不同迁移能力肝癌细胞中干细胞相关基因Nanog、Sox2和Oct4的表达

目的:观察Nanog、Sox2和Oct4干细胞相关基因在四株不同迁移能力肝癌细胞系中的表达.方法:常规细胞培养无迁移能力的HepG2细胞、低迁移能力的MHCC97-L细胞、中迁移能力的LM3细胞及高迁移能力的MHCC97-H细胞,采用免疫荧光组织化学方法观察四株肝癌细胞系中肝癌干细胞相关基因Nanog、Sox2和Oct4的表达.结果:干细胞相关基因Nanog、Oct4和Sox2在四株迁移能力不同的肝癌细胞系中不同程度表达,且在细胞膜、细胞核、细胞浆中的表达量亦不同;Nanog在细胞核表达,并随着细胞迁移能力增强而呈递增趋势;Sox2在不同迁移能力肿瘤细胞中表达无明显规律,而Oct4在高迁移能力肝癌细胞的细胞浆及核中高表达.结论:Nanog、Sox2和Oct4在不同迁移能力肝癌细胞系中均有表达,但无明显规律,推测肝癌干细胞与肝癌的发生可能有密切关系.     

下调Tim-3对肝癌干细胞自我更新能力及 Wnt信号通路的影响

目的 探讨Tim-3对肝癌干细胞(liver cancer stem cells, LCSCs) 自我更新能力及Wnt信号通路的影响。方法培养人肝癌细胞系HepG2、SMMC7721及正常干细胞系L02,流式细胞仪分选Nanog阳性(+)的肝癌干细胞;实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测Tim-3在3个细胞系中的mRNA表达水平及在肝癌干细胞中的mRNA表达水平;HepG2肝癌干细胞转染Tim-3 siRNA,荧光显微镜和光学显微镜检测转染率,Western blot法检测转染后Tim-3蛋白水平;qRT-PCR检测转染前后Tim-3、Wnt3、β-catenin的mRNA表达水平;细胞克隆形成试验和细胞成球试验检测转染前后HepG2肝癌干细胞的自我更新能力的变化。结果 qRT-PCR检测Tim-3在肝癌细胞系HepG2、SMMC7721中的 mRNA表达显著高于正常肝细胞L02(P＜0.05);Tim-3在HepG2肝癌干细胞的表达明显高于肝癌细胞(P＜0.05);在SMMC7721肝癌干细胞与肝癌细胞比较Tim-3 mRNA表达有低趋势;经荧光镜和光学显微镜观察,Tim-3 siRNA转染细胞良好;Western blot法结果表明,Tim-3蛋白水平在siRNA-451组细胞中的表达显著低于siRNA-750、siRNA-NC、未转染细胞(P＜0.05);转染后HepG2干细胞Tim-3、Wnt3、β-catenin 的mRNA表达水平均显著下降;克隆形成实验和细胞球形成实验显示转染Tim-3 siRNA后,细胞的克隆形成能力和细胞球生长能力均显著降低(P＜0.05)。结论 下调Tim-3表达水平后,可通过抑制Wnt信号通路,最终减弱肝癌干细胞的自我更新能力。     

Wnt10b在肝细胞肝癌中的表达

目的：比较分析 Wnt10b分别在肝细胞肝癌（简称肝癌）及对应癌旁组织中的表达水平,探讨 Wnt10b与肝癌及其临床病理参数的相关性。方法采用实时定量PCR 和 Western blot技术分别检测33例肝癌及其对应癌旁组织中 Wnt10b mRNA及蛋白的表达。结果 Wnt10b mRNA及蛋白在肝癌组织中表达量明显高于对应的癌旁组织（P＜0．05）。结论 Wnt10b在肝癌组织中表达上调,结合 Wnt信号传导途径的功能,提示 Wnt10b异常活化可能参与了肝癌的始动和发展过程。     

miR-125b和血管内皮生长因子A在肝细胞癌中的表达及两者的相关性

目的:探讨miR-125b与血管内皮生长因子A(vascular endothelial growth factor-A,VEGF-A)在肝细胞肝癌(hepatocellular carcinoma,HCC)中的表达情况及与两者的相关性?方法:利用real-time PCR检测肝癌?癌旁组织?肝癌细胞Huh-7?HepG2以及正常肝细胞L02中miR-125b表达,应用real-time PCR和Western blot分别检测肝癌?癌旁组织中VEGF-A mRNA和蛋白表达?转染miR-125b模拟物(mimic)上调肝癌细胞HepG2中miR-125b表达后,real-time PCR和Western blot检测HepG2细胞中VEGF-A mRNA和蛋白表达?结果:miR-125b 在人肝癌组织中的表达较癌旁组织明显降低(P < 0.05);在肝癌细胞Huh-7?HepG2中的表达较L02明显降低(P < 0.05)?VEGF-A mRNA和蛋白在人肝癌组织中的表达较癌旁组织明显升高(P < 0.05)?miR-125b mimic上调HepG2中miR-125b表达后,转染组VEGF-A mRNA和蛋白表达较空白组和阴性对照组均明显下降(P < 0.05)?结论:miR-125b在肝癌中表达明显下调,而VEGF-A表达上调;低表达的miR-125b丧失对VEGF-A表达的抑制作用可能是肝癌发生的重要机制?     

胃癌组织Wnt10b的表达及意义

目的：检测胃癌及癌旁组织中 Wnt10b 的表达,探讨其与临床病理参数的关系。方法收集25例胃癌患者手术切除的癌组织及对应的癌旁组织,用实时荧光定量 PCR检测 Wnt10b mRNA的表达,Western-blot技术检测 Wnt10b蛋白的表达,分析 Wnt10b mRNA在胃癌组织中的表达与临床病理参数的关系。结果胃癌组织中 Wnt10b mRNA和蛋白表达水平明显高于癌旁组织（P〈0.001）,胃癌组织中 Wnt10b mRNA 表达阳性率与肿瘤远处转移相关（P〈0.05）,但与年龄、性别、肿瘤大小、TNM分期、分化程度和浸润深度无关。结论 Wnt10b在胃癌组织中呈活化状态,可能参与胃癌的发生发展。     

KLF6基因在原发性肝癌中的表达

目的 通过研究潜在抑癌基因KLF6在肝细胞癌的表达,探讨KLF6基因作为肝癌抑制基因的可能性.方法 分别用荧光定量PCR、半定量RT-PCR和Western blot方法检测肝细胞癌及癌旁组织中KLF6基因在mRNA及蛋白水平的表达变化.结果 实时荧光定量PCR显示经过看家基因GAPDH标化的KLF6 cDNA 起始浓度,在配对癌旁组织约为肝癌组织的3倍.26例肝癌组织的KLF6 mRNA表达水平与配对癌旁组织相比,差异具有显著性意义(P<0.01).在肝癌细胞株HepG2及Hep3B,KLF6 mRNA的表达亦显著低于正常对照细胞L02(P<0.01).实验还发现,在肝细胞癌中KLF6蛋白表达变化与mRNA表达变化一致,即KLF6蛋白在癌组织及肝癌细胞的表达明显低于癌旁组织及L02(P<0.01).结论 KLF6表达下调可能是肝细胞癌的遗传学改变之一, KLF6基因可能为新的肝癌相关抑癌基因.     

miR-133a在结肠癌组织中的表达

目的探讨miR-133a在结肠癌组织和癌旁正常组织中的表达差异,为研究其在结肠癌中的作用奠定基础。方法采用miRNA芯片分析结肠癌组织和癌旁正常组织中miR-133a的表达水平,并运用实时荧光定量PCR验证其结果。结果 miRNA表达芯片发现miR-133a在结肠癌组织中较癌旁正常组织表达下调,并被实时荧光定量PCR所证实。结论 miR-133a在结肠癌组织中表达下调,提示其可能作为抑癌因子参与结肠癌的发生发展。     

原发性肝癌组织中SOX7mRNA的表达

目的:探讨原发性肝癌(HCC)组织中SOX7 mRNA的表达及意义.方法:应用实时荧光定量PCR检测SOX7 mRNA在7种肝癌细胞系(HepG2、SNU449、SNU182、SMMC-7721、HUH-7、PLC-PRF-5及Hep3B)和40例HCC及其配对癌旁正常肝组织中的表达.结果:肝癌细胞系中SOX7 mRN...     

丝氨酸精氨酸蛋白激酶1在体外促进 HepG2细胞干性的获得

研究丝氨酸精氨酸蛋白激酶1（SRPK1）对肝癌细胞株HepG2肿瘤干性的作用。方法 从GEPIA2数据库获得TCGA中关于肝细胞肝癌(LIHC)的数据,分析SRPK1表达在癌组织及正常样本的差异,以及与患者生存时间、临床分期的关系。采用 TIMER数据库分析 SRPK1表达与肝癌组织中浸润免疫细胞的相关性。构建SRPK1过表达和抑表达的HepG2稳转细胞株,并根据SRPK1表达差异分为SRPK1组及对照的Vector组,shRNA组及对照的Scramble组,Western blot检测4组细胞株SRPK1的蛋白水平。体外成球实验检测肿瘤细胞的成球能力,流式细胞术检测侧群（SP）细胞在细胞群中的比例。实时荧光定量PCR比较细胞肿瘤干性标记物Nanog、Oct4、CD133及Bmi1的 mRNA水平。基因集合富集分析（GSEA）预测SRPK1与Wnt/β-catenin通路的相关程度。结果 SRPK1表达在LIHC患者肿瘤组织中显著高于正常组织（P＜0.05）,在患者各个分期中表达有差异（P＜0.05）,高表达SRPK1患者生存率低于低表达SRPK1患者（P＜0.05）,肝癌组织中SRPK1与B细胞、CD8+T细胞、CD4+T细胞、巨噬细胞、中性粒细胞和树突细胞的浸润水平均相关（P＜0.05）。Western blot结果显示SRPK1组SRPK1蛋白相对表达量高于Vector组（P＜0.01）,shRNA组则低于Scramble组（P＜0.01）。SRPK1组肿瘤细胞成球率（SFE）、SP细胞比例、Nanog、Oct4、CD133及Bmi1的mRNA相对表达量均高于Vector组（P＜0.05）,shRNA组低于Scramble组（P＜0.05）。GSEA结果显示LIHC中SRPK1高表达与Wnt/β catenin通路活化正相关（P＜0.05）。 结论 SRPK1促进HepG2细胞肿瘤干性的获得。     

microRNA沉默SMYD3基因对乳腺癌细胞Wnt/β-Catenin通路及c-Myc基因影响的研究

目的 研究沉默SMYD3基因后,乳腺癌细胞MDA-MB-231中Wnt/β-catenin通路和c-Myc基因的变化,探讨其可能机制.方法 构建携带绿色荧光蛋白基因的SMYD3-microRNA真核表达质粒载体,脂质体法稳定转染MDA-MB-231细胞,实时定量PCR检测SMYD3、Wnt10b、β-catenin、c-Myc mRNA的表达.结果 流式细胞检测转染效率达到95％以上,实验组SMYD3、Wnt10b、c-Myc mRNA水平低于空白对照组(P＜0.05),β-catenin水平高于空白对照组(P＜0.05);阴性对照组与空白对照组相比无明显变化.结论 沉默SMYD3基因可直接或通过Wnt/β-catenin通路下调c-Myc基因的表达,从而减弱肿瘤细胞的生长及侵袭转移能力,为乳腺癌的临床治疗提供了新的基因靶点.     

实时荧光定量PCR检测原发性肝癌中CDK4基因的表达

目的：应用实时荧光定量PCR法检测原发性肝细胞癌中CDK4基因的表达。方法：提取手术切除人肝癌和癌旁组织总RNA并逆转录为cDNA。应用实时荧光定量PCR法观察人肝细胞癌组织及癌旁组织中cDK4的表达水平。结果：20例肝细胞癌标本中有18例肿瘤组织中CDK4基因表达明显高于癌旁肝组织，其中7例高出4倍以上。结论：实时荧光定量PCR可以准确定量测定基因的表达；CDK4基因在肝细胞癌的发生、发展中可能起重要作用。     

实时荧光定量RT-PCR检测肝癌组织中miR-122a及miR-224的表达

目的 运用实时荧光定量RT-PCR方法分析miR-122与miR-224两种miRNAs在原发性肝细胞癌(HCC)中的表达,探讨以miRNAs为靶点在早期肝癌中的临床诊断意义.方法 采用基于2(-△△ACT)的实时荧光定量RT-PCR法对35例肝癌组织及癌旁组织的miR-122a及miR-224进行了定量分析,结果经由Noahernblot验证.结果 与正常组织相比,在所有的被检肝癌组织中,均发现了miR-122a有不同程度的表达下调(P<0.01),而上述肝癌组织中的miR-224的定量结果显示该miRNA表达显著增加(P<0.001).结论 HCC组织中存在上述两种miRNAs表达水平的改变.实时荧光定量RT-PCR法为早期、准确的在临床上检测肝组织癌变提供了新的思路.     

肝癌患者脂肪干细胞重编程为诱导多潜能干细胞

目的重编程肝癌患者来源的脂肪干细胞为诱导多潜能干细胞。方法包装携带Oct4、Sox2、Klf4、c-Myc基因的反转录病毒,将病毒感染脂肪干细胞并培养诱导后的细胞,采用碱性磷酸酶染色、定量PCR和原位免疫荧光实验鉴定诱导的克隆样细胞。结果诱导的克隆样细胞表达碱性磷酸酶,定量PCR证实克隆样细胞表达胚胎干细胞多能性基因,免疫荧光实验证实其表达Oct4和Sox2。结论肝癌患者来源的脂肪干细胞可高效重编程为诱导多潜能干细胞,且脂肪干细胞可作为培养诱导多潜能干细胞的滋养细胞,为提高成体细胞重编程效率和建立基于诱导多潜能干细胞的肝癌模型研究提供了平台。     

重编程肝癌细胞系Huh7为多潜能干细胞样细胞

[摘要] 目的 重编程肝癌细胞系Huh7细胞为多潜能干细胞。方法 包装携带有Oct4、Sox2、Nanog、Lin28基因的慢病毒,将包装好的病毒共感染Huh7细胞,采用碱性磷酸酶染色、免疫荧光、实时定量PCR,免疫组织化学等方法对诱导出的多潜能干细胞样克隆细胞进行鉴定。结果 Huh7细胞被重编程为多潜能干细胞样细胞,碱性磷酸酶染色呈阳性,免疫荧光实验证明其表达多潜能因子,Oct4与TRA-1-60,qPCR实验证明其高水平表达内源性的多潜能相关基因及干细胞特异的microRNAs,体内分化实验结果表明iHuh7可以形成畸胎瘤。结论 通过携带四种多潜能因子的慢病毒介导的重编程, Huh7细胞可以被诱导为多潜能干细胞样细胞。     

Dickkopf-4激活Wnt/PCP通路促进肾透明细胞癌的增殖及侵袭

目的研究Dickkopf-4(DKK4)在肾透明细胞癌(clear cell Renal cell carcinoma,ccRCC)组织中的表达及其与ccRCC生物学行为、临床分期分级和预后之间的的相关性。方法采用RT-PCR、免疫组织化学及W estern印迹法比较42例肾癌和癌旁正常组织中DKK4的表达水平,观察其表达与肿瘤大小、临床分期、分级之间的关系;使用p CMV6-DKK4表达载体转染786-O和A498人肾透明细胞癌细胞,检测、观察转染后的肿瘤细胞的增殖活性、侵袭力及细胞凋亡水平,检测Wnt/β-Catenin(β-Catenin、Cyclin D1)及Wnt/Planar Cell Polarity信号通路(JNK、Rac1)蛋白表达。结果 28例(66.7%)肾癌组织中,DKK4的表达明显高于正常组织,其表达水平与肿瘤病理分级分期和临床特征之间无明显相关(P>0.05);过表达DKK4的肾癌细胞株的增殖活性及侵袭力明显增强;细胞内Wnt经典通路蛋白β-Catenin表达下调而Cyclin D1表达上调;Wnt/PCP通路下游蛋白JNK、Rac1表达上调。结论 W nt/β-Catenin通路抑制剂DKK4通过激活W nt/PCP非经典通路促进肾癌细胞增殖,增强肾癌细胞侵袭力。     

实时荧光定量RT-PCR检测肝细胞肝癌中B-myb的表达及其临床意义

目的 建立B-myb mRNA表达量检测的实时荧光定量聚合酶链反应(RT-PCR)系统,检测肝细胞肝癌(HCC)中B-myb的表达并分析其临床意义.方法 用实时荧光定量聚合酶链反应技术检测70例HCC患者癌组织、癌旁肝组织及18例正常肝组织中B-myb mRNA的表达情况.结果 B-myb mRNA在肝癌组织(0.0375±0.0168)及癌旁肝组织(0.0353±0.0128)中的表达水平明显高于在正常肝组织(0.0265±0.0099)中的表达水平(P＜0.05),而在肝癌组织及癌旁肝组织中的表达水平差异无统计学意义(P＞0.05).B-myb在人肝癌组织中的表达与临床分期、肝外转移及术后复发明显有关,而与门静脉癌栓、肿瘤个数、肿瘤直径、血清AFP水平及分化程度无明显关系.结论 该方法克服了传统PCR只能定性检测而不能定量检测的缺点,为研究B-myb在HCC中的表达提供了定量方法.B-myb可能与肝癌的发生、发展有关.     

HBX在肝癌细胞中通过下调miR-199a增强AKT的表达

目的 探讨乙型肝炎病毒X蛋白(hepatitis B virus X protein,HBX)调节miR-199a的表达在HBV相关性肝癌发生中的分子机制.方法 重组HBX腺病毒(Ad-HBX)感染人肝癌HepG2细胞,HBX的siRNA转染稳定表达HBV基因的人肝癌HepG2.2.15细胞,荧光定量PCR方法检测HBV相关性肝癌组织标本和肝癌细胞中HBX、miR-199a、AKT的mRNA表达水平及运用Western blot检测肝癌组织标本和肝癌细胞中HBX、AKT的蛋白表达水平;分别用miR-199a mimics和miR-199a inhibitor的转染肝癌细胞后,荧光定量PCR方法检测肝癌细胞中AKT的mRNA表达水平及运用Westem blot检测肝癌细胞中AKT的蛋白表达水平.结果 miR-199a在HepG2.2.15细胞中表达水平显著低于HepG2细胞,并且证实其表达下调受到了HBX的调控(P＜0.05),HepG2.2.15细胞中AKT表达水平显著高于HepG2细胞(P＜0.05),在HepG2.2.15细胞中过表达miR-199a能明显下调AKT表达水平以及在HepG2细胞中抑制miR-199a能明显上调的AKT表达水平(P＜0.05),此外,miR-199a的表达量在HBV相关性肝癌组织比相应的癌旁组织表达降低.结论 HBX可以通过miR-199a调节AKT导致HBV相关性肝癌发生.     

实时荧光定量PCR检测原发性肝癌中PRL-2基因的表达

 【目的】建立TaqMan实时荧光定量逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）法检测肝细胞再生磷酸酯酶2（PRL-2）mRNA表达水平，并应用该法检测原发性肝细胞癌中PRL-2基因的表达。【方法】构建含PRL-2基因开放阅读框架的T载体．制作标准曲线。提取手术切除12例人肝癌、门静脉癌栓（PVTT）和癌旁组织总RNA并逆转录为cDNA。应用实时荧光定量PCR法观察人肝细胞癌组织和门静脉癌栓及癌旁组织中PRL-2的表达水平。【结果】线性检测范围达5个数量级，最低检测下限为1×10^2拷贝，最高检测上限为1×10^6拷贝。PRL-2在所有的门脉癌栓及10例肝癌组织表达，仅在4例癌旁组织中表达。门脉癌栓PRL-2mRNA表达水平显著高于肝癌及癌旁组织（P〈0．01），肝癌组织表达显著高于癌旁组织（P〈0．01）。【结论】实时荧光定量PCR可以准确定量测定PRL-2基因的表达：PRL-2基因在门脉癌栓的更高表达提示其在肝细胞癌的发生、转移中可能起重要作用。