寻常型天疱疮抗原细胞外区1～2表位抗体亚型的致病性

目的探讨不同寻常性天疱疮(PV)抗体亚型在PV中的作用。方法分别用完全弗氏佐剂(CFA)、铝[Al(OH)3]佐剂联合重组寻常型天疱疮抗原(PVA)细胞外区1～2融和蛋白免疫C57BL/6小鼠。免疫后对其细胞因子的类别、特异性抗体滴度和抗体亚型进行检测;并通过诱导新生鼠的动物模型评价其致病性。结果免疫后经细胞因子检测显示CFA组小鼠产生较多的Th1型细胞因子γ-干扰素(IFNγ),Al(OH)3组则以Th2型细胞因子白介素-4(IL-4)为主;抗体亚型的型别在CFA组中以IgG2a为主,而Al(OH)3组以IgG1为主。新生鼠被动转移实验显示,转移Al(OH)3组小鼠的抗血清可使被转移鼠皮肤出现糜烂,组织病理、免疫荧光均符合PV的表现,而CFA组小鼠的抗血清不能出现上述表现。结论相同PVA在不同免疫佐剂作用下可诱导产生不同抗体亚型;不同亚型的抗PVA抗体其致病性不同。     

人皮肤组织桥粒芯糖蛋白4片段的克隆和在寻常型天疱疮中免疫识别的初步研究

目的 扩增人皮肤组织桥粒芯糖蛋白4(desmoglein 4,Dsg4)胞外区域EC1、EC2、EC3和EC4的核酸序列,为寻常型天疱疮(pemphigus vulgaris, PV)发病机制的研究提供依据.方法 根据GenBank中的Dsg4序列(登录号为AY177664)分析,通过逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)法从人正常皮肤组织中抽提RNA,逆转录合成cDNA,聚合酶链反应(PCR)扩增皮肤组织桥粒芯糖蛋白4胞外区域EC1、EC2、EC3和EC4目的基因;应用基因重组技术将目的基因分别与质粒pET32a在T4 DNA连接酶作用下相连接,转化E.coli DH5α感受态细菌,用含氨苄青霉素的LB培养基平板筛选转化菌,阳性重组子DNA序列测定鉴定;重组融合蛋白经ELISA法与PV患者、正常对照组血清进行反应.结果 RT-PCR扩增产物经凝胶电泳得到均约为350 bp的4条条带;质粒载体pET32a连接的目的基因经序列测定后与在GenBank登录的Dsg4胞外区域EC1、EC2、EC3和EC4核酸序列完全一致,4个Dsg4胞外区域cDNA读码框架正确;Dsg4 EC1、EC2、EC3和EC4与患者血清反应,而不与正常对照组血清反应.结论 Dsg4胞外区域多肽片断在PV发病中可能有作用.     

副肿瘤性天疱疮患者的脱发机制

目的探讨副肿瘤性天疱疮(PNP)患者血清中抗桥粒芯蛋白(DSG)抗体与头皮脱发之间的关系.方法收集我科收治的2例PNP,2例大疱性类天疱疮患者和5例正常人血清,及2例正常人头皮组织.采用酶联免疫吸附(ELISA)方法检测PNP患者血清中DSG 1和3抗体水平,间接免疫荧光法检测PNP患者血清与正常人头皮毛囊结合情况,同时采用正常人血清和大疱性类天疱疮患者血清作对照.结果2例PNP患者中,有1例抗DSG 3抗体强阳性,抗DSG1抗体弱阳性;另1例患者两种抗体均为阴性.2例患者血清均可与正常人头皮毛囊结合,表皮细胞间和毛囊的外毛跟鞘均可见荧光信号.大疱性类天疱疮患者血清只能与表皮基底膜带结合,正常人血清在基底膜带、表皮细胞间和毛囊均无任何荧光信号.结论PNP患者出现脱发可能与患者血清中抗DSG3抗体水平有关.     

Effects of chimeric molecule of recombinant Dsg3EC1-2 with toxin PE40 on T and B lymphocytes in Pemphigus Vulgaris

Objective:To observe the effects of the recombinant chimeric toxin Dsg3EC1-2PE40 on T and B lymphocytes isolated from Pemphigus Vulgaris (PV) patients to further study its biological therapeutic function for PV. Methods :Recombinant chimeric toxin Dsg3EC1-2PE40 was first identified, expressed and purified, and then its effects on T and B lymphocytes of PV patients in vitro were detected and quantified by ELISPOT assay and MTT assay. Results :The purity of the expressed protein Dsg3EC1-2PE40 was up to 80%. In ELISPOT assay, with Dsg3EC1-2PE40, the overall number of B cells that produce anti-Dsg3 antibodies among PV patients was only about 60% of the comparable number with Dsg3EC1-2. The proliferation of T cells of PV patients was inhibited markedly by Dsg3EC1-2PE40. There was significant difference between the different groups with Dsg3EC1-2PE40 and Dsg3EC1-2. Conclusion:The recombinant chimeric toxin Dsg3EC1-2PE40 decrease the number of B cells that produce anti-Dsg3 antibodies in PV patients and can inhibit or kill T cells of PV patients in vitro.     

从牛舌中提取寻常型天疱疮抗原的方法及其应用

目的：探讨从牛舌黏膜上皮中提取寻常型天疱疮抗原的可行性及其在天疱疮研究中的意义。方法：应用8mol/L尿素浸泡法制备牛舌黏膜上皮提取物,免疫印迹分析寻常型天疱疮患者血清中天疱疮抗体结合的靶抗原。结果：13例寻常型天疱疮全部检出IgG型和IgA型天疱疮抗体,它们分别识别牛舌黏膜上皮提取物中260ku,230ku,210ku,190ku,165ku,160ku,135ku,115ku,97ku,85ku,65ku和62ku多肽中一种或几种抗原。结论：从牛舌中提取寻常型天疱疮抗原的方法可行,适合于天疱疮抗体的免疫印迹检测。     

Paraneoplastic pemphigus with autoantibody deposition in bronchial epithelium after autologous bone marrow transplantation.

Paraneoplastic pemphigus is a newly described syndrome in which patients have a severe mucocutaneous eruption with clinical features reminiscent of both erythema multiforme major (Stevens-Johnson syndrome) and pemphigus vulgaris, in association with non-Hodgkin's lymphomas and other malignant neoplasms. These patients have autoantibodies that bind to a characteristic set of epidermal proteins: desmoplakin I and desmoplakin II (molecular weight equals 250 kd and 210 kd, respectively), both major cytoskeletal structural proteins associated with desmosome cellular junctions within all epithelia, the bullous pemphigoid antigen, a 230 kd protein associated with hemidesmosomes, and a 190,000-d protein that has not been characterized. In this report, we describe a patient with paraneoplastic pemphigus who had (1) non-Hodgkin's lymphoma in apparent complete remission following autologous bone marrow transplantation, (2) very tense blisters reminiscent of bullous pemphigoid, (3) a unique pattern of immune deposits within the skin, and (4) IgG deposits within the epithelium of the pulmonary bronchi associated with respiratory compromise.     

天疱疮患者抗桥粒芯糖蛋白与疾病相关性分析

目的：探讨酶联免疫吸附测定（ELISA ）检测血清桥粒芯糖蛋白（Dsg ）1和Dsg3在天疱疮诊断及治疗中的应用价值。方法选择2014年1～12月在该科确诊为天疱疮的患者47例（观察组）,同期排除天疱疮的患者52例为对照组。间接免疫荧光法（IIF）检测抗表皮棘细胞桥粒抗体,ELISA检测Dsgl、Dsg3;分析其与天疱疮病情的相关性。结果 ELISA法的敏感性为95．74％,特异性为92．31％。IIF法敏感性为93．62％,特异性为86．54％。二者比较差异无统计学意义（P＞0．05）。30例寻常型天疱疮患者16例Dsg1、Dsg3均阳性,8例红斑型和5例落叶型天疱疮患者均只有Dsg1阳性,2例增殖型天疱疮Dsg1、Dsg3均为阳性。寻常型和增殖型天疱疮Dsg1、Dsg3滴度分别为130．85±86、112．30±85．05,疾病活动性评分（5．10±1．86）分,相关系数分别为 r＝0．476（P＝0．008）、r＝0．816（P＝0．001）。落叶型和红斑型天疱疮Dsg1滴度142．59±78．52,疾病活动评分平均为（2．77±0．92）分,r＝0．800,P＝0．001。结论 ELISA检测Dsg1、Dsg3敏感性、特异性高,有助于天疱疮的诊断及病情严重程度的评价。     

Role of autoantibodies against the linker subdomains of envoplakin and periplakin in the pathogenesis of paraneoplastic pemphigus

Background The presence of autoantibodies against multiple epidermal proteins is an important feature in paraneoplastic pemphigus （PNP）. Circulating anti-desmoglein 3 autoantibody, the major pathogenic autoantibody in pemphigus vulgaris （PV）, has been proved pathogenic in PNP. Because of many clinical differences between PNP and PV, we speculate about the involvement of other autoantibodies in the pathogenesis of PNP. Envoplakin （EPL） and periplakin （PPL） are recognized by most PNP sera. Their linker subdomains are highly homologous and necessary for the association of intermediate filaments. Methods We characterized the autoantibodies against the linker subdomains of EPL and PPL in PNP patients＇ sera and their associated tumors by enzyme-linked immunosorbent assay （ELISA） and immunofluorence. We also applied the purified autoantibodies against EPL and PPL from PNP sera to cultured human epidermal keratinocytes （HEK）, to evaluate the changes of cell-cell adhesion. Results Autoantibodies against EPL and PPL were detected in most PNP patients by ELISA, and the decrease of these autoantibodies after removal of the tumors was roughly comparable to the improvement of clinical symptoms. Cultured tumor cells from PNP patients secreted these autoantibodies. Specific immunoglobulin receptors for EPL and PPL were found on B lymphocytes in tumors from PNP. Furthermore, purified anti-EPL and anti-PPL autoantibodies from PNP sera were capable of dissociating cultured human epidermal keratinocytes. Conclusion Autoantibodies against EPL and PPL may also be pathogenic in PNP.     

寻常型天疱疮皮损组织中Th17细胞相关细胞因子的表达

目的 研究Th17细胞相关细胞因子IL-23和IL-17在寻常型天疱疮（PV）发病机制中的作用.方法 采用免疫荧光染色法分析PV患者皮损组织和健康人皮肤组织中Th17细胞相关因子IL-17和IL-23的表达及CD163~＋巨噬细胞的分布.结果 IL-23~＋细胞的染色与CD163~＋巨噬细胞的染色重叠.PV患者真皮中IL-23~＋ CD163~＋细胞和IL-17~＋细胞在每个视野（×200）中的平均数分别为80.17±5.42和48.17±8.03,而正常人真皮中分别为29.50±4.45和9.50±3.35,两组差异均有统计学意义（P〈0.01）.真皮层中IL-23~＋细胞数和IL-17~＋细胞数存在相关性（r=0.945,P〈0.001）.结论 CD163~＋巨噬细胞是IL-23重要分泌源;IL-23和IL-17在PV患者皮损组织中高表达,IL-23/lL-17细胞因子轴在PV发病机制中可能起着非常重要的作用.     

臭氧水疗辅助治疗天疱疮的疗效

目的：观察臭氧水疗辅助治疗寻常型天疱疮患者的疗效。方法：32例住院治疗的寻常型天疱疮患者使用 臭氧水疗作为皮疹的辅助治疗;同期住院治疗的34例寻常型天疱疮患者采用高锰酸钾溶液湿敷或泡澡作为对照。两 组患者治疗中均使用激素及免疫抑制药作为主要的治疗手段。观察患者住院期间皮疹好转情况,皮疹处细菌感染情 况及抗生素的使用率,评价患者满意度,对两组疗效进行比较。结果：臭氧水疗组与对照组的疗效及平均住院日 差异无统计学意义(P>0.05);但住院期间臭氧水疗组抗生素使用率较对照组显著减少(P=0.039),治疗第7天患者对臭 氧水疗的满意度明显高于对照组(P>0.05)。结论：臭氧水疗是天疱疮安全有效的辅助治疗手段,可以减少抗生素的 使用率。     

血浆置换疗法治疗天疱疮疗效分析

[目的 ]探讨血浆置换疗法治疗天疱疮的疗效。 [方法 ]回顾性分析曾接受血浆置换疗法的 8例天疱疮患者的临床资料。[结果 ]8例天疱疮患者血浆置换后皮损均不同程度减轻 ,其中 2例尼氏征数日内由阳性迅速转为阴性 ;5例全身症状好转 ;4例检测天疱疮抗体滴度者 ,3例下降 ,1例无改变 ;3例糖皮质激素用量减少 ,另 1例第 3次血浆置换后糖皮质激素用量比第 1次减少。 [结论 ]血浆置换疗法辅助治疗天疱疮可取得较好的疗效。     

天疱疮患者血清抗桥粒芯糖蛋白抗体与疾病临床特征的相关性研究

目的：探讨天疱疮患者血清抗桥粒芯糖蛋白（Dsg）抗体与疾病临床特征的相关性。方法：选择49例天疱疮患者,比较其抗Dsg类别、亚型、滴度与疾病特征的相关性。结果：寻常型天疱疮（PV）患者活动期抗Dsgl、Dsg3抗体阳性率明显高于稳定期（P〈0．05）,落叶型天疱疮（PF）患者活动期抗Dsgl抗体阳性率高于抗Dsg3抗体（P〈0．05）;活动期患者两种抗体滴度随病情加重而明显升高（P〈0．05）;活动期患者血清两种抗体IgG4亚型滴度明显高于IgG1,稳定期患者两种抗体IgG4亚型滴度明显下降且远低于IgG1（P〈0．05）。结论：天疱疮患者血清抗Dsg抗体与疾病表型、病情、活动性存在明显相关性,测定其存在和滴度对临床诊断与治疗有重要指导意义。     

山东籍汉族寻常型天疱疮与HLA-DRB1基因的相关性研究

目的 探讨HLA-DRB1、DQB1位点基因在山东籍汉族寻常型天疱疮易感性中的作用.方法 用序列特异性引物聚合酶链反应(PCR-SSP)方法,对61例寻常型天疱疮(pemphigus vulgaris,PV)患者和57名正常对照者进行了HLA-DRB1、DQB1等位基因的分型,并分析了DRB1、DQB1基因在两组中的分布.结果 与正常对照组比较,PV患者组DRB1 *14(*1401、*1404、*1405)基因频率明显增高(Pc分别＜0.05).结论 HLA-DRB1*14是山东籍汉族PV的易感基因.     

1例Castleman病合并副肿瘤性天疱疮患者的诊治

副肿瘤性天疱疮是一种由潜在肿瘤引起的自身免疫性大疱性皮肤病,以Castleman病合并副肿瘤性天疱疮尤为常见,临床上很容易误诊。2015年1月中南大学湘雅医院收治了1例表现为顽固性皮肤黏膜糜烂的患者,起初以“寻常型天疱疮”治疗,效果不佳,进一步检查发现潜在的腹膜后肿瘤,考虑可能为Castleman病合并副肿瘤性天疱疮。予以手术切除联合免疫球蛋白和糖皮质激素治疗,术后病检提示为Castleman病,后来患者皮肤黏膜病变明显好转。当皮肤黏膜病变经药物治疗无明显改善时,应考虑Castleman病合并副肿瘤性天疱疮的可能,尽早完整切除肿瘤联合免疫治疗可明显改善副肿瘤性天疱疮患者的预后。     

寻常性天疱疮临床治疗初步分析

本文报告寻常性天疱疮26例,用激素与激素加免疫抑制剂治疗,其治愈率分别为26.67％与54.55％,经统计学处理,P>0.05,两组差别无显著性,并对寻常性天疱疮的诱因、症状及治疗作了探讨。     

SARS冠状病毒M蛋白B细胞抗原表位的原核表达与抗原活性检测

目的从SARS冠状病毒M蛋白的线性重叠肽链文库中筛选出5个B细胞抗原表位,通过构建原核表达载体,表达抗原表位融合蛋白,并检测其抗原活性.方法应用大肠杆菌高频密码子设计引物,通过PCR方法合成编码SARS冠状病毒M蛋白5个抗原表位(MKY1、MKY2、MKY3、MKY4和MKY5)的DNA片段,经克隆和测序分析,亚克隆至表达载体pET-CKS,转化大肠杆菌BL21;阳性菌株经IPTG诱导,SDS-PAGE分析;大量诱导表达抗原表位融合蛋白,亲和层析予以纯化;Western检测SARS病人阳性血清对融合蛋白的识别.结果成功构建SARS冠状病毒M蛋白抗原表位的表达载体,在大肠杆菌BL21中表达,融合蛋白表达量达到细菌总蛋白30%,经亲和层析纯化,融合蛋白可被SARS病人抗血清识别.结论原核表达的抗原表位融合蛋白具有良好的抗原活性,为下一步进行SARS冠状病毒诊断试剂盒的开发研究奠定基础.     

8例缓解期高滴度血清抗体的天疱疮患者临床分析

目的 评估缓解期血清抗桥粒芯蛋白(Dsg)抗体呈现高滴度的天疱疮患者的临床表现、诊治过程及实验室检查结果,为此类患者的治疗提供依据。方法 回顾性分析2013年1月至2020年9月皮肤科诊治的天疱疮患者临床资料,收集确诊为天疱疮并且缓解期血清抗Dsg抗体水平(酶联免疫吸附测定法测定)≥150 U/ml或较初始治疗时下降≤20%(以最大检测上限150 U/ml计算)的患者资料。结果 在此期间收治并获得随访的134例天疱疮患者中,共有8例患者符合纳入标准,随访时长21~85个月,持续缓解时间18~70个月,均以每日口服≤10 mg泼尼松相当量糖皮质激素维持治疗,血清抗Dsg抗体均呈高滴度。8例患者首诊时Dsg-1抗体阳性和Dsg-3抗体阳性者各为7例,其中2例患者分别在病情缓解后19和21个月Dsg-1抗体仍为高滴度,5例患者在病情缓解的18~70个月Dsg-3抗体持续保持高滴度,1例患者两种抗体均呈高滴度状态,以Dsg-1抗体更为明显。Dsg-1和Dsg-3抗体均持续高滴度的患者在19个月的缓解期后出现复发,余患者仍处于临床缓解状态。结论 天疱疮患者治疗后,部分患者抗体滴度呈现高水平状态,以Dsg-3抗体持续不转阴更常见,且与复发无明显相关性,而Dsg-1抗体不下降较少见,患者复发可能性较Dsg-3不下降者大。对于这类临床长期缓解但抗体呈高滴度的天疱疮患者,应注意根据抗体类型并结合患者实际情况调整糖皮质激素用量。对于Dsg-1抗体持续高水平的患者,激素减量应适度放缓。     

天疱疮患者临床特征和Dsg1及Dsg3抗体结果分析

  目的  研究天疱疮患者的临床特征,分析桥粒芯糖蛋白1抗体(desmoglein 1,Dsg1)和桥粒芯糖蛋白3抗体(desmoglein 3,Dsg3)ELISA检测结果与天疱疮分型及严重程度之间的关联。  方法  选取2021年1—12月安徽医科大学第一附属医院收治的50例天疱疮患者,根据临床表现、实验室指标对天疱疮进行分型和分级,对诱发因素、伴发疾病、皮肤感染情况、Dsg1及Dsg3抗体指数等进行回顾性分析。  结果  50例天疱疮患者中寻常型天疱疮39例、红斑型天疱疮8例、落叶型天疱疮2例和副肿瘤性天疱疮1例;轻度28例,中度11例,重度11例;常见诱发因素和糖皮质激素不规范使用有关,占比20%(10/50);最常见皮肤感染菌为金黄色葡萄球菌,检出率为18%(9/50)。不同类型天疱疮患者Dsg3抗体指数差异有统计学意义(Z=-3.481,P＜0.001);不同严重程度天疱疮患者Dsg1及Dsg3抗体差异有统计学意义(P值分别为0.002、0.024)。  结论  天疱疮患者治疗中要注重糖皮质激素的正确使用,皮肤感染在天疱疮患者中较为常见,Dsg1及Dsg3抗体检测在天疱疮患者中具有较高的阳性率,Dsg1及Dsg3抗体指数可作为天疱疮病情评估的指标。      

类弹性蛋白展示NT-proBNP双抗原表位重组蛋白的制备和纯化

目的：利用大肠杆菌（E.coli）高效制备类弹性蛋白（ELP）展示N端脑钠肽前体（NT-proBNP）双抗原表位的重组蛋白,为低成本、高效地制备NT-proBNP检测校准品提供依据。方法：分别设计NT-proBNP第13~20位和第63~71位氨基酸残基表位,通过柔链连接上述2个抗原表位与ELP融合,获得3种融合蛋白。利用基因工程技术合成编码以上3种融合蛋白的基因并克隆到pET-28a （+）载体上,转入E.coli BL21（DE3）自动诱导表达,利用多次可逆相变循环（ITC）纯化重组蛋白,并应用Western blotting和ELISA法检测其抗体特异结合表位的能力。结果：成功构建了3种ELP展示NT-proBNP抗原表位的载体,并在E.coli中表达获得相应重组蛋白。Western blotting和直接ELISA检测,ELP展示的特异抗原表位均具有良好的与相应抗体结合的能力。夹心ELISA法检测,ELP展示NT-proBNP双抗原表位重组蛋白的蛋白浓度与450 nm处吸光度（A）值呈双对数线性剂量依赖关系（r=0.9197,P<0.01）。结论：成功利用ELP展示NF-proBNP双抗原表位,为低成本、高效地制备出与NT-proBNP检测校准品奠定了基础。     

人血白蛋白免疫优势抗原表位的筛选及鉴定

目的：筛选人血白蛋白（HSA）免疫优势抗原表位,为建立一种高特异性HSA制品快速检测方法提供基础。方法采用生物信息学方法比较人与其他物种（猪、马、牛、羊）白蛋白基因序列并预测其抗原表位,获得HSA免疫优势抗原表位;利用大肠杆菌优势密码子获得相应基因,插入PGEX-4T-2载体克隆表达得到重组HSA表位抗原;间接ELISA评价上述重组表位的特异性。结果筛选3个HSA抗原表位,分别位于H1〔126～162氨基酸（aa）〕、H2（314～355aa）、H3（373～424aa）,获得相应基因片段;得到重组抗原的相对分子质量（Mr）分别为3.01×104、3.06×104和3.17×104;抗原活性检测显示373~424aa序列表位具有较高活性,其酶标抗体竞争抑制反应的IC50为1.635 mg/L,高于酶标HSA抗体。结论实验获得了特异性HSA免疫优势抗原表位,对研制一种快速、特异的HSA检测试剂具有重大意义。