人肺腺癌吉非替尼耐药细胞系A549/GR的建立及小白菊内酯逆转耐药机制研究

目的建立人肺腺癌吉非替尼耐药细胞系A549/GR,研究其耐药机制,探讨小白菊内酯(PAR)逆转A549/GR耐药的机制。方法以吉非替尼为诱导剂,人肺腺癌细胞系A549为诱导对象,采用大剂量冲击和逐步增加剂量相结合的方法,诱导建立人肺腺癌吉非替尼耐药细胞系A549/GR。采用细胞毒实验(MTT)法测定细胞耐药指数,免疫印迹法(Western blotting)检测细胞耐药相关蛋白表达水平,进一步通过MTT法检测PAR对A549/GR的逆转倍数,Annexin V-FITC双标法检测PAR的促凋亡作用,Western blotting检测细胞凋亡相关蛋白表达水平。结果所建立的人肺腺癌吉非替尼耐药细胞系A549/GR耐药指数为18.7。A549/GR细胞中MDR和ABCG2耐药相关蛋白表达水平较A549升高。MTT结果显示PAR对耐药细胞A549/GR的逆转倍数为8.66。Annexin V-FITC凋亡检测结果显示PAR能有效促进A549/GR细胞凋亡,Western blotting检测显示PAR能有效降低survivin、Bcl-2两种抑制凋亡相关蛋白的表达。结论成功建立了人肺腺癌吉非替尼耐药细胞系A549/GR;PAR通过促进A549/GR细胞凋亡有效逆转其耐药。     

c-myc RNA干扰增强肺腺癌细胞对吉西他滨的敏感性

目的：探讨c-mycRNA干扰后肺腺癌细胞A549对吉西他滨敏感性的改变。方法：构建c-myc特异RNA小干扰（siRNA）的表达载体,转染A549细胞,G418筛选出稳定表达c-myc特异siRNA的细胞株,荧光实时定量RT-PCR和免疫印迹检测c-myc基因表达水平。吉西他滨作用于干扰有效A549细胞,分为GE＋siRNA组、GE组、siRNA组和空白对照组。每组12例,四甲基偶氮唑蓝法检测吸光度,流式细胞仪测凋亡率。结果：成功构建c-myc-siRNA表达载体。c-myc基因mRNA和蛋白表达下降71.9%和85.6%。吉西他滨作用于c-myc-siRNA细胞其吸光度在各时间点较单用吉西他滨组、单用c-myc-siRNA组以及对照组均下降（P＜0.01）,凋亡率增加（P＜0.01）。结论：c-mycRNA干扰后A549细胞的增殖减慢,对吉西他滨的敏感性增加。     

人肺腺癌亲代与耐顺铂细胞系耐药与凋亡相关基因表达差异及其相关性

目的 探讨人肺腺癌亲代与耐顺铂细胞系A549和A549^DDP耐药及凋亡相关基因表达的差异，以及多药耐药的发病机制。方法 采用逆转录-PCR及免疫细胞化学方法检测A549和A549^DDP细胞多药耐药相关蛋白(MRP)、肺耐药蛋白(LRP)、bcl-2及C-erbB-2的表达水平。结果 逆转录-PCR结果显示：A549细胞表达MRP、bcl-2及C-erbB-2mRNA，无LRP mRNA表达，A549^DDP细胞亦表达MRP、bcl-2及C-erbB-2mRNA，且表达LRP mRNA，耐药细胞MRP及C-erbB-2mRNA表达水平较亲代显增高，bcl-2mRNA表达水平与亲代无显性差异(P=0．731)；A549^DDP细胞血管生成因子及耐药相关基因mRNA表达水平较A549细胞显增高，差异有显性(P=0．007)。免疫细胞化学结果显示：亲代和耐药细胞bcl-2蛋白表达呈强阳性，亲代C-erbB-2及LRP呈阴性，MRP轻度阳性，耐药细胞MRP蛋白呈中度阳性，C-erbB-2及LRP轻度阳性。结论 A549细胞的原发耐药与耐药及凋亡相关基因MRP、C-erbB-2和Bcl-2的异常表达和协同作用有关。A549^DDP细胞MRP和C-erbB-2的表达增强，且表达LRP，可能是继发耐药的产生机制。     

Y-盒结合蛋白1对白血病K562细胞多药耐药基因-1表达的调控

目的:观察多柔比星诱导K562细胞多药耐药基因-1(mdr1)基因表达过程中Y-盒结合蛋白1(YB-1)表达和核易位的变化情况,初步探讨YB-1蛋白对mdr1基因的转录调控。方法:多柔比星间歇性长期作用于K562细胞,剂量逐渐增加。RT-PCR检测mdr1,YB-1基因表达,流式细胞仪检测mdr1基因编码的P糖蛋白(P-gp)表达,蛋白质印迹检测YB-1蛋白核易位。通过RNA干扰技术使K562细胞中YB-1基因表达沉默,多柔比星处理YB-1基因沉默细胞,RT-PCR、流式细胞仪分别检测mdr1 mRNA和P-gp的表达。结果:经多柔比星作用后K562细胞mdr1基因转录上调,P-gp表达增加,同时YB-1基因转录也增强,且出现明显的核易位。YB-1基因沉默后,mdr1基因诱导性表达减少。结论:多柔比星诱导K562细胞mdr1基因表达的过程中,YB-1对于mdr1基因的转录活化起一定的作用。     

人肺腺癌多药耐药细胞系SPC-A1/TAX的耐药机制初探

目的 初步探讨人肺腺癌多药耐药细胞系SPC-A1／TAX的耐药机制。方法 免疫组织化学S-P染色法检测多药耐药基因mdr1的表达产物P-糖蛋白(P-go)。结果 在人肺腺癌多药耐药细胞系SPC-A1／TAX与其亲本细胞系SPC-A1中P-gp的表达均为阴性。结论 该多药耐药细胞系的多药耐药性(MDR)表型可能是非P-gp机制的。     

洛美利嗪逆转K562/A02细胞多药耐药的研究

目的 :研究洛美利嗪对肿瘤多药耐药的逆转作用 ,探讨洛美利嗪逆转肿瘤细胞多药耐药的机制。方法 :以人红白血病细胞系K5 6 2及其耐药细胞系K5 6 2 /A0 2 (耐阿霉素 )为研究对象 ,采用MTT法检测细胞毒作用 ;免疫组化测定法检测P 糖蛋白 (P glycoprotein ,P gp)表达水平 ;RT PCR法检测mdr1mRNA水平 ;以流式细胞术测定两种细胞系内罗丹明 12 3(Rh12 3)的潴留来反映P gp的外排功能。结果 :与K5 6 2细胞系相比 ,K5 6 2 /A0 2耐药细胞系mdr1mRNA及P gp高表达 ,Rh12 3潴留减少。洛美利嗪 (10 μmol/L)对K5 6 2 /A0 2细胞的mdr1mRNA及P gp表达水平无明显影响 (P >0 .0 5 )。洛美利嗪对K5 6 2 /A0 2细胞的阿霉素 (ADM)、长春新碱 (VCR)细胞毒性有剂量相关性增敏作用。洛美利嗪能增加K5 6 2 /A0 2耐药细胞系的Rh12 3潴留。结论 :洛美利嗪对K5 6 2 /A0 2细胞的ADM、VCR细胞毒性有剂量相关性增敏作用 ,其机制可能与增加细胞内药物浓度有关。     

GPC5基因在肺腺癌细胞系中的功能研究

目的 研究GPC5基因在肺腺癌细胞系中的表达情况及其对肺腺癌细胞系生物学行为的影响.方法 采用逆转录PCR (RT-PCR)、实时定量PCR (qRT-PCR)以及Western blot分析肺腺癌细胞系中GPC5基因mRNA及蛋白表达情况;构建GPC5过表达载体及干扰载体,通过转染构建GPC5过表达细胞系及GPC5沉默细胞系;利用CCK-8法分析肺腺癌细胞系生长情况;通过流式细胞术检测肺腺癌细胞系的周期及凋亡变化.结果 检测了GPC5基因在4株肺腺癌细胞系(A549、H1299、H358和H1975)和1株肺正常上皮细胞系(HBE)中的mRNA表达情况,发现与HBE细胞系相比,GPC5基因在A549细胞系中呈低表达,在H1299细胞系中高表达,同时蛋白检测结果与mRNA水平一致;A549细胞中过表达GPC5基因可抑制细胞生长,引起细胞周期阻滞;在H1299细胞中干扰GPC5基因表达促进细胞生长,促进细胞周期;在过表达和干扰细胞模型中均未发现GPC5基因对细胞凋亡的显著影响.结论 GPC5基因可以对肺腺癌细胞系的生物学行为产生影响,可能是肺腺癌的抑癌基因.     

反义T-STAR基因转染降低肺腺癌A549细胞端粒酶活性

目的通过反义技术抑制肺腺癌A549细胞T-STAR (testes-signal transduction and activator of RNA)基因内源性表达,观察对细胞端粒酶活性的影响.方法用阳性脂质体法将T-STAR反义基因转染入A549细胞,用RT-PCR及Western blot方法检测转染细胞内源性T-STAR基因mRNA和蛋白表达水平,并用PCR-ELISA法检测细胞端粒酶活性改变.结果反义基因可在mRNA及蛋白水平有效抑制肺腺癌A549 T-STAR基因的表达,同时明显降低细胞端粒酶活性.结论肺腺癌A549细胞T-STAR基因表达的抑制可能下调端粒酶活性.     

紫杉醇耐药与敏感细胞的差异表达蛋白分析

目的 比较人肺腺癌细胞系A549与肺腺癌紫杉醇耐药细胞系A549-Taxol的差异表达蛋白.方法 提取A549和A549-Taxol总蛋白,应用双向凝胶电泳技术(2-DE)分离,ImageMaster 5.0软件分析并筛选出两者间差异表达的蛋白点,质谱分析加以鉴定.结果 获得分辨率高且重复性好的肺腺癌耐紫杉醇细胞系及亲代细胞系2-DE图谱.ImageMaster软件分析差异大于2倍的蛋白质点共有80个,其中33个在耐药细胞系中上调,47个下调.质谱分析鉴定出19种差异表达蛋白,其中A549-Taxol中上调蛋白11种,涉及细胞骨架蛋白、代谢酶类、分子伴侣和信号转导相关蛋白质.结论 应用2-DE技术整体展示了紫杉醇耐药细胞系及敏感细胞系的蛋白表达谱,质谱法鉴定的差异蛋白为进一步从多因素角度研究紫杉醇耐药机制提供了新线索.     

反应停对人肺腺癌亲代及耐顺铂细胞系碱性成纤维细胞生长因子表达影响

目的 探讨反应停对亲代与耐顺铂人肺腺癌细胞系A549^DDP碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)表达的影响及克服肺腺癌顺铂耐药的作用。方法 采用逆转录-PCR和免疫细胞化学方法分别检测反应停处理前、后A543与A549^DDP细胞bFGF mRNA与蛋白表达水平。结果 治疗浓度(6μg／ml)反应停处理A549与A549^DDP细胞后bFGF mRNA表达水平较处理前显降低，蛋白表达显减弱，蛋白表达与其相应mRNA表达呈显正相关；不同浓度反应停处理后第5 d，A549与A549^DDP细胞bFGF mRNA表达水平存在显性差异，蛋白表达均为阴性。结论 反应停呈剂量依赖性显下调A549与A549^DDP细胞bFGF mRNA表达，可能通过激活细胞凋亡途径而降低耐药。     

The role of c-myc in regulating mdr1 gene expression in tumor cell line KB

Ｔｈｅｃ ｍｙｃｐｒｏｔｏ ｏｎｃｏｇｅｎｅｐｌａｙｓａｒｏｌｅｉｎｍａｎｙｃｅｌｌｕｌａｒｐｒｏｃｅｓｓｅｓ ,ｓｕｃｈａｓｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ,ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎａｎｄａｐｏｐｔｏｓｉｓ Ｉｔｉｓａｎｅａｒｌｙ ｒｅｓｐｏｎｓｅｇｅｎｅｎｅｃｅｓｓａｒｙｆｏｒｃｅｌｌ ｃｙｃｌｅｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ (Ｇ1 Ｓｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ)ａｎｄａｃｔｉｖａｔｅｓｑｕｉｅｓｃｅｎｔｃｅｌｌｓｉｎｔｏｔｈｅｃｅｌｌｃｙｃｌｅ (Ｇ0 Ｇ1ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ) Ｄｏｗｎ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｏｆｃ …     

反义核酸对人肺腺癌细胞多药耐药逆转的实验研究

目的　探讨反义核酸对人肺腺癌细胞多药耐药的逆转效果。方法　以mdr1cDNA -9— 6为靶位点 ,合成反义核酸 (ATCCATCCCGACCTC)并用正义链作为对照 (GAGGTCGGGATGGAT) ,通过脂质体将其导入肺腺癌细胞A5 49/R ,分别采用逆转录聚合酶链反应、流式细胞仪、罗丹明试验及药敏试验观察两组细胞的mdr1mRNA、P糖蛋白 (Pgp)表达、罗丹明的聚集和对阿霉素的敏感性。结果　反义核酸处理的细胞mdr1mRNA下降 5 1 2 % ,正义组细胞和对照组细胞无明显变化、反义组细胞Pgp含量明显降低 ,细胞内罗丹明聚集 ,反义组 ,正义组和对照组的阿霉素IC50 分别为 0 0 0 9μg/ml、0 17μg/ml和 0 18μg/ml。 结论　反义核酸具有逆转人肺腺癌多药耐药的作用 ,其作用水平在mRNA或DNA水平 ,使Pgp的表达受到明显抑制 ,对阿霉素的敏感性明显提高。     

EXPRESSION DIFFERENCES OF VASCULAR GROWTH FACTORS IN HUMAN LUNG ADENOCARCINOMA CELL LINE A549 AND CISPLATIN-RESISTANT HUMAN LUNG ADENOCARCINOMA CELL LINE ADDP549

Objective To elucidate the expression differences of vascular growth factors in human lung adenocarcinoma cell line A549 and cisplatin resistant human lung adenocarcinoma cell line ADDP549.MethodsRT PCR and immunohistochemistry was used to detect the Mrna and protein expressions of vascular endothelial growth factor (VEGF) and basic fibroblast growth factor (Bfgf) in A549 and ADDP549.ResultsVEGF and Bfgf Mrna were expressed in A549 and in ADDP549. VEGF and Bfgf Mrna expression levels in ADDP549 were significant higher than those in A549 (P＜0.025). VEGF and Bfgf protein expressions were all strong positive in A549 and ADDP549.ConclusionThere are certain differences between VEGF and Bfgf expressions in A549 and ADDP549. Drug resistance of lung cancer is associated with those above genes over expressions. Over expression of vascular growth factors are related to drug resistance of lung cancer.     

EXPRESSION DIFFERENCES OF VASCULAR GROWTH FACTORS IN HUMAN LUNG ADENOCARCINOMA CELL LINE A549 AND CISPLATIN-RESISTANT HUMAN LUNG ADENOCARCINOMA CELL LINE A_(549)~(DDP)

Objective To elucidate the expression differences of vascular growth factors in human lungadenocarcinoma cell line A549 and cisplatin-resistant human lung adenocarcinoma cell line A549DDP . Methods RT-PCR and immunohistochemistry was used to detect the mRNA and protein expressions of vascular endothelial growth factor ( VEGF) and basic fibroblast growth factor ( bFGF) in A549 and A549DDP . Results VEGF and bFGF mRNA were expressed in A549 and in A549DDP VEGF and bFGF mRNA expression levels in A549DDP were significant higher than those in A549 (P< 0 .025 ). VEGF and bFGF protein expressions were all strong positive in A549 and A549DDP. Conclusion There are certain differences between VEGF and bFGF expressions in A549 and A549DDP . Drug-resistance of lung cancer is associated with those above genes over-expressions. Over-expression of vascular growth factors are related to drug resistance of lung cancer.     

Establishment of hepatocellular carcinoma multidrug resistant monoclone cell line HepG2/mdr1

Background  The multidrug resistance (MDR) associated with the expression of the mdr1 gene and its product P-glycoprotein is a major factor in the prognosis of hepatocellular carcinoma cell (HCC) patients treated with chemotherapy.  Our study was to establish a stable HCC MDR cell line where a de novo acquisition of multidrug resistance specifically related to overexpression of a transgenic mdr1.
Methods  The 4.5-kb mdr1 cDNA obtained from the plasmid pHaMDR1-1 was cloned into the PCI-neo mammalian expression vector, later was transferred by liposome to human hepatocarcinoma cell line HepG2. Then the transfected HepG2 cells resisting G418 were clustered and cultured and the specific fragment of mdr1 cDNA, mRNA and the P-glycoprotein (Pgp) in these HepG2 cells were detected by PCR, RT-PCR and flow cytometry, respectively.  The accumulation of the daunorubicin was determinated by flow cytometry simultaneously. The nude mice model of grafting tumour was established by injecting subcutaneously HepG2/mdr1 cells in the right axilla. When the tumour diameter reached 5 mm, adriamycin was injected into peritoneal cavity. The size and growth inhibition of tumour were evaluated.
Results  The mdr1 expression vector was constructed successfully and the MDR HCC line HepG2/mdr1 developed.  The PCR analysis showed that the specific fragment of mdr1 cDNA in HepG2/mdr1 cells, but not in the control group HepG2 cells. Furthermore, the content of the specific fragment of mdr1 mRNA and Pgp expression in HepG2/mdr1 cells were (59.7±7.9)% and (12.28±2.09)%, respectively, compared with (16.9±3.2)% and (3.07±1.06)% in HepG2 cells.  In the nude mice HCC model, the tumour genes of both groups were identified. After ADM therapy, the mean size of HepG2 cell tumours was significantly smaller than HepG2/mdr1 cell tumours.
Conclusion  The approach using the transfer of mdr1 cDNA may be applicable to the development of MDR hepatocarcinoma cell line, whose MDR mechanism is known. This would provide the experimental basis of MDR research.

     

逆转录病毒转染法建立兔VX-2多药耐药株

目的：建立VX-2多药耐药(MDR)细胞(VX-2mdrI)。方法：利用逆转录病毒转染法将带有mdrI cDNA全序列的逆转录病毒载体pHaMDR1转入到兔VX-2细胞中，MTT法检测细胞在不同化疗药物作用下的存活率；免疫组化检测细胞的P-糖蛋白(P-gp)表达，RT-PCR检测细胞内mdrI mRNA的表达量．结果：转基因的细胞对吡柔比星、秋水仙素的耐药性分别提高10和25倍，免疫组化见转基因细胞中P-gp表达增加，RT-PCR示细胞内mdrI mRNA的表达量增加。结论：利用逆转录病毒转染法构建了兔VX-2 MDR细胞。     

逆转录病毒转染法建立耐药性大鼠CRBH-7919细胞系

目的:建立高效、稳定的大鼠CRBH-7919多药耐药细胞系.方法:利用逆转录病毒转染法将带有mdr1 cDNA全序列的逆转录病毒载体pHaMDR转入到大鼠CRBH-7919细胞中,MTT法检测细胞系在不同化疗药物作用下的存活率;免疫组化检测细胞的P-糖蛋白(P-GP)表达,RT-PCR检测细胞内mdr1 mRNA的表达量,PCR检测mdr1基因转移到细胞内的基因片段.结果:转基因的细胞系对阿霉素、丝裂霉素的耐药性分别提高 9和7.9倍,免疫组化见转基因细胞系P-GP表达增加,RT-PCR示细胞内mdr1 mRNA的表达量增加,PCR表明转基因细胞内扩增出mdr1片段.结论:利用逆转录病毒转染法成功建立了大鼠CRBH-7919多药耐药细胞系,该细胞系具有耐药强度高、耐药性稳定等特点.     

mdr1单因素耐药白血病细胞株的构建

目的 构建mdrl单因素耐药白血病细胞株,为研究RNA干扰逆转mdr1所致耐药提供细胞模型。方法 将含mdr1 cDNA全长的真核表达载体通过脂质体转染人对化疗药物敏感的K562细胞内,G418筛选获得转基因单克隆细胞．用RT-PCR检测有无mdr1表达、流式细胞技术检测细胞表面P-gp蛋白含量、Rh123泵出实验检测P-gp功能、MTT检测细胞对药物的敏感性。结果 转mdr1基因细胞K562／mdr1能较高水平表达mdr1,明显表现出对化疗药物的耐药性。结论 通过转基因方法构建mdr1单因素耐药细胞株可为RNA干扰逆转mdr1提供更精确的细胞研究模型。