天疱疮患者血清中Dsg1及Dsg3抗体水平检测及意义

目的 研究18例天疱疮患者血清中抗桥粒芯糖蛋白抗体1(Dsg1)及抗桥粒芯糖蛋白抗体3(Dsg3)的表达水平和治疗前后的变化以及抗体指数与病情严重程度的相关关系,以探讨Dsg1及Dsg3在天疱疮患者的诊断、监测病情变化及治疗中的应用.方法 对18例患者通过病理及直接免疫荧光进行诊断,并用ABSIS评分标准对患者的病情进行评估,应用酶联免疫吸附试验(ELISA)法检测患者及20例正常人血清中Dsg1及Dsg3抗体的水平,最后通过统计分析判断各指标间的关系及意义.结果 18例患者中Dsg1阳性13例,Dsg3阳性10例;治疗后的Dsg抗体指数较治疗前下降,治疗前后的Dsg1差值为3.13±13.52,Dsg3差值为3.81±10.05,差异有统计学意义(P<0.05);20例正常人血清中,Dsg1阳性2例,阴性18例;Dsg3阳性1例,阴性19例.Dsg1及Dsg3抗体检测的灵敏性分别为72.22％及55.56％,特异性分别为90％及95％.治疗前后的Dsg抗体指数与病情评分分别具有相关性(均为P<0.05).结论 天疱疮患者血清中Dsg1及Dsg3中抗体检测具有较高的灵敏性和特异性,其抗体水平与疾病的严重程度具有一定的相关性,可作为天疱疮的常规辅助检测,并用于监测病情变化及指导治疗.     

儿童天疱疮抗体IgG亚型及与天疱疮抗原的反应性

目的观察寻常型天疱疮（Pemphigus vulgaris,PV）患儿和一级亲属血清中PV自身抗体（PV-IgG）亚型及其与桥粒芯糖蛋白（Desmoglein,Dsg）反应性,探讨PV-IgG检测的临床意义和PV的发病机制。方法用间接免疫荧光法（Indirect immunofluorescenceI,IF）检测5例PV患儿、12例一级亲属和15例正常对照者血清PV-IgG,并用免疫印迹法（Western blot,WB）检测PV-IgG亚型及其与Dsg1、Dsg3反应性。结果 PV患儿的PV-IgG阳性率和平均抗体滴度明显高于其一级亲属者（P〈0.01）,活动期患儿的PV-IgG阳性率和平均抗体滴度也明显高于缓解期（P〈0.01）;PV患儿中PV-IgG阳性率（80.0%）明显高于一级亲属（25.0%）和正常对照组（0.0%）（P〈0.01）,PV患儿中Dsg3反应性IgG4水平明显高于一级亲属（P〈0.01）,且其在活动期病例中水平也明显高于缓解期（P〈0.05）。结论寻常型天疱疮的发生与PV-IgG水平有关;Dsg3是PV的主要自身抗原I;gG4是PV的主要致病抗体。     

天疱疮患者血清抗桥粒芯糖蛋白抗体与疾病临床特征的相关性研究

目的：探讨天疱疮患者血清抗桥粒芯糖蛋白（Dsg）抗体与疾病临床特征的相关性。方法：选择49例天疱疮患者,比较其抗Dsg类别、亚型、滴度与疾病特征的相关性。结果：寻常型天疱疮（PV）患者活动期抗Dsgl、Dsg3抗体阳性率明显高于稳定期（P〈0．05）,落叶型天疱疮（PF）患者活动期抗Dsgl抗体阳性率高于抗Dsg3抗体（P〈0．05）;活动期患者两种抗体滴度随病情加重而明显升高（P〈0．05）;活动期患者血清两种抗体IgG4亚型滴度明显高于IgG1,稳定期患者两种抗体IgG4亚型滴度明显下降且远低于IgG1（P〈0．05）。结论：天疱疮患者血清抗Dsg抗体与疾病表型、病情、活动性存在明显相关性,测定其存在和滴度对临床诊断与治疗有重要指导意义。     

低温冷冻对皮肤组织桥粒芯糖蛋白1表达影响的实验研究

目的观察桥粒芯糖蛋白1（Desmogleinl,Dsg1）在不同温度保存皮肤组织中的分布,以探讨其与皮肤冷冻损伤的关系。方法用Dsg1抗体对5种保存条件下的皮肤组织作免疫组化染色,采用计算机图像定量分析方法测定表皮组织中的含量,并用H．E染色观察皮肤的组织结构变化。结果与新鲜皮片组相比,-196℃条件下皮肤组织结构保存较好,Dsg1含量变化不明显,而4℃、-20℃、-80℃保存皮肤组织结构破坏明显,含量亦明显下降。结论皮肤低温保存冷冻损伤可能与桥粒跨膜蛋白Dsg1破坏有关。     

天疱疮患者临床特征和Dsg1及Dsg3抗体结果分析

  目的  研究天疱疮患者的临床特征,分析桥粒芯糖蛋白1抗体(desmoglein 1,Dsg1)和桥粒芯糖蛋白3抗体(desmoglein 3,Dsg3)ELISA检测结果与天疱疮分型及严重程度之间的关联。  方法  选取2021年1—12月安徽医科大学第一附属医院收治的50例天疱疮患者,根据临床表现、实验室指标对天疱疮进行分型和分级,对诱发因素、伴发疾病、皮肤感染情况、Dsg1及Dsg3抗体指数等进行回顾性分析。  结果  50例天疱疮患者中寻常型天疱疮39例、红斑型天疱疮8例、落叶型天疱疮2例和副肿瘤性天疱疮1例;轻度28例,中度11例,重度11例;常见诱发因素和糖皮质激素不规范使用有关,占比20%(10/50);最常见皮肤感染菌为金黄色葡萄球菌,检出率为18%(9/50)。不同类型天疱疮患者Dsg3抗体指数差异有统计学意义(Z=-3.481,P＜0.001);不同严重程度天疱疮患者Dsg1及Dsg3抗体差异有统计学意义(P值分别为0.002、0.024)。  结论  天疱疮患者治疗中要注重糖皮质激素的正确使用,皮肤感染在天疱疮患者中较为常见,Dsg1及Dsg3抗体检测在天疱疮患者中具有较高的阳性率,Dsg1及Dsg3抗体指数可作为天疱疮病情评估的指标。      

低温冷冻对皮肤组织桥粒芯糖蛋白2表达的影响

目的:观察桥粒芯糖蛋白2(desmoglein2,Dsg2)在不同温度保存皮肤组织中的分布,以探讨其与皮肤冷冻损伤的关系。方法:用Dsg2抗体对5种保存条件下的皮肤组织作免疫组化染色,采用计算机图像定量分析方法测定表皮组织中的含量,并用H.E染色观察皮肤的组织结构变化。结果:与新鲜皮片组相比,-196℃温度条件下保存皮肤组织结构保存较好,Dsg2含量变化不明显,而4℃、-20℃、-80℃保存皮肤组织结构破坏明显,含量亦明显下降。结论:皮肤低温保存冷冻损伤可能与Dsg2破坏有关。     

桥粒芯胶蛋白3前导肽基因的克隆和原核表达

目的：克隆人桥粒芯胶蛋白3前导肽(Dc3p)基因，并进行表达、纯化和鉴定。方法：用PCR法从桥粒芯胶蛋白(Dc)cDNA文库中扩增出Dc3p基因，与pGEX-4T-2载体连接成重组表达质粒pGEX-4T-2／Dc3p；重组质粒转入B121大肠杆菌：经诱导表达谷胱甘肽S-转移酶-Dc3p(GST-De3p)融合蛋白，该蛋白经Glutathione Sepharose4B亲和层析柱纯化，SDS-PAGE和免疫印迹法检测鉴定。结果：经酶切及序列分析鉴定，重组质粒pGEX-4T-2／De3p成功构建，诱导后高表达GST-De3p融合蛋白并得到纯化，免疫印迹法证实表达蛋白为Gsr-Dc3p。结论：获得高表达、高纯度的GST-Dc3p融合蛋白，为De3p的功能及免疫学分析打下基础。     

抗表皮棘细胞桥粒抗体、抗桥粒芯糖蛋白1、3抗体（Dsg1、Dsg3）在天疱疮中的诊断价值

目的：分析评价抗表皮棘细胞桥粒抗体、抗桥粒芯糖蛋白1、3抗体（Dsg1、Dsg3）在天疱疮中的诊断价值。方法选择2011年2月-2013年2月在新疆医科大学第一附属医院皮肤科诊治经临床、组织病理及间接免疫荧光确诊为天疱疮的34例患者（试验组）,选择同期排除天疱疮的36例患者为对照组。采用间接免疫荧光法（IIF）检测抗表皮棘细胞桥粒抗体,采用酶联免疫吸附法（ELISA）检测 Dsg1、Dsg3;统计各检测指标的敏感性、特异性、阳性预测值（PPV）、阴性预测值（NPV）和诊断符合率。结果试验组和对照组抗表皮棘细胞桥粒抗体的阳性率分别为73．5％（25/34）、2．8％（1/36）。Dsg1抗体阳性率分别为70．6％（24/34）、0．0％（0/36）,Dsg3抗体阳性率分别为79．4％（27/34）、5．6％（2/36）。在天疱疮患者中,抗表皮棘细胞桥粒抗体试验的敏感度、特异度、PPV、NPV、诊断符合率分别为73．5％、97．2％、96．2％、79．5％、85．7％,Dsg1分别为70．6％、100．0％、100．0％、78．3％、85．7％,Dsg3分别为79．4％、94．4％、93．1％、82．9％、87．1％。3种指标在天疱疮患者中灵敏度和特异度的差异无统计学意义（P＞0．05）。结论同时行血中循环抗体检测与具体靶抗原确认试验检测,能互相补充,减少临床漏诊,提高诊断阳性率。抗天疱疮抗体阳性结果对确诊天疱疮准确性较好,阴性者排除天疱疮的价值较大。     

桥粒芯糖蛋白1和2在不同表皮肿瘤中的表达

目的:分析桥粒芯糖蛋白1和桥粒芯糖蛋白2在不同表皮肿瘤中表达的改变,探讨桥粒相关成分与表皮肿瘤的临床、病理及生物学行为之间的关系。方法:采用过氧化物酶标记的链霉卵白素免疫组织化学染色方法,对桥粒芯糖蛋白1(Dsg1)、桥粒芯糖蛋白2(Dsg2)在鳞状细胞癌(SCC)、基底细胞癌(BCC)、Bowen病、日光角化病(AK)、角化棘皮瘤(KA)、脂溢性角化症(SK)中的表达进行检测。结果:桥粒芯糖蛋白1和桥粒芯糖蛋白2在正常皮肤表皮中显著表达()并广泛分布于表皮全层及毛囊、汗腺上皮;鳞状细胞癌的肿瘤组织中桥粒芯糖蛋白1、2表达显著减弱或完全消失;基底细胞癌中桥粒芯糖蛋白1、2表达显著减弱或完全消失;Bowen病、日光角化病中桥粒芯糖蛋白1、2表达下调,但与鳞状细胞癌和基底细胞癌的近核染色( )和完全消失(-)相比,其主要表达类型为胞膜灶状染色();在绝大多数角化棘皮瘤、脂溢性角化症中桥粒芯糖蛋白1、2表达方式为强而连续的胞膜染色(),与正常皮肤表皮的表达非常相似。结论:桥粒芯糖蛋白1、2在皮肤恶性肿瘤中的表达显著减弱或完全消失,而皮肤良性肿瘤中桥粒芯糖蛋白1、2表达与正常表皮基本相同。提示皮肤恶性肿瘤中桥粒芯糖蛋白1、2的表达显著减弱或完全消失可能与肿瘤的侵袭性和远处转移有关,桥粒芯糖蛋白1、2可能对表皮良、恶性肿瘤的鉴别诊断具有一定的价值。     

应用酶联免疫吸附试验检测血清桥粒芯蛋白抗体水平监测寻常型天疱疮患者病情变化

目的:研究较大样本寻常型天疱疮(pemphigus vulgaris,PV)患者,血清抗桥粒芯蛋白(desmoglein,Dsg)1和抗Dsg3特异性抗体酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)指数长期的变化情况,观察其与病情变化的相关性,探讨其用于病情监测、预测疾病复发和指导治疗的可行性。方法:对20例确诊PV的患者进行长期随访,收集患者在各随访时间点的血清,记录每次随访时的病情并进行评分(autoimmune bullous skin disorderintensity score,ABSIS);检测患者血清的间接免疫荧光(indirect immunofluorescence,IIF)滴度、Dsg3 ELISA指数和Dsg1 ELISA指数;利用统计学方法和做图方法分析病情评分与Dsg3 ELISA指数、Dsg1 ELISA指数和IIF滴度之间的关系。结果:PV患者皮肤和口腔的病情评分,分别与Dsg3 ELISA指数、Dsg1 ELISA指数和IIF滴度均具有显著性关联(P<0.01),患者疾病活动期和临床缓解期两组间Dsg3 ELISA指数、Dsg1 ELISA指数和IIF滴度差异均有统计学意义(P<0.01)。各组患者相关性分析发现,Dsg3 ELISA指数、Dsg1 ELISA指数和IIF滴度几乎均与病情平行波动变化,ELISA指数优于IIF的平行性,并且ELISA指数可以预测病情是否会反复,从而指导治疗。结论:PV患者血清抗Dsg3抗体ELISA指数与病情变化平行波动,可以反映疾病的活动程度,可用于病情监测,并可为临床上预测疾病复发,指导临床调整治疗提供有利的实验室证据。     

Effects of chimeric molecule of recombinant Dsg3EC1-2 with toxin PE40 on T and B lymphocytes in Pemphigus Vulgaris

Objective:To observe the effects of the recombinant chimeric toxin Dsg3EC1-2PE40 on T and B lymphocytes isolated from Pemphigus Vulgaris (PV) patients to further study its biological therapeutic function for PV. Methods :Recombinant chimeric toxin Dsg3EC1-2PE40 was first identified, expressed and purified, and then its effects on T and B lymphocytes of PV patients in vitro were detected and quantified by ELISPOT assay and MTT assay. Results :The purity of the expressed protein Dsg3EC1-2PE40 was up to 80%. In ELISPOT assay, with Dsg3EC1-2PE40, the overall number of B cells that produce anti-Dsg3 antibodies among PV patients was only about 60% of the comparable number with Dsg3EC1-2. The proliferation of T cells of PV patients was inhibited markedly by Dsg3EC1-2PE40. There was significant difference between the different groups with Dsg3EC1-2PE40 and Dsg3EC1-2. Conclusion:The recombinant chimeric toxin Dsg3EC1-2PE40 decrease the number of B cells that produce anti-Dsg3 antibodies in PV patients and can inhibit or kill T cells of PV patients in vitro.     

Her2/neu膜外及跨膜区蛋白基因重组腺病毒的构建和鉴定

目的 构建编码Her2/neu膜外第一受体区、全长膜外区、膜外及跨膜区3个蛋白的重组腺病毒真核表达载体,为信号传导和免疫研究建立实验材料.方法 RT-PCR扩增出3个目的片段的cDNA,克隆进pAdTrack-CMV穿梭质粒,在BJ5183细菌内同源重组形成腺病毒质粒,脂质体法转染293细胞后,荧光显微镜观察病毒噬斑形成和绿色荧光蛋白表达,Western blot检测目的蛋白的表达.结果 PCR扩增出了预定大小的目的基因cDNA片段,测序结果和GenBank完全相符.病毒质粒转染293细胞后形成了病毒噬斑,绿色荧光蛋白和目的蛋白均获得表达.目的蛋白的表达量随着病毒感染复数的升高而增加.结论 成功地构建了在真核细胞中表达Her2/neu膜外及跨膜区蛋白的腺病毒载体,为Her2/neu膜外及跨膜区蛋白的功能研究提供了材料基础.     

核干细胞因子基因siRNA表达载体的构建及鉴定

目的 构建针对核干细胞因子(NS)基因的小干扰RNA(siRNA)真核表达载体.方法 根据GenBartk提供的NS基因AY825265 mRNA序列及siRNA设计原则设计siRNA,筛选得到126-144 nt,199-217 nt和487-505 nt 3个19 bp片段为靶序列;合成带有BamHI、XhoI酶切位点的发夹结构寡核苷酸序列,经过退火,将此序列克隆至载体pRNAT-U6.1中构建重组表达载体;转化DH5α,提取质粒,应用PCR技术和测序方法鉴定重组克隆.转染入食管癌EC9706细胞,检测NS基因沉默情况.结果 PCR筛选得到3个目的片段的阳性重组克隆,测序证实重组表达载体中插入序列与设计一致.RT-PCR和Western blot检测显示构建的siRNA表达载体可显著降低EC9706细胞中NS mRNA和蛋白水平的表达.结论 成功构建出一组针对NS基因的siRNA表达载体,为下一步NS基因的RNA干扰研究鉴定了基础.     

猪endoglin胞外段真核表达载体的构建及其诱导抗小鼠自身endoglin抗体的实验研究

目的分别扩增猪和小鼠endoglin胞外段cDNA,构建真核表达载体作为DNA疫苗,了解猪endoglin DNA疫苗是否能够在小鼠体内诱导产生抗小鼠endoglin的自身抗体.方法利用RT-PCR技术,从猪和小鼠胚肝中分别扩增出猪和小鼠的endoglin胞外段,用内切酶消化后分别将其插入真核表达质粒pcDNA3.1( )中,经琼脂糖凝胶电泳和测序鉴定后,体外转染真核细胞COS-1,用RT-PCR和免疫印迹鉴定是否能正确表达.然后大量扩增和提取相应质粒,将这些质粒作为DNA疫苗,肌注免疫小鼠,通过ELISA、免疫印迹和ELISPOT测定抗自身endoglin的抗体和脾脏中分泌特异性抗endoglin抗体的B淋巴细胞.结果琼脂糖凝胶电泳和测序鉴定证实RT-PCR扩增的cDNA及构建的重组真核表达质粒正确,重组的真核表达质粒能在COS-1细胞中正确表达,猪endoglin胞外段真核质粒DNA疫苗免疫小鼠可以诱导产生抗小鼠endoglin的自身抗体.结论重组猪endoglin胞外段真核表达载体可作为DNA疫苗用于抗肿瘤血管生成的基因治疗.     

人IgA Fc受体(CD89)的功能部位

目的：确定人ＩｇＡ Ｆｃ受体（ＦｃαＲ,ＣＤ８９）结合ＩｇＡ的功能部位。方法：先采用ＰＣＲ及点突变ＰＣＲ技术获得不同片段的ＦｃαＲ ｃＤＮＡ,再将各片段分别插入表达质粒ｐＥＴ３０ａ中,在大肠杆菌中表达出不同片段的受体,用一组能够结合ＦｃαＲ的单克隆抗体通过Ｗｅｓｔｅｒｎ印迹法鉴别所表达片段是否具有ＦｃαＲ的功能部位。结果：表达了５种不同片段的ＦｃαＲ,能够封闭ＦｃαＲ的中和抗体仅与受体的远膜区（ＥＣ１）结合。结论：ＦｃαＲ的功能部位位于ＥＣ１上。     

人乙酰肝素酶基因增强子的初步筛选与鉴定

目的：初步筛选并鉴定出人乙酰肝素酶（ HPSE ）基因内具有增强子（ enhancer , enh ）活性的DNA片段。方法：增加Kpn I、Sal I酶切位点,将含有报告基因增强型绿色荧光蛋白（pEGFP）质粒载体pEGFP-N1改造为pEGFP-MU。选取HPSE基因5′端启动子上、下游的DNA序列并分为10个片段,分别命名为enhx （ x分别等于1、2、3……10）,每段长1200 bp,相邻两段间重复200 bp。分别扩增上述10个片段和猿猴病毒40（SV40）增强子序列,分别插入pEGFP-MU,以构建重组质粒pEGFP-MU-enhx和pEGFP-MU-SV40e,并用脂质体2000转染肝癌细胞BEL-7402、胃癌细胞SGC-7901,荧光显微镜和流式细胞仪分析上述候选序列对启动子（ CMV）转录活性的影响。结果：琼脂糖凝胶电泳和DNA测序结果显示,PCR克隆序列与GeneBank中序列完全一致。酶切电泳和测序结果显示,重组质粒pEGFP-MU-enhx和pEGFP-MU-SV40 e构建符合要求。瞬时细胞转染、荧光显微镜和流式细胞仪分析发现,重组质粒pEGFP-MU-enh6、pEGFP-MU-enh7和pEGFP-MU-enh8在人BEL-7402、SGC-7901细胞中表达增强,与阳性对照质粒pEGFP-MU-SV40e相似,其余重组质粒表达较弱。结论：成功克隆人HPSE基因10个增强子候选序列片段,并正确构建重组质粒pEGFP-MU-enhx;其中第6、7和8候选片段可能具有增强子活性。本研究为后续进一步筛选和鉴定有活性的增强子序列缩小了搜寻范围,并为将来利用HPSE增强子进行肿瘤基因治疗提供了实验依据。     

利用反向遗传学原理构建B、E型肉毒神经毒素基因型特异性靶片段

目的 利用反向遗传学原理构建B、E型肉毒神经毒素(BoNT)基因型特异性靶片段质粒、菌株.方法 自GenBank获取BoNT基因序列,利用DNAMAN、Lasergene、VectorNTI等多种生物信息学分析软件和BLAST等网上数据分析平台进行综合分析,以锚定BoNT/B与BoNT/E基因中的型特异性靶片段,分别设计合成5条和10条DNA短链,经重叠PCR扩增获得完整的靶片段,纯化后连接到pMD 18-T载体上,转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞中,质粒提取后进行酶切和测序鉴定.结果 分析了全球已报道的60条BoNT基因序列(A、B、E、F型),于BoNT/B与BoNT/E基因中,分别锚定了215 bp和360bp的靶片段,并设计合成其特异的检测引物对,经酶切、测序确证,成功合成具有型特异性的BoNT/B与BoNT/E靶片段.结论 获得含有型特异性BoNT/B与BoNT/E靶片段的重组质粒pMD18-T-BoNT/B,pMD18-T-BoNT/E及其菌株.     

干扰HSP70-2的shRNA表达载体的构建及筛选

目的:利用pGenesil-1质粒构建针对热休克蛋白HSP70-2的短发夹RNA(shRNA)表达载体。方法:设计针对HSP70-2表达shRNA结构的互补DNA序列,经退火成双链,分别克隆至带有U6启动子的质粒载体pGenesil-1中,构建重组质粒,转化大肠杆菌DH5α菌株,扩增,提取质粒,酶切鉴定后测序分析。利用质粒转染大鼠精原细胞,用RT-PCR和Western blotting法检测转染后HSP70-2 mRNA和蛋白表达变化。结果:成功构建靶向HSP70-2的3个shRNA重组质粒载体pGenesil-1-HSP70-21、pGenesil-1-HSP70-22和pGenesil-1-HSP70-23。酶切鉴定和测序分析重组质粒,shRNA编码序列与设计的片段完全一致,经酶切凝胶电泳证实载体构建成功。质粒筛选实验提示pGenesil-1-HSP70-23质粒对精原细胞HSP70-2基因的抑制作用最强,而pGenesil-1-HSP70-21的抑制作用最弱。结论:成功构建表达靶向HSP70-2的shRNA重组质粒载体。