人外周血树突状细胞的体外培养及鉴定

目的在体外从人外周血中培养、鉴定树突状细胞。方法取正常健康人新鲜外周血,经密度梯度离心法分离,获得单个核细胞,取贴壁细胞加入重组人粒细胞—巨噬细胞集落刺激因子和重组人白细胞介素-4,体外培养第7天,加入肿瘤坏死因子-α促进其分化成熟。用倒置显微镜观察其形态,用流式细胞仪进行表型测定。结果从正常人外周血分离获得的单个核细胞经rhGM-CSF,rhIL-4和TNF-α联合培养,获得大量树突状细胞。具有典型的树突状细胞形态和免疫表型,高表达HLA-DR,CD83,CD80,CD86、HLA-DR CD83 及CD80 CD86 。结论用rhGM-CSF,rhIL-4和TNF-α联合培养可以从人外周血诱导培养出大量的树突状细胞且高表达HLA-DR,CD80,CD83,CD86、HLA-DR CD83 及CD80 CD86 。     

七氟醚对树突状细胞成熟及成熟树突状细胞活力的影响

目的探讨吸入性麻醉药七氟醚对脐血来源未成熟树突状细胞成熟及成熟树突状细胞(DCs)活力的影响。方法密度梯度离心法分离脐血来源单核细胞,并随机分为3组,即常规培养组(C组)作为对照组、未成熟DC组(I组)和成熟DC组(M组)。C组加入重组人粒细胞—单核细胞集落刺激因子(rhGM-CSF)50 ng/ml和重组人白介素-4(rhIL-4)10 ng/ml共培养12d,然后加入肿瘤坏死因子(TNF-α)50ng/ml,持续培养至第14天。I组、M组分别于第6、13天用含2.5%七氟醚的混合气体处理,余同C组。倒置显微镜及扫描电镜下观察细胞形态,流式细胞技术(FCM)检测细胞表面免疫表型表达(CD80/CD86、CD83/HLA-DR),MTT法检测DC刺激T细胞增殖活力,ELISA法检测上清液中IL-12水平。结果 (1)DCs形态学:C组及M组细胞表面有大量较长突起,面I组细胞表面树突状突起短,分支少。(2)CD80/CD86、CD83/HLA-DR表达率:C组、M组、I组分别为(36.9±2.8)%和(12.9±2.4)%、(39.4±2.1)%和(14.4±3.0)%、(19.6±2.6)%和(7.1±1.4)%,I组与C组比较,差异有统计学意义(P<0.05),而M组与C组比较,差异无统计学意义(P>0.05)。(3)DCs刺激T细胞增殖活力:C组、M组、I组分别为1.44±0.23、1.37±0.10和0.56±0.12,I组与C组比较,差异有统计学意义(P<0.05),而M组与C组比较,差异无统计学意义(P>0.05)。(4)DCs分泌IL-12水平:C组、M组、I组分别为(958±321)pg/ml、(982±408)pg/ml和(377±312)pg/ml,I组与C组比较,差异有统计学意义(P<0.05),而M组与C组比较,差异无统计学意义(P>0.05)。结论七氟醚可抑制脐血来源树突状细胞成熟,但对成熟树突状细胞活力影响不明显。     

人外周血树突状细胞的体外分离、培养和表型鉴定

目的：建立从人外周血分离、纯化、培养树突状细胞的方法，研究细胞因子对树突状细胞体外增殖、分化成熟的影响。方法：取正常人外周血，经淋巴细胞分离液梯度分离，取中间白膜层细胞，通过贴壁处理，获得单个核细胞，加入重组人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（rhGM-CSF）1μg／ml和重组人白细胞介素-4（rhIL-4）410ng／ml，体外培养7d后，加入肿瘤坏死因子α（TNF-α）促进其分化成熟。第8天收获悬浮细胞，用相差显微镜和电镜观察其形态，经树突状细胞（DC）单克隆抗体染色后用流式细胞仪进行表型测定。结果：从正常人外周血分离获得的单个核细胞经rhGM-CSF、rhlL-4和TNF-α联合作用1周左右获得大量高纯度树突状细胞，树突状细胞特征：悬浮生长；具有树突状或裙褶状突起；高表达HLA-DR、CD1a、CD80、CD83、CD86和低表达CD14。结论：用rhGM-CSF、rhIL-4和TNF-α联合作用可以从人外周血诱导培养出大量的树突状细胞，经形态学观察及表型鉴定得以证实。该培养技术为进一步研究树突状细胞肿瘤疫苗的临床应用奠定了物质基础。     

α-干扰素联合GM-CSF体外诱导培养脐血树突状细胞及其功能的测定

目的 探讨重组人α-干扰素(rhIFN-α)联合重组人粒-巨噬细胞集落刺激因子(rhGM-CSF)体外诱导培养脐血树突状细胞(DCs)的实验方法。方法 人脐血贴壁单个核细胞加入rhIFN-α及rhGM-CSF诱导培养,镜下观察培养细胞形态;流式细胞术检测培养细胞CD83、CD86的表达;MTT法检测诱导培养的DCs体外刺激同种异体T淋巴细胞增殖的活性。结果 人脐血贴壁单个核细胞经rhIFN-α联合rhGM-CSF共同培养后,第7d镜下可见有表面呈树状突起的DCs;细胞免疫表型检测结果示培养细胞有成熟DCs特异性标记CD83及共刺激分子CD86表达;rhIFN-α为600U／ml、rhGM-CSF为2000U／ml时为脐血DCs诱导培养的合适浓度(培养细胞CD83^ CD86^ 细胞比率最高);以诱导培养7d的脐血细胞(含DCs)作为刺激细胞与同种异体T淋巴细胞(反应细胞)以不同比例混合培养时,DCs均可刺激其增殖,其中以反应细胞：刺激细胞为20：1时最明显。结论 rhIFN-α联合rhGM-CSF细胞因子体外诱导人脐血贴壁单个核细胞,可生成具有典型形态及功能的成熟DCs。     

HBV无症状携带者树突状细胞的分化及功能研究

目的 研究HBV无症状携带者树突状细胞的分化及功能.方法 抽取健康对照者(A组)、HBV无症状携带者(B组)外周静脉血,经密度梯度离心法分离获得PBMC,用TNF-α、IL-10分别和rhIL-4、rhGM-CSF刺激培养,获得:成熟树突状细胞(mDC)、不成熟树突状细胞(imDC).rhIL-4、rhGM-CSF刺激培养获得树突状细胞(DC)作组内对照.imDC组加入TNF-α刺激,检验imDC的稳定性.流式细胞仪检测各组反映树突状细胞成熟度的各种分子.结果 A、B组内mDC细胞膜表达HLA-DR,HLA-ABC分子,分泌的IL-12p70与imDC、DC、imDC+TNF-α组相比明显增加;A、B组间mDC的HLA-DR,HLA-ABC表达无显著性差异,IL-12p70分泌差异有统计学意义(P<0.01).imDC的HLA-ABC、HLA-DR低表达,IL-12p70分泌也较低,与本组内DC比较结果差异有统计学意义(P<0.01);A、B组间imDC的HLA-DR,HLA-ABC低表达,IL-12p70分泌差异无统计学意义.imDC加入TNF-α后HLA-ABC、HLA-DR仍低表达,IL-12p70分泌低于本组内DC,结果差异有统计学意义(P<0.01);A、B组间结果无显著性差异.结论 在A、B组,TNF-α均有效促进DC成熟为mDC,IL-10均抑制DC的成熟,不受A、B组细胞来源影响.mDC分泌大量IL-12p70,并在B组低于A组,说明B组mDC存在一定的功能不足.     

脐血CD34+细胞体外诱导分化为树突状细胞及其扩增

目的探索脐血CD34 细胞体外诱导分化为树突状细胞及其扩增、培养大量树突状细胞(DCs)的方法。方法Ficoll分离脐血单个核细胞,免疫微磁珠法分离纯化CD34 细胞,以rhIL-4、GM-CSF、rhSCF、rhFlt-3Ligand、TGF-β1及TNF-α体外诱导培养14d,进行形态学观察、表型检测及上清液IL-12测定。结果体外培养14d后,细胞呈现典型的成熟DCs形态学及表型特征:胞体表面粗糙,可见大量突起,高水平表达CD1a、CD11c、CD40、CD80、CD83、CD86和MHCⅡ类分子;同时,IL-12浓度随着培养时间的增加而升高,且在加入TNF-α刺激成熟后,IL-12浓度较未成熟时显著升高(P<0.05)。结论体外联合运用rhIL-4、GM-CSF、rhSCF、rhFlt-3Ligand、TGF-β1、TNF-α,能够成功诱导脐血CD34 细胞分化为大量活力好的DCs。     

脐血CD34+细胞体外诱导分化为树突状细胞及其扩增

目的 探索脐血CD34+细胞体外诱导分化为树突状细胞及其扩增、培养大量树突状细胞(DCs)的方法.方法 Ficoll分离脐血单个核细胞,免疫微磁珠法分离纯化CD34+细胞,以rhIL-4、GM-CSF、rhSCF、rhFlt-3 Ligand、TGF-β1及TNF-α体外诱导培养14 d,进行形态学观察、表型检测及上清液IL-12测定.结果 体外培养14 d后,细胞呈现典型的成熟DCs形态学及表型特征:胞体表面粗糙,可见大量突起,高水平表达CD1a、CD11c、CD40、CD80、CD83、CD86和MHCⅡ类分子;同时,IL-12浓度随着培养时间的增加而升高,且在加入TNF-α刺激成熟后,IL-12浓度较未成熟时显著升高(P＜0.05).结论 体外联合运用rhIL-4、GM-CSF、rhSCF、rhFlt-3Ligand、TGF-β1、TNF-α, 能够成功诱导脐血CD34+细胞分化为大量活力好的DCs.     

儿童B系急性淋巴细胞白血病树突状细胞的生物学特性

目的 体外诱导培养正常儿童与B系急性淋巴细胞白血病(B-ALL)儿童的树突状细胞(DC),比较二者的生物学特性.方法 分离10例B-ALL初诊患儿(ALL组)和10例正常儿童(对照组)的外周血单个核细胞,以rhGM-CSF(20 ng/mL)、rhIL-4(10 ng/mL)及TNF-α(10 ng/mL)联合培养8 d,显微镜下观察细胞形态,流式细胞仪检测细胞免疫表型(CD11c、CD80、CD83、CD86),ELISA检测培养上清中IL-12的浓度,混合淋巴细胞反应(MLR)检测抗原递呈功能,电化学法检测上清中葡萄糖浓度.结果 ALL组细胞未表现出DC的典型形态,CD11c、CD80、CD83、CD86表达均较对照组细胞低(P< 0.05),分泌IL-12的能力弱于对照组细胞(P<0.05),刺激T淋巴细胞增殖的能力弱于对照组细胞,ALL组细胞培养上清中的葡萄糖浓度高于对照组(P<0.05).结论 B-ALL来源的DC成熟度异常,功能减弱,葡萄糖代谢异常可能是其成熟异常的原因之一.     

二十二碳六烯酸对人外周血树突状细胞成熟的影响

目的探讨二十二碳六烯酸(DHA)在体外对人外周血来源树突状细胞(DCs)成熟状态及免疫学功能的影响。方法经淋巴细胞分离液(Ficoll)密度梯度离心法分离出单个核细胞,用含rhGM-CSF和rhIL-4培养液诱导5d,获得未成熟DCs,并分为4组:未成熟组、成熟组、DHA组和饱和脂肪酸(SA)组。经DHA孵育24h,内毒素脂多糖(LPS)作用48h,于第8天,Wright-Giemsa染色观察各组DCs形态;流式细胞仪检测表型,逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测DCs共刺激分子CD80、CD86及HLA-DR mRNA的表达;ELISA检测各组细胞上清液中IL-12及TNF-α的含量。结果 DHA组细胞上清液IL-12和TNF-α的含量比成熟组低(P<0.01),而SA组与成熟组比较差异无统计学意义(P>0.05)。DHA干预下平均荧光强度呈明显下调。成熟组CD80、CD86及HLA-DR mRNA相对表达量比未成熟组高(P<0.01);DHA组比成熟组低(P<0.01);而SA组与成熟组相比无差异(P>0.05)。结论 DHA可下调DCs共刺激分子CD80、CD86及HLA-DR的表达,降低IL-12及TNF-α的释放,减弱DCs的抗原提呈能力,且可抑制DCs体外成熟。     

树突状细胞的体外培养及鉴定

目的:建立树突状细胞(dendritic cells,DCs)体外培养的方法.方法:从正常人外周血分离获得单核细胞,加入rhGM-CSF1000U/ml、rhIL-4500U/ml体外培养.取培养7天的细胞,采用免疫细胞化学方法和流式细胞仪测定细胞表型,并对其进行鉴定.结果:免疫细胞化学方法显示,90%以上培养7天的细胞表达DCs特异性标志CD1a,而单核细胞特异性标志CD14表达小于5%;FACS分析显示,培养7天的细胞高表达HLA-A、B、C,HLA-DR和协同刺激分子CD40、B7-1.表明加入细胞因子体外培养后,由单核细胞生成了DCs.结论:通过该方法对人外周血单核细胞进行体外扩增,能够得到成熟的DC.     

人外周血来源的成熟树突状细胞的体外无血清培养

目的探讨无血清条件下健康人外周血单个核细胞（PBMC）快速诱导生成成熟树突状细胞（dendritic cell,DC）的体外培养方法。方法分离获取健康者外周血PBMC,将细胞分为血清组和无血清组：设血清组A组为对照组,B、C、D组为无血清组。A组加入10%FCS的RPMI1640完全培养液,B组加入单核/巨噬细胞无血清培养液MΦ-SFM,两组均加入rhGM-CSF＋IL-4＋rhTNF-α培养9d;C组加入钙离子载体（CI）A23187,D组加入rhGM-CSF＋A23187,两组细胞均培养于MΦ-SFM中48h。于倒置显微镜下观察细胞形态,流式细胞术分析细胞表型,MTT比色法检测各组细胞刺激同种异体T淋巴细胞增殖的能力。结果在无血清条件下,单独给予A23187或A23187＋rhGM-CSF联合刺激48h,均可诱导PBMC分化成具有典型形态的DC;与血清组细胞相比,细胞表面标志CD80、CD86和CD83分子具有相似的高表达（P〉0.05）,对同种异体T淋巴细胞的刺激能力无显著性差异（P〉0.05）。结论在无血清培养条件下配合使用钙离子载体A23187,可以更快速、有效地诱导健康人PBMC分化成更成熟、功能更强的DC。     

慢性髓系白血病来源的树突状细胞生物学特性的研究

目的:体外诱导慢性髓系白血病(CML)原代细胞分化生成树突状细胞(Dendritic cells DCs),并研究其生物学特性和功能.方法: 分离初诊13例CML患者的骨髓单个核细胞和5例正常人外周血的单个核细胞,用rhGM -CSF 1 000 U/ml、rhIL-4 500 U/ml和TNF-α50 U/ml联合培养10 d;形态学(Wright染色、倒置显微镜、透射电镜),免疫学(CD80、CD86、CD83、CD 1a、HLA-DR)鉴定,荧光原位杂交(FISH)进行细胞遗传学分析,ELISA检测分泌IL- 12的能力和混合淋巴细胞反应(MLR)检测抗原递呈功能.结果:慢性白血病细胞体外诱导后,大部分细胞呈现树突状细胞的典型形态,而且有免疫标记的明显上调(CD 86 24.49±25.87 vs 61.73±28.54;CD1a 10.41±9.52 vs 47.26±3 5.60,P<0.05);FISH证实这类DC还携带有白血病克隆,并且具有分泌IL-12和刺激T淋巴细胞增殖的能力.结论:在体外可成功地将CML细胞诱导分化成树突状细胞 ,这类DC与正常DC无论在形态学和免疫学表达方面均相似,但是功能较弱.     

钙离子载体联合GM．CSF体外诱导外周血单核细胞生成树突状细胞

目的：利用新型诱导剂钙离子载体A23187联合重组人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（rhGM-CSF）体外诱导人外周血单核细胞（PBMC）生成树突状细胞（DCs）。方法：采用密度梯度离心法及黏附法分离出PBMC,按不同培养方法分成：传统方法组,rhGM-CSF＋重组人白介素-4（rhIL-4）＋重组人肿瘤坏死因子-α（rhTNF-α）;新型诱导剂组,加入rhGM—CSF4＋A23187。光镜观察细胞形态的变化,流式细胞仪检测DC细胞的表面标志,MTT比色法检测各组DCs刺激同种异体外周血T细胞增殖的能力。结果：与传统方法相比,A23187联合rhGM—CSF诱导培养的DCs更具有典型的树突形态;DC表面分子CD83D1a、CD86、CIM0表达（45．2％、31．5％、40．1％、36．4％）较传统方法组（16．9％、20．4％、26．5％、22．3％）明显上调（P〈0．05）,而CD14表达（5．7％vs19．0％）明显下降（P〈0．05）,刺激同种异体T细胞增殖的能力更强。结论：新型诱导剂钙离子载体A23187联合GM-CSF能更有效地诱导PBMC生成强效成熟的DCs。     

HER2阳性乳腺癌细胞株上清液对树突状细胞表型及功能的影响

目的探讨人HER2阳性乳腺癌细胞对树突状细胞表型及功能的影响。方法分离培养外周血单个核细胞来源的树突状细胞。培养的第5天,实验组HER2’MCF-7细胞的培养上清液孵育24小时,以不加上清液的树突状细胞作为对照组,流式细胞术检测树突状细胞表面标志CDS0、CD86、CD40、CD83和HLA—DR的表达水平,ELISA法检测树突状细胞细胞因子IL-12、TNF—α、IL-6和IL-10的分泌水平。用改良的MTT比色法检测上清液处理的树突状细胞刺激同种异体T细胞增殖的能力和ELISA法检测树突状细胞刺激T细胞分泌细胞因子的能力。结果树突状细胞与HER2’MCF-7细胞的上清液共培养后,树突状细胞表面分子CD80、CD83、CD86及CD40均表达升高,同时伴随着IL-12、TNF-α、IL-6的分泌增加。与对照组相比较,上清液处理的树突状细胞对激活同种异体T细胞增殖和分泌细胞因子的能力明显增强（P〈0．01）。结论HER2’MCF-7细胞能改善树突状细胞的抗原递呈功能和刺激T细胞活化增殖的能力,提示HER2’MCF-7细胞对树突状细胞是免疫刺激作用,对于HER2’的乳腺癌可采用基于树突状细胞疫苗的免疫治疗。     

人外周血树突状细胞体外诱导培养及表型鉴定

目的从健康人外周血中分离单个核细胞（peripheral blood mononuclearcell,PBMC）,经体外诱导培养获取成熟树突状细胞（dendritic cell,DC）.方法取健康人新鲜外周血,经密度梯度离心法分离,获得单个核细胞,在含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基中培养.置37℃、5%CO2培养箱内静置培养2 h后除去悬浮细胞.培养液中加入rhGM-CSF和rhIL-4继续培养贴壁细胞5 d,然后加入TNF-α促进其分化成熟.倒置显微镜下观察DC形态,流式细胞仪（flowcytometer,FCM）对其进行表型鉴定.结果显微镜下观察DC细胞形态不规则,表面有大量的毛刺状突起;成熟DC细胞表面CD83、CD80分子表达明显增高.结论用rhGM-CSF、rhIL-4和TNF-α联合培养可以从健康人外周血诱导培养出成熟的树突状细胞.     

低剂量照射对树突状细胞表型及功能的影响

目的研究低剂量照射对未成熟树突状细胞（DCs）大肠癌抗原吞噬能力、未成熟DC表型及体外刺激T细胞能力的影响。方法取健康人外周血,密度梯度离心获取单个核细胞。铺板贴壁法分离淋巴细胞,贴壁细胞在重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子（rhGM-CSF）和白细胞介素4（rhIL-4）的作用下体外诱导5d后收获,并分别以0.1、0.2、0.5和1.0Gy的X射线照射24h。检测照射后未成熟DCs的表型、抗原吞噬能力及负载大肠癌肿瘤抗原信息的DCs在体外刺激T细胞的能力。结果流式细胞仪检测结果显示,0.2Gy照射组成熟DCs的CD40、CD80、CD83、CD86表型及抗原吞噬能力均明显高于对照组（未照射）及其他照射组（均P〈0.05）;体外刺激T细胞的能力随照射剂量的增加而减弱。结论低剂量照射能促进DCs抗原的吞噬能力和成熟,但会减弱体外刺激T细胞的能力。     

表面抗原调节慢性乙肝患者树突状细胞免疫功能的研究

目的研究表面抗原（HBsAg）对慢性乙型肝炎（CHB）患者外周血树突状细胞（DC）免疫功能的调节作用。方法采用体外细胞培养的方法培养30例CHB患者外周血DC,分为HBsAg组和无HBsAg组,培养7d后用流式细胞术检测各组DC的CD83及CD86的表达,MTT法检测DC对混合淋巴细胞的刺激作用,ELISA方法检测培养上清中IL-12及IL-6的含量。结果 HBsAg组CD83、CD86的表达量分别为（19±4）%和（49±9）%,无HBsAg组则分别为（12±4）%和（18±6）%（P均〈0.01）。HBsAg组和无HBsAg组的DC对混合淋巴细胞的刺激指数分别为（20±10）%和（7±4）%（P〈0.01）。HBsAg组的DC培养上清中IL-12、IL-6的含量分别为（111±68）ng/ml和（646±426）ng/ml,无HBsAg组分别为（38±12）ng/ml和（1843±235）ng/ml,差异均有统计学意义（P均〈0.01）。结论 HBsAg可增强CHB患者外周血DC提呈抗原、激活T淋巴细胞的功能,对DC分泌细胞因子的功能有调节作用。