TNFα-Tumstatin45-132分子构建、生物学特征预测和活性验证

目的 构建人重组TNFα-Tumstatin45-132融合蛋白的表达载体，预测接头的合理性和可行性．并对融合蛋白活性进行验证。方法 采用基因融合序列重叠延伸（s0E）策略，构建新型TNFα-Tumstatin45-132表达载体；应用核酸和蛋白质序列软件Antheprot和PepTool对融合基因及接头部位翻译后在二级结构水平上的柔性、抗原性、亲水性等生物特性加以预测；用细胞毒试验和内皮细胞增殖试验测定表达的融合蛋白活性。结果 构建新型重组TNFα-Tumstatin45-132融合基因．经DNA测序证实与设计完全一致；TNFa-Tumstatinml32融合基因的氨基酸序列经软件分析，并与TNFα和Tumstatin45-132单独分析的结果比较，未出现新的抗原性，亲水性没有改变，接头部位具有很低的抗原性，接头部位呈中性；表达的融合蛋白经证实具有杀伤L929细胞和抑制ECV304细胞增殖的作用。结论 通过计算机软件对TNFα-Tumstatin45-132融合蛋白的预测，并与TNFα和Tumstatin45-132分别对比分析，有利于合理设计融合蛋白，最大程度地保留TNFα和Tumstatin45-132各自的生物活性和功能；生物活性分析证实设计具有一定的科学性和合理性。     

心型脂肪酸结合蛋白的测定及临床意义

近年来 ,急性心肌梗死 (ＡＭＩ)的标志物研究取得很大进展。血清酶学指标在ＡＭＩ诊断、预后、疗效评估等方面的应用价值已被公认 ,肌红蛋白 (ＭＢ)、心肌钙蛋白Ｔ(ｃＴｎＴ)和心肌钙蛋白Ｉ(ｃＴｎｌ)在临床应用也十分广泛。最近 ,又有一个ＡＭＩ的标志蛋白—心型脂肪酸结合蛋白 (ｈｅａｒｔｆａｔｔｙａｃｉｄ ｂｉｎｄ ｉｎｇｐｒｏｔｅｉｎ ,Ｈ ＦＡＢＰ)受到重视和关注 ,本文对其理化性质、检测方法及在ＡＭＩ诊断和心肌损伤评价中的应用作一综述。1　ＦＡＢＰ理化性质脂肪酸结合蛋白 (ＦＡＢＰ)是一组多源性的小分子细胞内蛋白质 ,分子…     

4种血清标志物在类风湿关节炎的诊断、疾病活动度的判断及骨侵蚀的预测的应用价值

目的 研究葡萄糖6 磷酸异构酶( GPI)、类风湿因子( RF)、抗角蛋白抗体( AKA)、抗环瓜氨酸肽( CCP)抗体4种血清标志物在类风湿关节炎( RA)疾病的诊断、疾病活动度的判断及骨侵蚀的预测方面的应用价值. 方法 选取193例RA患者, 158 例非 RA 患者, 98 例健康体检者. 采用ELISA法定量检测GPI和抗CCP抗体浓度水平,免疫透射比浊法定量检测RF浓度水平,采用间接免疫荧光法定性检测AKA. 结果 血清GPI、RF、抗CCP抗体、AKA阳性率在RA组与非RA组及健康对照组比较差异均有统计学意义( P<0. 05);血清GPI、RF、抗CCP抗体浓度水平在RA组显著高于非RA组及健康对照组,差异有统计学意义( P<0. 05 ).血清GPI、RF浓度水平在RA活动组浓度显著高于非活动组,差异有统计学意义( P<0. 05 );血清抗CCP抗体浓度水平在RA活动组与非活动组比较差异无统计学意义. 血清GPI、RF浓度水平在RA骨侵蚀组与非骨侵蚀组比较差异无统计学意义;血清抗CCP抗体浓度水平在RA骨侵蚀组显著高于非骨侵蚀组,差异有统计学意义( P<0. 05 ). 血清AKA阳性率在RA活动组与非活动组比较,差异无统计学意义;在RA骨侵蚀组与非骨侵蚀组比较,差异有统计学意义( P<0. 05). 结论 血清 GPI、RF、抗 CCP 抗体、AKA 的水平对RA的诊断起到重要作用,血清GPI、RF浓度水平与RA患者疾病活动度有关,血清抗CCP抗体浓度水平可以预测RA患者骨侵蚀,RA患者血清AKA阳性可能与骨侵蚀有关.     

重组人tumstatin的原核生物表达和多克隆抗体制备

目的原核生物表达可溶性的tumstatin抗原并制备相应的多克隆抗体。方法利用原核表达载体pMAL-tumstatin在大肠埃希菌BL21中表达tumstatin,经Amylose Resin亲和层析柱和Q Sepharose Fast Flow柱纯化tumstatin,以纯化蛋白免疫新西兰兔,获得抗tumstatin多克隆抗体。利用western blot和ELISA法对多克隆抗体进行特异性和效价检测。结果tumstatin蛋白表达成功。SDS-PAGE分析表明其为可溶性表达。成功获得了tumstatin纯品及兔抗tumstatin多克隆抗体。ELISA法表明多克隆抗体效价>5 000。western blot检测证明多克隆抗体的特异性良好。结论成功表达、纯化tumstatin蛋白,并获得高特异性、高效价兔抗tumstatin多克隆抗体,为其在临床免疫学检测应用奠定了基础。     

血小板对人肺癌细胞株A549凋亡的影响及机制初探

目的探讨血小板(PLT)对肺癌细胞株A549的影响及其可能的机制。方法通过流式细胞术检测PLT对A549细胞的凋亡作用;Westernblot检测PLT和A549细胞共培养后A549细胞中ERK1/2、JNK、p-ERK、p-JNK、MMP–2、M M P–9、 B c l–2、 B a x蛋白的表达情况。结果应用流式细胞术的检测结果发现,血小板抑制A 549细胞的凋亡并能阻止化疗药物吉西他滨诱导的A549细胞凋亡。Westernblot结果显示PLT和A549细胞共培养48h后,A549细胞中ERK1/2、JNK、p-E R K、 p-J N K、 M M P-2、 M M P-9、 B c l-2蛋白表达明显增加, B a x蛋白表达明显降低。结论血小板可增加A 549细胞中ERK1/2、JNK、p-ERK、p-JNK磷酸化,增加MMP-2、MMP-9和Bcl-2蛋白的表达;降低Bax蛋白表达,并抑制肺癌细胞株A549的凋亡。血小板可抑制A549细胞的凋亡,且与血小板的浓度呈正相关。     

Tumstatin-EGFP真核表达载体构建及稳定转染CHO细胞系的建立

目的 构建重组tumstatin-增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的分泌型真核表达载体质粒,建立稳定转染的中国仓鼠卵巢细胞系(CHO-K1).方法 利用重叠多聚酶链反应(PCR)技术从pGEM-T/STL质粒和pEGFP-C2质粒中扩增出STL-EGFP,用DNA重组技术将片段定向插入pIRESneo3质粒中,经酶切和序列验证正确后,用lipofectamine 2000转染CHO-K1细胞,通过G418筛选建立稳定转染的CHO细胞系,用逆转录-PCR、Western blot检测tumstatin-EGFP的表达,用倒置荧光显微镜观察绿色荧光蛋白的表达.结果 重组真核表达载体正确构建并在CHO细胞获得稳定表达,tumstatin-EGFP基因整合入细胞基因组DNA,培养液上清有融合蛋白tumstatin-EGFP的分泌,绿色荧光蛋白的表达高达95%以上.结论 成功构建了质粒PIRESneo3-STL-EGFP,获得稳定表达tumstatin-EGFP的细胞系.     

肺癌组织α3(Ⅳ)基因表达及其临床研究

目的利用Taqman技术,建立荧光定量逆转录聚合酶链反应(FQ-RT-PCR)方法,对肺癌组织中Ⅳ型胶原α3链[α3(Ⅳ]]mRNA表达进行定量及蛋白表达水平检测,评价其临床应用价值。方法在α3(Ⅳ)基因NC1结构域编码序列设计一对引物和一条Taqman探针;优化反应体系的条件,以不同质粒DNA含量为标准品和其循环阈值(Ct值)制作标准曲线,检测肺癌组织中α3(Ⅳ)mRNA含量;并对本方法进行方法学评价。Western blot法检测tumstatin蛋白表达情况。结果成功建立了α3(Ⅳ)基因mRNA表达实时荧光定量PCR检测方法,检测灵敏度为800拷贝/μl;在103～108拷贝/μl之间与Ct值具有很好的线性关系;PCR扩增效率为99.4%;肺癌组织中α3(Ⅳ)mRNA表达定量检测发现,48例肺癌患者肺癌组织α3(Ⅳ)mRNA组含量显著低于癌旁组织,差异有统计学意义(P<0.01),肺癌组织中tum-statin蛋白表达下调/缺失率显著高于癌旁组织(P<0.01)。临床监测发现肺癌患者癌组织α3(Ⅳ)mRNA含量检测和TNM分期程度具有相关性(P<0.05)。结论α3(Ⅳ)与肺癌的发生发展关系密切,FQ-RT-PCR检测α3(Ⅳ)mRNA的表达为肺癌转移、预后判断、临床治疗等奠定良好基础。     

细菌双杂交系统在细胞外蛋白质相互作用中的应用

目的:探索应用细菌双杂交系统在细胞外蛋白质之间相互作用的可行性.方法:应用Stratagene BacterioMatch two hybrid system,以pTRG构建编码TRAIL细胞外可溶性区域序列融合表达质粒;以pBT构建编码DR4、DR5、OPG等的细胞外区域序列融合表达质粒.重组质粒分别相应共转化报告菌株XL1-Blue MRF,报道基因产物以抗羧苄青霉素和β-半乳糖苷酶活性作为转录激活的指标.结果:pTRG-TRAIL与pBT-DR4,pTRG-TRAIL与pBT-DR5及对照组分别共转化后在高浓度羧苄青霉素(500 μg/ml以上)筛选下宿主菌呈转录激活状态,pTRG-TRAIL与pBT-OPG 组共转化后在低浓度羧苄青霉素(250 μg/ml以下)筛选下宿主菌呈转录激活状态,用X-Gal-PETG平皿可以进一步验证阳性克隆.对照组pTRG-TRAIL与pBT-LGF2,pBT-DR4、pBT-DR5或pBT-OPG与pTRG-Gal11 4组共转化后呈阴性.结论:所用的双杂交序列皆为编码这些蛋白质的细胞外区域,而这些蛋白质本身的相互作用已有其他报道验证,所以细菌双杂交系统可以用于细胞外蛋白质的相互作用研究.     

肿瘤血管生成抑制因子tumstatin的研究进展

肿瘤的生长和转移都依赖于新生血管的生成,通过抑制血管生成而切断肿瘤营养供给的方法一直是肿瘤生物治疗的研究热点。内源性新生血管抑制剂靶向性治疗肿瘤具有不产生耐药性、无毒副作用以及广谱性,故应用前景良好。肿瘤抑素(tumstatin)是最新发现的来源于基底膜Ⅳ型胶原的肿瘤血管生成的内源性抑制因子。本文就tumstatin在肿瘤生长、转移中的作用,及在肿瘤诊断研究中的意义、抗肿瘤血管生成基因治疗研究中的进展进行综述。