WWOX基因慢病毒载体的构建及其在卵巢癌细胞中的表达

目的：构建及鉴定WWOX基因慢病毒载体,观察WWOX基因在人卵巢癌PEO1细胞株中的表达,为进一步研究WWOX基因的作用机制及其功能奠定基础。方法：采用PCR技术从克隆质粒模板中获得全长WWOX基因,将WWOX基因亚克隆到慢病毒载体PCDH—CMV—MCS-EF1-copGFP中,构建慢病毒载体表达质粒PCDH—WWOX,通过双酶切验证后,慢病毒表达质粒与慢病毒包装质粒pPACKH1-GAG,pPACKH1-REV,Pvsv-G共转染293T细胞,获得携带WWOX基因及EGFP基因的重组慢病毒Lenti WWOX,并转染靶细胞人卵巢癌PEO1细胞株。通过RT—PCR和Western Blot验证Lenti WWOX在PEO1细胞株中的表达。结果：测序结果显示成功构建重组慢病毒载体表达质粒PCDH—WWOX;表达质粒与辅助包装质粒共转染包装细胞293T后能产生慢病毒颗粒并能有效感染靶细胞PEO1,转导效率约为60％,有WWOX基因mRNA和蛋白水平的高表达。结论：本实验成功构建了携带WWOX基因慢病毒表达载体,包装成病毒后能有效感染卵巢癌PEO1细胞。     

人T-bet基因的克隆及序列分析

目的：克隆人T-bet基因全长编码区的cDNA，并进行豁定和测序分析，为从转录水平研究Th1／Th2平衡及其与免疫相关性疾病发生发展的关系奠定基础。方法：采用RT-PCR方法，从人外周血淋巴细胞获得T-bet基因的cDNA；连接至pGEM-Teasy载体，导入大肠杆菌DH5α并选择阳性克隆；应用M13F／R通用引物进行双向反应测序，以作序列鉴定。结果：扩增得到的T-bet基因cDNA全长1670 bp，包括编码区1607 bp，编码530个氨摹酸残基，与Genbank中发表的序列完全一致。结论：获得了人T-bet基网的克隆，为进一步研究其生物学功能构建了基础平台，为寻找多种免疫性疾病的有效治疗提供新思路。     

基于CRISPR/Cas9技术构建严重联合免疫缺陷小鼠的实验研究

目的：应用CRISPR/Cas9技术靶向敲除编码小鼠T、B细胞的Rag2基因及编码NK细胞的IL2rg基因,构建T、B细胞及NK细胞联合免疫缺陷小鼠。方法：根据Genbank报道的Rag2及IL2rg基因序列,分别针对其外显子设计25bp左右的sgRNA并进行合成, sgRNA退火后克隆入pX330载体。Rag2-sgRNA、IL2rg-sgRNA及Cas9重组质粒体外转录为mRNA后显微注射入BALB/c小鼠受精卵细胞,受精卵细胞移植到受体动物获得子代小鼠,首建鼠（F0）与野生型小鼠交配获得F1代小鼠,突变的F1代小鼠互交后筛选F2代纯合子小鼠。通过基因测序、流式细胞术及接种人源性肿瘤细胞系方法检测子代小鼠基因型和表型。结果：成功构建了Rag2-sgRNA、IL2rg-sgRNA重组质粒并对其进行了体外转录,mRNA显微注射并移植后获得57只F0小鼠。连续交配后,获得F2代纯合子小鼠。序列分析表明子代小鼠中IL2rg有两个基因型,分别是10bp和11bp的缺失突变;而Rag2只有一个基因型,为8bp的缺失突变。与野生型BALB/c小鼠相比,小鼠外周血中CD3、B220及NKp46阳性细胞数量明显降低。接种人乳腺癌细胞系SKBR-2HL后,肿瘤生长良好,且随着时间延长肿瘤组织逐渐增大。结论：利用CRISPR/Cas9技术可有效实现BABL/c小鼠体内Rag2、IL2rg基因突变,并导致小鼠T、B及NK细胞功能异常。     

带信号肽人血管内皮生长因子基因 VEGF121及VEGF165载体的克隆

目的克隆及构建带信号肽人血管内皮生长因子基因VEGF121及VEGF165表达载体.方法对正常引产胎儿肺组织的总RNA进行逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR),克隆入T载体,测定扩增片段序列,进而克隆入表达质粒pcDNA3 1-,酶切鉴定重组子.结果用一对引物(5'引物为-21～7 bp,3'引物为554～576 bp)可扩增出两个条带,短条带为VEGF121(487 bp),长条带经筛选可得到两个片段,一为正常的VEGF165(619 bp),另一个为新的VEGF mRNA"异常"剪切片段测序结果显示,此"异常"剪切片段扩增长度为639 bp,同样为VEGF165全长核苷酸序列,但在VEGF165的第3和第4外显子之间插入了长度为20 bp的片段.经序列检索发现20 bp的插入序列为滞留的第3内含子终末序列,含内含子剪切信号.结论克隆出带信号肽人血管内皮生长因子基因VEGF121及VEGF165表达载体,同时在正常引产胎儿的肺组织中可能发现了一种新的VEGFmRNA可变剪切形式.     

WWOX和p73基因在急性髓细胞白血病中的表达

目的研究WWOX(WW domain-containing oxidoreductase)和p73基因在急性髓细胞白血病(AML)中异常表达的临床意义及其机制。方法收集AML患者骨髓58例,非白血病患者骨髓31例作为对照组,采用RT-PCR检测WWOX和p73基因mRNA的表达情况、甲基化特异性PCR检测WWOX基因启动子区和p73基因第一外显子区的甲基化情况。结果 58例AML患者中,28例WWOX基因mRNA阳性表达,30例p73基因mRNA阳性表达;23例WWOX基因启动子区存在甲基化,21例p73基因第一外显子区存在甲基化。对照组中WWOX与p73基因mRNA均有表达29例,均未见甲基化现象。WWOX和p73基因在AML中mRNA的表达以及甲基化状态与对照组比较差异均有统计学意义(P<0.05)。结论 WWOX与p73基因的甲基化可能导致其基因的沉默,使其mRNA表达减少或缺失,在AML的发病机制中起一定作用,WWOX与p73基因甲基化的检测对AML的诊断和疗效有一定意义。     

The expression of WWOX and p73 in acute myeloid leukemia

目的 研究WWOX(WW domain-containing oxidoreductase)和p73基因在急性髓细胞白血病(AML)中异常表达的临床意义及其机制.方法 收集AML患者骨髓58例,非白血病患者骨髓31例作为对照组,采用RT-PCR检测WWOX和p73基因mRNA的表达情况、甲基化特异性PCR检测WWOX基因启动子区和p73基因第一外显子区的甲基化情况.结果 58例AML患者中,28例WWOX基因mRNA阳性表达,30例p73基因mRNA阳性表达;23例WWOX基因启动子区存在甲基化,21例p73基因第一外显子区存在甲基化.对照组中WWOX与p73基因mRNA均有表达29例,均未见甲基化现象.WWOX和p73基因在AML中mRNA的表达以及甲基化状态与对照组比较差异均有统计学意义(P＜0.05).结论 WWOX与p73基因的甲基化可能导致其基因的沉默,使其mRNA表达减少或缺失,在AML的发病机制中起一定作用,WWOX与p73基因甲基化的检测对AML的诊断和疗效有一定意义.     

带信号肽人血管内皮生长因子基因VEGF121及VEGF165载体的克隆

目的 克隆及构建带信号肽人血管内皮生长因子基因VEGF121及VEGF165表达载体。方法 对正常引产胎儿肺组织的总RNA进行逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR），克隆入T载体，测定扩增片段序列，进而克隆入表达质粒pcDNA3.1^-,酶切鉴定重组子。结果 用一对引物（5′引物为-21-7bp,3′引物为554-576bp)可扩增出两个条带，短条带为VEGF121（487bp)，长条带经筛选可得到两个片段，一为正常的VEGF165（619bp)，另一个为新的VEGFmRNA“异常”剪切片段。测序结果显示，此“异常”剪切片段扩增长度为639bp，同样为VEGF165全长核苷酸席子邓列，但在VEGF165的第3种和4外显子之间插入了长度为20bp的片段，经序列检索发现20bp的插入序殓为滞留的第3内含子终末序列，含内含子剪切信号。结论 克隆出带信号肽人血管内皮生长因子基因VEGF121及VEGF165表达载体。同时在正常引产胎儿的肺组织中可能发现了一种新的VEGFmRNA可变剪切形式。     

脆性位点基因WWOX mRNA在肝细胞癌中的表达及临床病理意义

目的 检测WWOX野生型mRNA及其异常转录剪接体在肝细胞癌中的表达情况,并分析其临床病理意义.方法 采用Real-time RT-PCR和RT-PCR方法检测44例肝细胞癌(HCC)、相应癌旁肝组织和5例正常肝组织中WWOX野生型mRNA及转录剪接体Variant1、Variant4及Variant6的表达,同时分析...     

一种新的人血管内皮生长因子基因的剪切体(英文)

目的探索人胚胎肺组织中是否存在一种新的血管内皮生长因子(VEGF)基因可变剪切形式。方法对1例4月龄引产胎儿肺组织的总RNA进行逆转录聚合酶链反应、克隆并测定扩增片段的序列。结果用一对引物(引物5’端-21~7 bp,3’端554~576 bp)可扩增出3条片段,一条为长度正常的VEGF16(5619 bp)全长序列,另一条为长度正常的VEGF12(1487 bp)全长序列,第三条为新的VEGF mRNA异常剪切片段。测序检测显示,此扩增片段长度为639 bp,同样为VEGF165全长核苷酸序列,但在VEGF165的第3和第4外显子之间插入了长度为20 bp的碱基片段。序列分析显示此插入序列为滞留的第Ⅲ内含子终末序列,含内含子剪切信号。上述移码突变导致VEGF基因阅读框架发生改变,在第4外显子中游出现终止密码,故仅含VEGF165外显子1~3及4部分序列,在蛋白水平上可能编码含97个氨基酸的新肽链。结论在一引产胎儿的肺组织中发现了新的VEGF mRNA可变剪切形式,其生物学意义有待进一步研究。     

肝癌相关基因的分子克隆和可变剪切分析

目的: 获取肝癌相关基因(hepatoma associated gene,HTA)的mRNA分子全长序列并对其可变剪接进行分析,检测其转录本在各肝癌细胞系中的表达,为进一步研究该基因在肝癌发生、发展中的作用奠定基础。方法: 用3'RACE 和5'RACE方法扩增HTA基因的全长序列并对其序列信息和可变剪接进行扩增和测序分析,用Northern印迹检测该基因转录本在不同肝癌和正常肝细胞系中的表达。结果: HTA基因全长序列为1414 bp,经分析该序列包含3个外显子,2个内含子,其中2号内含子在可变剪接中被作为外显子表达。Northern印迹显示HTA基因1.7 kb转录本和1.4 kb转录本均表达于恶性肝癌细胞系,而不表达于正常细胞系。结论: 成功获得了HTA基因的全长序列并对其可变剪接进行了分析,2个大小不同的转录本均在肝癌细胞系中特异性表达,作为一个肝癌相关基因值得进一步深入研究。     

9—顺维甲酸对人肺腺癌细胞维甲酸受体转录的影响

目的：观察9－顺维甲酸（9-cis-RA)处理前后人肺腺癌细胞株PG和A549维甲酸受体（RARs)及维甲类X受体（RXRs）不同时相mRNA转录水平的表达。方法：用RT－PCRT相对定量检测人肺腺癌细胞株PG和A549加9-cis-RA前后RARs和RXRs mRNA转录水平。结果：应用9-cis-RA后，两细胞株的RARα和RARβ mRNA转录水平较对照组明显增高，其余受体转录无明显变化。结论：受体RARα和RARβ可能与9-cis-RA对两细胞株的生长抑制和诱导凋亡作用有密切关系。     

Zebularine对HL-60及K562细胞株WWOX基因甲基化的影响

目的:探讨去甲基化药物1-(β-D-呋喃核糖苷)-1,2-二氢嘧啶-2-酮(Zebularine,Zeb,折布拉林)处理HL-60及K562细胞后WWOX甲基化水平的变化,分析Zeb在白血病治疗中的意义。方法:Zeb处理HL-60及K562细胞,以5-氮杂-2脱氧胞苷(5-Aza-CdR,地西他滨)作为阳性对照,MSP法检测WWOX基因启动子及第一外显子甲基化状态;QRT-PCR检测WWOXmRNA的表达,并分析不同细胞株药物处理组与处理前组甲基化情况与mRNA表达的关系。结果:1.药物处理前,K562细胞WWOX基因启动子甲基化PCR扩增出阳性条带,非甲基化扩增阴性;第一外显子甲基化PCR扩增阴性,而非甲基化PCR扩增出阳性条带;药物处理后启动子及第一外显子甲基化PCR均不能扩增出阳性条带,而非甲基化扩增阳性。2.Zeb与5-AzaCdR处理前后,HL-60细胞WWOX基因启动子及第一外显子甲基化PCR扩增均阴性,非甲基化均扩增出阳性条带。3.经Zeb与5-Aza-CdR处理后,K562细胞WWOX基因mRNA表达升高,处理前后比较差异有统计学意义(P<0.05),不同浓度的Zeb处理组间比较差异有统计学意义(P<0.05)。4.Zeb与5-Aza-CdR处理前后,HL-60细胞WWOX基因mRNA表达差异无统计学意义(P>0.05)。结论:Zeb能够发挥去甲基化作用,上调K562细胞WWOX基因mRNA表达,具有浓度依赖性,对HL-60细胞WWOX基因mRNA表达无明显影响。     

人胚胎脑多巴胺D_2受体基因的克隆

为了克隆人多巴胺D2 受体 (D2 R)基因以用于帕金森病的治疗 ,从人胎脑中提取总RNA ,并逆转录成cDNA ;设计一对引物用PCR方法扩增目的cDNA片段 ,并将其重组于 pGEM T载体中 ,酶切鉴定插入片段后 ,进行全序列测定。结果表明从人胎脑纹状体扩增出至少 2种长度的cDNA片段 ,其中一个片段全长 1 4 4 5bp ,序列与GenBank(NM0 0 0 795 )登录的序列完全相同 ;另一片段为 1 30 5bp ,在第 6外显子开始处有 1 4 0bp的缺失 ,与已知的D2 R 3种转录体均不相同 ,可能为一种新的D2 R转录体。     

Sp1对HL-60细胞人端粒酶逆转录酶表达的调控

目的:探讨Sp1转录因子在人白血病细胞株HL-60中对人端粒酶逆转录酶(hTERT)基因表达的影响.方法:电泳迁移率分析(EMSA)hTERT启动子区(-116~-88 bp)是否存在Sp1结合位点.RT-PCR检测经普卡霉素处理的细胞hTERT mRNA表达.结果:hTERT启动子序列(-116~-88 bp)与核蛋白作用,出现DNA-核蛋白结合条带,普卡霉素抑制Sp1与此序列结合.普卡霉素浓度依赖性下调 hTERT mRNA表达,200 nmol/L组和100 nmol/L组均明显低于50 nmol/L组、25 nmol/L组和对照组(P<0.01).结论:Sp1与hTERT启动子区(-116~-88 bp)结合,转录激活hTERT表达.     

应用CRISPR/Cas9技术制备Vasohibin-2基因敲除小鼠模型及验证

目的:利用Cas9/RNA system gene targeting技术高效构建Vash2基因敲除小鼠模型?方法:根据Vash2基因序列,设计2对Vsah2基因的单链向导RNA(single-guide RNA,sgRNA)引物序列并克隆进入pU57-T7-GDNA载体?利用T7 RNA聚合酶体外转录sgRNA和Cas9 mRNA?将体外转录的gRNA/Cas9 mRNA显微注射入小鼠受精卵,通过PCR和基因测序对Vash2移码突变进行检测和鉴定?繁育Vash2基因敲除小鼠并分析后代突变情况?结果:顺利构建表达sgRNA载体并体外转录,成功将有活性的sgRNA和Cas9 mRNA直接注射入受精卵?基因测序鉴定获得5只F0代初建鼠?选取5号鼠与野生型鼠回交,得到F1代鼠,再相互交配得到F2代鼠?PCR显示F2代鼠Vash2基因移码突变,成功建立Vash2基因敲除小鼠模型并传代繁育? 结论:通过Cas9/RNA systemgene targeting技术可以成功制备Vash2基因敲除鼠模型,是用于Vash2研究的有效工具?     

稳定表达核仁素的H9C2细胞株的建立和鉴定

目的:建立稳定表达核仁素的H9C2大鼠心肌细胞株,为进一步研究核仁素在心肌细胞凋亡中的作用提供细胞模型.方法:将含有核仁素全长的质粒pCMV-Tag2B-Nuc用脂质体转染技术导入H9C2细胞,使核仁素在细胞内表达,用G418筛选出稳定表达核仁素的细胞株;用双酶切、DNA测序鉴定质粒,用RT-PCR及Western blot检测核仁素基因在靶细胞中的整合与表达.结果:经G418反复筛选的H9C2细胞株中,核仁素基因在mRNA及蛋白质水平表达均较野生型细胞及转空载体细胞升高.结论:用含核仁素全长的质粒转染H9C2大鼠心肌细胞,经筛选后可稳定表达核仁素.     

广西巴马小型猪α-1,3半乳糖转移酶基因真核表达载体的构建及鉴定

目的 通过RT-PCR扩增巴马小型猪GGTA1基因,分析其序列的结构特点并构建真核表达载体,为生产GGTA1基因沉默的广西巴马小型猪奠定基础.方法 根据NCBI上发布的猪α-1,3半乳糖转移酶基因cDNA序列(AF221508),设计合成一对含有 HindⅢ和BamHI酶切位点的特异性引物,以广西巴马小型猪肝脏组织总 RNA为模板进行RT-PCR,所得目的片段经纯化、克隆、鉴定和测序;将目的基因与pEGFP-N 1进行双酶切后连接构建真核表达载体pEGFP-GGTA1,通过测序,双酶切鉴定.结果 所克隆的广西巴马小型猪GGTA1基因存在缺失第五外显子(81-116) 的GGTA1序列,序列全长1 080 bp和未缺失第五外显子的GGTA1序列,全序列为1 116 bp.构建两个表达载体(缺失第五外显子 pEGFP-GGTA1-1、未缺失第五外显子pEGFP-GGTA1-2).结论 广西巴马小型猪GGTA1基因存在第五外显子缺失的现象,通过对GGTA1基因克隆序列进行分析以及构建两个真核表达载体,为后面在猪源PK-15细胞中对其进行表达鉴定以及巴马小型猪 α-1,3半乳糖转移酶基因的沉默实验奠定基础.     

EOLA1基因突变体的克隆和鉴定

目的 对ECV304细胞株EOLAI基因进行克隆测序以及mRNA水平检测。方法 采用RT-PCR扩增EOLAI基因片断，连接到T载体进行测序。结果 测序发现一种目的基因mRNA剪接突变体，其第3外显子起始部分比Genebank数据库相应序列多出19个碱基。RT-PCR显示剪接突变体与野生型EOLAI基因具有不同的表达水平和LPS反应性。结论 发现一个EOLA1基因剪接突变体，其生物学功能尚不清楚。     

β1整合素启动子荧光素酶报告基因载体的构建与鉴定

目的克隆β1整合素(CD29)启动子区基因全长序列,构建并鉴定β1整合素启动子全长序列荧光素酶报告基因载体pGL3-β1。方法以含β1整合素启动子基因全长序列的基因片段(2 735 bp)的重组pGEM-T easy载体为模板,用含有酶切位点的特异性引物扩增出整合素β1启动子基因全长序列1 756 bp,克隆至荧光素酶表达载体pGL3-basic,构建含正确目的基因的表达载体pGL3-β1,并NheⅠ、XhoⅠ酶切、PCR及测序鉴定;并以该质粒转染人表皮细胞株HaCaT进行活性检测。结果酶切、PCR及序列测定表明,克隆获得的1 756 bp与GenBank DNA序列数据库对比分析序列一致,插入方向正确;且pGL3-β1启动子在人表皮细胞株HaCaT中有明显转录活性。结论成功构建了β1整合素启动子基因全长序列荧光素酶报告基因载体,为下一步研究人β1整合素启动子的活性分析、基因表达调控机制及其信号转导通路等研究奠定基础。     

胃肠癌中FHIT基因的异常表达

的：探讨FHIT基因与胃肠肿瘤的关系。方法：采用RT-PCR及PCR产物直接测序法,检测了26例胃癌组织和30例大肠癌组织及其配对正常组织的FHIT基因。结果：7例(26．9％)胃癌组织和8例(26.7％)大肠癌组织存在异常FHIT转录本,而配对正常组织均无异常FHIT转录本;测序证实异常转录本缺失1～3个FHIT外显子。结论：异常FHIT转录本的表达是胃肠肿瘤发生中常见的和特有的改变;FHIT基因异常与胃肠肿瘤的发生和发展有关。