人肺癌细胞MCT2基因的克隆及其mRNA表达分析

目的　克隆人肺癌细胞单羧酸转运蛋白第二亚型基因 (MonocarboxylateTransporter 2 ,MCT2 )的编码序列 ,并对其在肿瘤组织细胞mRNA表达作半定量分析。方法　 (1)通过RT PCR方法克隆人肺腺癌A5 4 9细胞中的MCT2基因片段。应用四色荧光、双脱氧终止法测序 ;通过Genebank数据库应用分析软件对克隆基因序列进行同源性分析。 (2 )采用半定量RT PCR方法比较人肺癌组织、癌旁正常肺组织及人肺癌细胞株中MCT2mRNA的表达水平。结果　 (1)应用RT PCR方法克隆出人肺癌细胞的MCT2基因片段 ;肺癌细胞此基因编码序列与人肝细胞MCT2基因的cDNA编码序列具有高度同源性。 (2 )人肺癌组织及人肺癌细胞株中MCT2mRNA的表达非常显著地高于癌旁正常肺组织 (P <0 .0 0 1)。结论　MCT2基因为一序列保守的基因 ,在肿瘤细胞中超表达并可能对细胞能量代谢及生长增殖具有重要作用     

Real time RT-PCR定量检测AFP mRNA表达水平方法的建立

目的　建立realtime逆转录聚合酶链反应 (RT PCR)检测AFPmRNA表达水平方法。方法　提取BEL740 2细胞总RNA ,进行RT PCR扩增并纯化AFP基因片段 ,构建重组质粒 ,建立realtimeRT PCR检测AFPmRNA表达水平方法。结果　重组质粒的阳性克隆效率为 81.8% ,经酶切鉴定 ,目的基因片段已插入PMD 18T载体内 ,得到realtimeRT PCR动力学曲线。结论　成功建立了realtimeRT PCR定量检测AFPmRNA表达水平方法。     

SYBR GreenⅠ实时荧光定量逆转录聚合酶链反应检测前列腺癌抗原3mRNA表达水平

目的采用SYBR Green I实时荧光定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术,建立检测前列腺癌抗原3(DD3)mRNA的标准,定量检测人体不同组织中该基因的表达水平。方法从LNCaP细胞中采用RT- PCR法扩增特异性DD3基因片段,将其与pMD18-T载体连接,转化宿主菌JM109,对质粒标准进行聚合酶链反应(PCR)检测及测序。纯化后检测质粒拷贝浓度,制备梯度浓度标准品。应用LightCycler荧光定量PCR仪对标准品进行检测。取正常人乳腺组织、膀胱、结肠、尿道、肺、睾丸、精囊、卵巢、正常前列腺组织、前列腺增生及前列腺癌组织,定量检测DD3 mRNA表达。结果建立稳定的检测DD3 mRNA的标准,正常人乳腺、膀胱、结肠、尿道、肺、睾丸、精囊、卵巢中无DD3 mRNA表达,在正常前列腺及前列腺增生组织中低表达,两者间差异无显著性 (P>0．05);在前列腺癌中高表达(P<0．05)。结论应用SYBR Green I实时荧光定量RT-PCR技术检测 DD3 mRNA表达水平简便、可行、经济。DD3基因的表达具有良好的前列腺癌特异性。     

SYBR荧光实时定量PCR检测NSCLC中ERCC1基因表达

目的:建立检测核苷酸切除修复基因ERCC1mRNA的SYBR Green I实时定量PCR的方法,了解肺癌组织及其癌缘肺组织中ERCC1的表达水平,研究肺癌组织中ERCC1的表达水平与各种临床病理特征之间的关系.方法:应用SYBR荧光实时定量PCR(Real-time PCR)技术检测30例肺癌组织和离肿瘤边缘5cm处正常癌旁组织中的ERCC1mRNA表达水平,同时分析ERCC1表达水平在不同肺癌临床分期和病理类型各组间的关系.结果:肺癌中ERCC1mRNA的表达(5.16±2.51)低于正常癌旁组织(11.17±4.79)(P<0.05).但在不同肺癌临床分期、组织类型各组之间差异均无统计学意义.结论:所建立的SYBR Green I实时定量PCR方法可以成功地检测ERCC1基因的表达量.     

实时荧光RT—PCR定量检测BRMS1基因表达

目的建立一种实时荧光RT—PCR定量检测乳腺组织中BRMS1 mRNA表达水平的方法。方法采明逆转录聚合酶链反应（RT—PCR）扩增目的基因片段,并实时检测产物的荧光强度,根据标准品建立的标准曲线,计算出待测样本中BRMS1 mRNA含量,并以BRMS1 mRNA与GAPDHmRNA的比值作为BRMs1 mRNA的表达水平。结果实时荧光RT—PCR检测BRMS1及GAPDH的线性范围为4&#215;10^2-4&#215;10^8拷贝／μl。批内和批间变异系数分别为3．9％-4．6％和4．8％-5．5％。BRMS1 mRNA表达范围为0—1．65．结论实时荧光定量检测BRMS1 mRNA含量的方法具有较高的灵敏度和较好的重复性。     

BMPR-Ⅱ基因mRNA荧光定量PCR检测标准品的构建

目的构建检测BMPR-Ⅱ基因mRNA表达水平差异的标准品。方法以人胚肺成纤维细胞的总RNA为模板、O ligo(dT)18为引物逆转录产生cDNA,用该cDNA为模板PCR扩增人BMPR-Ⅱ基因相应的cDNA片断,构建pMD-18-BMPR-Ⅱ重组质粒,经鉴定测序,用荧光定量PCR制作标准曲线。结果成功克隆了人BMPR-ⅡcDNA,并以其为标准制作出荧光定量PCR标准曲线。结论成功构建了BMPR-Ⅱ基因荧光定量PCR标准质粒,为今后BMPR-ⅡmRNA的荧光定量PCR检测打下了基础。     

一种新的T细胞相关分子IBP表达水平定量检测方法的建立

目的 建立一种定量检测IBP表达水平的方法 ,为研究IBP在免疫细胞分化以及在免疫性疾病当中的作用奠定基础.方法 利用反转录PCR和PCR技术获得目的 基因和内参基因片段,构建重组质粒,以重组质粒为标准品,建立实时PCR标准曲线;测定外周血白细胞IBP和β-actin表达水平.以β-actin为内参照,均一化检测结果 .结果 重组质粒的阳性克隆经PCR扩增,0.8%琼脂糖凝胶电泳鉴定,目的 基因片段插入载体内;建立起实时PCR标准曲线.检测20例正常人全血标本,得到比较稳定的检测结果 .结论 成功建立了用实时PCR定量检测IBP mRNA表达水平方法 ,为进一步研究IBP奠定了基础.     

SYBR荧光实时定量PCR检测非小细胞肺癌组织与外周血中RRM1和ERCC1及BRCA1基因表达水平

目的:建立荧光实时定量PCR技术,检测非小细胞肺癌组织与外周血RRM1和ERCC1及BRCA1基因表达水平.方法:分别构建RRM1、ERCC1和BRCA1及管家基因β-actin质粒标准品,以SYBR荧光实时定量PCR分析,制备标准曲线,对非小细胞肺癌组织与外周血中RRM1、ERCC1和BRCA1及管家基因β-actin的mRNA进行检测.结果:标准曲线呈良好的线性关系.标准品的熔解曲线均呈单峰,特异性良好,说明基本无非特异性扩增.结论:所建SYBR荧光实时定量PCR方法操作简便,费用低,特异性好,准确度、灵敏度高,为后续研究构建了理想的平台.     

肺癌组织α3(Ⅳ)基因表达及其临床研究

目的利用Taqman技术,建立荧光定量逆转录聚合酶链反应(FQ-RT-PCR)方法,对肺癌组织中Ⅳ型胶原α3链[α3(Ⅳ]]mRNA表达进行定量及蛋白表达水平检测,评价其临床应用价值。方法在α3(Ⅳ)基因NC1结构域编码序列设计一对引物和一条Taqman探针;优化反应体系的条件,以不同质粒DNA含量为标准品和其循环阈值(Ct值)制作标准曲线,检测肺癌组织中α3(Ⅳ)mRNA含量;并对本方法进行方法学评价。Western blot法检测tumstatin蛋白表达情况。结果成功建立了α3(Ⅳ)基因mRNA表达实时荧光定量PCR检测方法,检测灵敏度为800拷贝/μl;在103～108拷贝/μl之间与Ct值具有很好的线性关系;PCR扩增效率为99.4%;肺癌组织中α3(Ⅳ)mRNA表达定量检测发现,48例肺癌患者肺癌组织α3(Ⅳ)mRNA组含量显著低于癌旁组织,差异有统计学意义(P<0.01),肺癌组织中tum-statin蛋白表达下调/缺失率显著高于癌旁组织(P<0.01)。临床监测发现肺癌患者癌组织α3(Ⅳ)mRNA含量检测和TNM分期程度具有相关性(P<0.05)。结论α3(Ⅳ)与肺癌的发生发展关系密切,FQ-RT-PCR检测α3(Ⅳ)mRNA的表达为肺癌转移、预后判断、临床治疗等奠定良好基础。     

实时荧光定量PCR方法检测急性髓系白血病FLT3基因mRNA的表达

[摘　要]　目的 构建检测急性髓细胞白血病FLT3基因mRNA表达的标准品重组质粒和荧光定量PCR方法，为进一步研究FLT3基因表达与急性髓细胞白血病的关系奠定基础。方法 利用引物设计软件设计出扩增FLT3基因的引物和特异性荧光探针。提取K562细胞株总RNA，经RT-PCR 扩增，产物纯化后与pUCm-T Vector连接，转化到大肠杆菌DH5α，筛选得到标准品的质粒FLT3P。 建立荧光定量PCR 检测 FLT3基因技术方法，建立标准曲线并检测15例初治AML患者。结果 重组质粒进行荧光定量PCR 扩增出现强烈的荧光值增长，表明FLT3 cDNA已成功克隆。以109～105copies/μl不同稀释水平的标准品进行荧光定量PCR 扩增, 所获得的Ct 值与标准品浓度的对数存在良好线性关系, 标准曲线回归系数为0.9998 。AML病例 FLT3表达水平显著高于正常对照组（p=0.017）， 且不同病例的表达水平存在较大差异。结论 成功构建用于定量检测FLT3 mRNA表达得荧光定量PCR的标准品和技术方法; AML病例 FLT3表达水平显著增高。     

非小细胞肺癌VEGFR-2与XAGE-1b基因表达相关性研究

目的探讨非小细胞肺癌中血管内皮生长因子受体-2（VEGFR-2）与肿瘤-睾丸抗原XAGE-1b基因表达的相关性。方法从30例非小细胞肺癌患者肿瘤组织中提取总RNA、RT—PCR反应扩增XAGE-1b基凶、定量RT—PCR检测VEGFR-2表达水平．分析二者表达的相关性以及与临床特征的相关性。结果30例患者中，XAGE-1b表达阳性率为40％，61．1％的腺癌表达XAGE—1b，远高于非腺癌的8．3％（χ2=6．302，P=0．012）。XAGE．1b与VEGFR-2表达水平呈正相关（r=0．546，P=0．002）．XAGE—1b阳性患者的VEGFR-2表达水平偏高。多元回归分析显示，病理类型（比值比0．072，95％可信区间0．007-0．785，P=0．031）和VEGFR．2表达水平（比值比14．765，95％可信区间1．274～171．144，P=0．031）是XAGE-1b表达的影响因素。XAGE-1b表达阳性与阴性、VEGFR．2表达高与低患者的生存时间差异均无统计学意义（Log-rankP=0．416、P=0．384）。结论非小细胞肺癌中VEGFR-2与XAGE-1b基因表达呈正相关．XAGE-1b表达阳性并且VEGFR-2高表达的患者可能是免疫疗法与抗血管生成疗法联合治疗的合适人群。     

实时荧光定量PCR和RT-PCR检测宫颈癌细胞株HPV-16 E6和E7基因的实验研究

目的 探讨实时荧光定量PCR和RT-PCR检测HPV-16 E6和E7基因的实验方法.方法 将制备的含HPV-16 E6和E7基因的质粒作为标准品,建立实时荧光定量PCR和RT-PCR方法,分别对3种宫颈癌细胞株进行HPV-16 E6和E7基因的DNA和RNA拷贝数的定量检测.结果 建立的实时荧光定量PCR标准曲线相关系数大于0.99,PCR效率在90%以上.HPV-16 E6和E7基因的DNA和RNA拷贝数在宫颈癌细胞株 CaSki、SiHa和HeLa中从高到低依次是CaSki＞SiHa＞HeLa.结论 用实时荧光定量PCR和RT-PCR方法研究HPV-16 E6和E7基因的DNA和RNA含量结果可靠,为进一步研究两个基因与宫颈病变的关系奠定了基础.     

嗅球蛋白1在肺癌组织中的表达及可能意义

目的通过对比嗅球蛋白1(OLFM1)基因及其蛋白在肺癌组织及其配对的正常肺组织中的表达情况,探讨其表达与肺癌发生的相互关系。方法分别采用半定量RT-PCR法和荧光实时定量PCR检测21例肺癌患者的原位肺癌组织及其配对正常肺组织中OLFM1基因的相对表达变化和相对表达量,应用免疫组织化学染色观察OLFM1蛋白在组织中的表达。结果OLFM1基因在8例肺鳞癌原发灶中的表达相对于其配对正常组织中的表达显著下调约2.2倍(P=0.028);OLFM1蛋白定位于肺腺癌细胞胞质,仅在肺腺癌表达(P<0.001),其表达在不同年龄、性别、肿瘤分期、分化程度间差异均无统计学意义(P>0.05)。结论OLFM1基因肺鳞癌中表达下调,可能是一个潜在的分子标志;而OLFM1蛋白仅在肺腺癌表达,在肺鳞癌和正常组织中均不表达,这提示不同病理组织类型肺癌的发生可能有不同的发生机制和途径。     

酒精性肝病模型小鼠胆红素清除通路变化以及组成型雄烷受体的表达的研究

目的 研究酒精性肝病模型小鼠胆红素清除通路变化以及胆红素代谢调控因子组成型雄烷受体的表达情况.方法 采用Lieber-DeCarli酒精饲料以及等卡热的对照饲料予小鼠自由饮食4周构建酒精性肝病小鼠模型.检测总红素、直接胆红素水平,采用Western blot法、RT-PCR、免疫荧光法分析胆红素摄取转运体OATP1a1、OATP1a4、OATP1b2,葡萄糖醛酸转移酶UGT1A1、泵出转运体MRP2以及胆红素代谢调控因子CAR的表达.结果 慢性酒精摄入提高血浆胆红素水平,在转录及翻译水平诱导UGT1A1表达、下调MRP2以及OATP1a1.此外,酒精性肝病小鼠肝核蛋白CAR表达明显抑制而肝总蛋白CAR未见明显改变.结论 慢性酒精摄入选择性抑制胆红素清除通路,伴随胆红素代谢调控因子CAR易位损伤.     

细胞周期蛋白25A在非小细胞肺癌中的表达及与Let-7关系

目的 明确细胞周期蛋白25A（CDC25A）在NSCLC组织中的表达及与临床病理特征的关系,并探讨其与miRNA let-7a1、let-7c表达的相关性。方法 收集53例肺组织手术标本,其中包括NSCLC组织44例,收集其癌组织和癌旁正常组织（病理证实）,和良性肺疾病组织9例。免疫组化Elivision法检测CDC25A蛋白的表达;用Trizol法提取总RNA,采用荧光定量RT-PCR检测CDC25A mRNA的表达,加尾法荧光定量RT-PCR检测let-7a1和let-7c mRNA的表达。结果 CDC25A蛋白表达的阳性率在NSCLC组织明显高于癌旁正常组织和良性肺疾病组织（P<0.05）。NSCLC组织中CDC25A蛋白的表达与年龄、性别、病理类型、肿瘤分化程度、临床分期无关（P>0.05）,与吸烟、淋巴结转移相关（P<0.05）。CDC25A mRNA在NSCLC组织中的表达量明显高于癌旁正常组织和良性肺疾病组织（F=6.33,P<0.05）,在癌旁正常组织和良性肺疾病组织中表达无明显差异（P>0.05）。Pearson 相关分析显示CDC25A与let-7c在NSCLC组织和癌旁正常组织中表达均呈明显负相关（r 癌组织=-0.42,r 癌旁正常组织=-0.40）,与let-7a1之间无明显相关。结论 CDC25A在NSCLC组织表达水平明显增高,且与let-7c表达呈明显负相关,推测CDC25A可能是let-7c的下游靶基因。     

IL-10对miRNA-125b表达和非小细胞肺癌细胞增殖与凋亡的影响

目的:研究白细胞介素10(IL-10)对miRNA-125b表达和非小细胞肺癌增殖与凋亡的影响.方法:采用实时荧光定量PCR检测IL-10刺激肺癌细胞系NCI-H460各微小RNA(miRNA)的表达水平变化;利用细胞计数试剂盒(CCK8)比较IL-10刺激后和恢复miRNA-125b表达后对细胞增殖的影响;流式细胞术检测IL-10刺激后和恢复miRNA-125b表达后对细胞凋亡的影响;荧光定量PCR技术验证miRNA-125b在非小细胞肺癌组织和癌旁组织中的表达情况.结果:IL-10刺激NCI-H460细胞后,miRNA受到调控的程度不同,所测21种miRNA中,miRNA-125b下调程度最大;miRNA-125b恢复表达后,抑制了由IL-10刺激引起的细胞增殖(P<0.01),促进了细胞凋亡;miRNA-125b在非小细胞肺癌组织中的表达显著低于癌旁组织(P<0.01).结论:在IL-10诱导的细胞增殖中,miRNA-125b起到抑癌的作用,可作为未来治疗非小细胞肺癌的药物研发对象.     

实时荧光定量RT-PCR检测人外周血单个核细胞中FOXP3 mRNA的表达

目的：建立实时荧光定量逆转录-多聚酶链反应（real-time fluorescence quantitative RT-PCR）检测人外周血单个核细胞中FOXP3 mRNA的方法,并研究其与CD4＋CD25＋Treg细胞活性相关性。方法：提取人外周血单个核细胞总RNA,将mRNA逆转录成cDNA,以β-actin为内参照,实时荧光定量RT-PCR检测29例哮喘患儿及24例同龄对照FOXP3 mRNA的相对表达量,采用融解曲线和琼脂糖电泳鉴定PCR产物特异性;同时采用流式细胞技术检测CD4＋CD25＋Treg细胞含量,分析两者相关性。结果：哮喘患儿组CD4＋CD25＋Treg细胞百分率明显低于同龄对照组,P〈0.01;FOXP3 mRNA的表达也显著降低,P〈0.05;FOXP3和β-actin的融解曲线分析表明均仅有单一峰,Tm值分别为82.4℃和87.8℃;琼脂糖电泳显示都仅有单一扩增产物。结论：应用SYBR GreenⅠ实时荧光定量RT-PCR技术检测FOXP3 mRNA表达水平简便易行、结果稳定可靠。初步结果证实,外周血CD4＋CD25＋Treg细胞数量和FOXP3 mRNA表达有相同的趋势,存在一定的相关性。     

风疹病毒RNA Taq Man实时荧光定量RT-PCR方法及参考标准的建立

目的建立风疹病毒RNA TaqMan实时荧光定量RT-PCR方法,制备风疹病毒RT-PCR扩增子作为该方法的参考标准品。方法设计引物与探针,优化PCR条件,建立风疹病毒RNA实时荧光定量RT-PCR方法,并制备风疹病毒RT-PCR扩增子作为该方法的参考标准品。结果制备的风疹病毒特异性扩增子参考标准品为503 bp的片断,原液浓度为2.75×109copies/μl,纯度为92%;采用该特异性扩增子参考标准品建立的标准曲线相关系数r为-0.9993（r2=0.9986）,P〈0.001。结论本研究建立的风疹病毒特异性扩增子参考标准品稳定性好,纯度高;特异性扩增子参考标准品浓度的对数值与Ct值之间具有良好的线性关系,证实了本研究建立的风疹病毒RNATaqMan实时荧光定量RT-PCR方法定量的准确性。因而,建立的风疹病毒RNA实时荧光定量RT-PCR方法简便快捷、定量准确,可用于临床标本中风疹病毒RNA的定量检测。     

成纤维细胞生长因子受体各亚型与小鼠肺纤维化及衰老的关系

目的观察成纤维细胞生长因子受体（FGFR）各亚型与肺组织的纤维化及衰老之间的关系。方法应用荧光定量聚合酶
链反应方法,分别检测不同鼠龄的小鼠肺组织FGFR1-4的表达水平;同时,采用常规病理切片（HE染色和Masson染色）观察不
同鼠龄小鼠肺组织的纤维化状况。结果（1）FGFR各亚型在小鼠肺组织中表达水平不均匀,FGFR2的含量高于其他几个亚型;
（2）8月龄小鼠肺组织中FGFR亚型表达水平均显著低于5周龄小鼠肺组织中FGFR的表达;（3）8月龄的小鼠肺组织表现出肺纤
维化的变化。结论小鼠肺组织中FGFR水平的下降可能与年龄的增加相关;不同年龄组均以FGFR2的含量为高;小鼠肺组织
随着鼠龄增加呈现不同程度的纤维化,可能与FGFR的表达下降相关;提示FGFs/FGFR可能参与衰老的发生及肺纤维化调节。
     

高转移人肝癌细胞系转移相关因子的表达活性

目的 观察分析新建立的人肝癌转移细胞系（ＭＨＣＣ９７）转移相关因子ｍＲＮＡ和蛋白表达水平,以探讨其转移的可能机制。方法 利用裸鼠人肝癌转移模型（ＬＣＩ－Ｄ２０）的瘤组织,通过体外２获得首株高转移人肝癌细胞系,除对其基本生物学特性进行观察外,还采用逆转录－聚合酶链反应（ＲＴ－ＰＣＲ）和免疫组织化学技术（ＡＢＣ法）观察转移相关因子在ＭＨＣＣ９７细胞及其裸鼠肝内移植瘤和肺转移灶中的表达水平。结果 该细胞