;24只SD大鼠平均分成3组:假手术无损伤组(A组),大鼠脑皮质运动区损伤组(B组),相同脑损伤后嗅鞘细胞移植组(C组);术后当天及第3,7,14天分别对各组动物进行神经功能缺损严重程度(NSS)评分;术后第14天取损伤部位组织作神经元核心抗原免疫组化(NeuN)检测并计数阳性细胞数量;数据采用SPSS17.0软件进行统计学分析.结果 (1)培养的嗅鞘细胞呈NGFRp75阳性,阳性率90%;(2)移植14d后核荧光标记的嗅鞘细胞在宿主体内存活良好;(3)术后第14天B组NSS评分为[(2.00±0.53)分],C组为[(1.25±0.46)分],明显优于B组(P<0.05);(4)NeuN阳性细胞计数B组为[(39.2±7.1)分],C组为[(45.8±6.0)分],明显优于B组(P<0.05).结论 嗅鞘细胞移植可明显促进脑损伤大鼠神经功能恢复,其机制可能与嗅鞘细胞促进宿主神经元存活有关.     

骨髓单个核细胞对急性脑缺血小鼠模型的保护作用及机制

目的 探讨骨髓单个核细胞(BMMCs)移植对急性脑缺血小鼠脑组织细胞的凋亡保护作用.方法 从骨髓中分离BMMCs,体外扩大培养后流式细胞术鉴定细胞表面标志物,将鉴定好的BMMCs移植入构建的小鼠脑缺血再灌注模型(MACO)中,通过Tunel染色及Western印迹检测细胞凋亡及凋亡相关分子caspase的变化.免疫组织荧光及Western印迹检测血管内皮细胞修复相关分子eNOS、ICAM-1、CD31的表达情况.结果 BMMCs移植到小鼠脑缺血模型后,BMMCs细胞治疗组细胞凋亡数量(12.8±3.0)明显低于MACO级(78.2±1.4),eNOS、CD31表达增高[(80.0±6.2)比(31.2±1.6);(85 ±3)比(45±5);P＜0.01],ICAM-1表达下降[(34.1±2.2)比(85.2±2.8),P＜0.01].结论 BMMCs可通过调节血管内皮细胞修复相关分子的表达减少缺血后细胞的凋亡.     

平滑肌细胞移植提高大鼠心肌缺血模型心功能的可行性实验研究

目的　初步探讨移植平滑肌细胞对大鼠冠脉结扎心肌缺血模型心功能的提高作用。方法　用酶消化法从 胎鼠胃中分离、提取平滑肌细胞,进行体外培养、扩增。结扎大鼠左冠状动脉前降支,制作心肌缺血模型。细胞移植组 (n=10)将体外培养、BrdU标记的平滑肌细胞,注射移植到冠脉结扎后2周形成的心肌梗死区中;对照组(n=10)用同样的 方法注射等量不含血清的DMEM培养液;两组动物术后均每日皮下注射环胞霉素A抑制免疫排斥反应。超声检查评估移 植前、后大鼠的心功能状况。取大鼠心脏标本做抗BrdU、抗α SMA免疫组化染色,检测心肌梗死区中植入的平滑肌细胞的 存活情况。结果　移植后4周,平滑肌细胞存活于心肌梗死区,并形成肌样组织。与对照组比较,移植组左室前游离壁厚 度明显增加[(2.51±0.22)mmvs(1.32±0.16)mm,P<0.01],左室舒张末容积(LVEDV)明显减小[(1.23±0.12)mlvs(1.92 ±0.18)ml,P<0.01],左室射血分数(LVEF)显著提高[(56.7±6.8)%vs(32.3±2.9)%,P<0.01]。结论　平滑肌细胞移 植后能存活于心肌梗死区,并改善缺血心肌的心功能。     

结核菌素对肝癌和肺癌肿瘤细胞生长和凋亡的调控作用

目的探讨结核菌素对肝癌和肺癌肿瘤细胞生长和凋亡的调控作用。方法制备不同浓度的结核菌上清液(TB-SN),分别与肿瘤细胞株HePG2(肝癌)和A549(肺癌)进行反应。应用特异性荧光探针LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity试剂盒检测肿瘤细胞的生长情况,应用Vybrant凋亡试剂盒检测肿瘤细胞的凋亡情况。结果与5%TB-SN反应5 d后,HePG2和A549细胞凋亡显著增加;与TB-SN反应后,HePG2和A549细胞生长受到抑制。结论结核菌素可以介导肝癌和肺癌肿瘤细胞的凋亡,并抑制肿瘤细胞的生长。     

1,25（OH）2D3对4种细胞碱性磷酸酶活性的影响

观察１，２５（ＯＨ）２Ｄ３对体外培养的人牙乳头细胞，牙髓细胞，牙龈细胞，成骨细胞碱性磷酸酶活性的影响。方法；用组织块培养法和ＡＬＰ测定法。结果：在１，２５（ＯＨ）２Ｄ３ｄ和５ｄ下人牙乳头细胞，人牙髓细胞及人成骨细胞ＡＬＰ活性增加，第７日变化不明显，而人牙龈细胞未见明显变化。     

人成纤维细胞产生的抑制因子对肿瘤和转化细胞增殖与分化的影响

对人成纤维细胞产生的抑制因子(HFDI)的细胞生长抑制效应进行研究,发现HFDI对肿瘤细胞~3H—TdR掺入抑制是由于使细胞变性坏死或促使细胞有限分化所致;并证明HFDI对PHA刺激的淋巴细胞转化的抑制,也是由于使转化细胞变性坏死或促使细胞向成熟方向发展所致。     

多配体蛋白聚糖1对舌鳞状细胞癌CAL27细胞迁移、侵袭和细胞周期的调控作用

研究舌鳞状细胞癌CAL27细胞中过表达多配体蛋白聚糖1（SDC1）对细胞迁移、侵袭、细胞周期和细胞中活性氧（ROS）水平的影响,阐明SDC1在舌鳞状细胞癌发生发展中的潜在作用机制。     

精原干细胞在支持细胞饲养层上的长期培养

目的建立体外研究精原干细胞与支持细胞共培养的细胞模型,研究体外精原干细胞在支持细胞层上的增殖特点。方法应用两步酶消化法,分别从14～15d及6d龄雄性昆明小鼠睾丸中分离支持细胞及精原干细胞,采用免疫细胞化学方法鉴定。将精原干细胞接种在支持细胞层上,观察不同时间点精原干细胞集落形态及数目。结果在支持细胞层上培养24h后,精原干细胞开始增殖分裂,呈双细胞形态;随着培养时间延长,双细胞集落数逐渐减少,而链状细胞集落逐渐增加;培养120h后,链状细胞局部融汇堆积,且细胞集落维持在相对稳定数量。在每4～5d更换培养液的条件下,细胞集落维持稳定状态的平均时间为(51,2±5.8)d。结论精原干细胞在体外支持细胞层上呈集落样生长,并能长时间维持细胞集落形态及数目,可用于体外研究生精细胞增殖分化特征、药物或毒物干扰精原干细胞功能实验。     

慢性肾炎NK细胞活性的研究

目的　研究红细胞对慢性肾炎NK细胞活性的作用。方法　检测了 49例患者和 15例健康人NK细胞活性、红细胞C3b受体花环率 (RCR)、红细胞免疫复合物花环率 (RICR)及血红蛋白 (Hb)的含量。结果　慢性肾炎患者NK细胞活性、RCR水平显著低于正常对照 (P <0 .0 5、P <0 .0 1) ,RICR水平显著高于正常对照 (P <0 .0 1) ;慢性肾炎患者NK细胞活性与RCR、Hb呈正相关 ,与RICR呈负相关。结论　红细胞对慢性肾炎NK细胞活性有明显活化作用 ,作用机制与红细胞胞浆中的NK细胞增强因子及红细胞膜免疫功能有关     

兔子宫内膜干细胞的鉴定

目的:研究兔子宫内膜是否存在干细胞?方法:流式细胞术检测兔子宫内膜中上皮细胞及间质细胞的特异性标记分子,干细胞培养基培养出富含干细胞的集落,运用RT-PCR方法检测分化前后相关分子的表达,MTT法检测集落细胞分化前后增殖能力变化,流式细胞术检测分化前后的相关分子表达变化及细胞的凋亡情况?结果:兔子宫内膜存在上皮细胞及间质细胞两种细胞,干细胞培养基可培养出富含干细胞的集落,且分化前的细胞具有更高的增殖潜能,表现出更多的干细胞源性,具有更低的细胞凋亡比例?结论:兔子宫内膜存在富含干细胞的集落,提示存在子宫内膜干细胞?     

大鼠肝卵圆细胞增殖模型建立及其纯化鉴定

为建立大鼠卵圆细胞增殖模型，分离纯化卵圆细胞并对其特性进行研究，SD大鼠喂饲2-乙酰氨基芴(2-acetyailamif1uorene，2-AAF)，剂量分别为5、10、15、20mg／kg，连续给药6d，于第7天行三分之二部分肝切除，术后继续给药1周，每隔3d取肝组织行常规组织学观察，作细胞增殖试验及免疫组化染色。通过免疫磁珠标记C-kit阳性细胞以纯化卵圆细胞(Magnetic activated cell sorting，MACS)，用免疫细胞化学及RT-PCR对纯化细胞进行鉴定。结果：10、15、20mg／kg三种剂量2-AAF均可成功建立卵圆细胞增殖模型，卵圆细胞增殖于第8天较明显，至第11天达高峰，第14天有所减少。卵圆细胞胞核Brdu染色阳性，其除表达卵圆细胞特异性抗原OV6外，尚表达肝细胞标记白蛋白及胆管细胞标记CKl9。胚胎期肝细胞抗原AFP、连接蛋白43在卵圆细胞中亦有高表达，同时还表达造血干细胞标记C-kit。以MACS纯化的C-kit阳性卵圆细胞，90％以上为OV6阳性，并有AFP、白蛋白、CK19 mRNA转录。结论：2-AAF剂量为10～20mg／kg时可获得满意的大鼠卵圆细胞增殖模型，增生的卵圆细胞为具有双向分化潜能的肝干细胞／前体细胞，利用C-kit标记通过MACS可纯化这种肝干细胞／前体细胞。     

siRNA抑制DJ-1基因表达对肺鳞癌SK-MES-1细胞生物学行为的影响

目的:采用RNA 干扰技术下调DJ-1 基因在肺鳞癌细胞SK-MES-1 中的表达, 探讨DJ-1 表达下调对SKMES-1 细胞生物学行为的影响, 以期探讨DJ-1 基因的功能。方法:构建靶向DJ-1 基因siRNA 慢病毒载体( 重组慢病毒中有绿色荧光蛋白真核表达框), 感染SK-MES-1 细胞(DJ-1 siRNA 组), 并设立慢病毒载体对照组(Control-siRNA 组)及空白对照组。荧光显微镜下观察并计算感染效率, Western 印迹检测各组细胞中DJ-1 蛋白表达水平, MTT法检测细胞增殖能力, 流式细胞术测定细胞周期, Transwell 小室实验检测细胞体外迁移侵袭能力。结果:与Control-siRNA组及空白对照组比较, DJ-1 siRNA 组的DJ-1 蛋白表达受到抑制、细胞增殖能力明显减弱(P<0.01)、G1/G2 期细胞数增多和S 期细胞数减少表明细胞周期受阻、细胞体外迁移和侵袭能力显著减弱(P<0.01)。结论:DJ-1 基因具有促进肺鳞癌细胞SK-MES-1 细胞的增殖和体外迁移侵袭的作用。     

5-氟尿嘧啶对Jurkat和EL-4细胞周期解偶联的影响

目的：研究5-氟尿嘧啶（5-FU）不同剂量和给药后不同时间Jurkat和EL-4细胞周期解偶联的变化规律。方法：采用不同剂量（0、0.001、0.010、0.100和1.000 mg•L^-1）5-FU处理Jurkat和EL-4细胞,给药0、4、8、16、24和48 h后分别收集细胞,应用碘化丙啶（PI）荧光标记及流式细胞术（FCM）检测分析细胞倍体变化的剂量-效应和时间-效应规 律。结果：不同剂量5-FU给药后16 h,Jurkat细胞八倍体细胞百分率在0.001、0.010、0.100和 1.000 mg•L^-1各个剂量组均显著低于0 mg•L^-1组（P<0.01） ,无剂量依赖性;EL-4细胞八倍体细胞百分率在0.010 和 0.100 mg•L^-1组显著高于0 mg•L^-1组（P<0.05）。0.100 mg•L^-15-FU 给药后,Jurkat细胞八倍体细胞百分率在8、16和24 h显著低于相应对照组（P<0.01）,48 h显著高于相应对照组（P<0.01）;EL-4细胞八倍体细胞百分率在4、8和16 h显著高于相应对照组（P<0.05）,48 h显著低于相应对照组（P<0.01）。结论：5-FU可以诱导EL-4细胞发生细胞周期解偶联,而不能诱导Jurkat细胞发生细胞周期解偶联。