p16和p53基因及顺铂联用对胆管癌细胞系QBC939的生长抑制作用

目的：探索p16基因和p53基因及p16基因和顺铂（CDDP）联合应用对体内外胆管癌细胞系生长的抑制作用。方法：将重组体腺病毒p16（Ad-p16）和Ad-p53及Ad-p16和CDDP联合作用于人胆管癌细胞系QBC939，观察和分析其对体内外胆管癌细胞生长抑制作用及其机制，结果：Ad-p16在QBC939细胞中表达能抑制QBC939细胞的生长，与p53、CDDP联合应用能明显抑制QBC939细胞的生长，p16和p53基因诱导癌细胞发生G1期阻滞和细胞凋亡，CDDP能诱导癌细胞发生G2期阻滞和细胞凋亡；裸鼠皮下移植瘤模型瘤体内注射Ad-p16及腹腔内注射CDDP均能抑制QBC939肿瘤的生长，两者联合应用具有协同作用。结论：p16基因和p53基因及CDDP联合应用具有协同作用。     

转染反义寡核苷酸对人胆管癌QBC939细胞XIAP基因表达及细胞周期作用的实验研究

目的研究转染反义寡核苷酸（antisense oligodeoxynucleotide,ASODN）对人胆管癌细胞株QBC939细胞凋亡抑制蛋白基因（X-linked inhibitor of apoptosisprotein,XIAP）表达的抑制作用及对细胞周期凋亡的影响．方法脂质体介导ASODN瞬时转染QBC939细胞,荧光显微镜观察ASODN转染入细胞的情况,并计算转染率;RT—PCR检测转染前后XIAPmRNA表达的变化;流式细胞仪检测转染后细胞周期的变化和凋亡率．结果转染后24h可达到最佳的转染效果;ASODN组的XIAP基因水平明显低于对照组（P〈0．05）,流式结果显示转染后QBC939G0／G1期细胞高于阴性对照组,凋亡率高于对照组（P〈0．05）．结论脂质体介导转染ASODN能特异性地抑制QBC939细胞中的XIAP基因表达,使其发生G0／G1期阻滞,并诱导胆管癌细胞凋亡,有望成为胆管癌基因治疗新的靶点．     

SiRNA 抑制 p63 基因表达对胆管癌细胞增殖和侵袭的影响

构建SiRNA靶向p63载体,稳定导入胆管癌细胞QBC939后,观察细胞增殖和侵袭情况的改变。方法 荧光定量PCR检测胆管癌细胞株QBC939细胞中p63表达。构建针对p63的shRNA慢病毒载体,转染胆管癌QBC939细胞中,建立稳定表达shRNA-p63胆管癌细胞株。Western blot 检测干扰效率。噻唑蓝（MTT）和软琼脂集落形成实验检测细胞增殖的变化;Boyden小室检测细胞侵袭情况的改变。结果 p63基因显示在QBC939细胞中高表达。序列分析表明,重组到慢病毒载体中的shRNA序列正确。我们利用Western blot筛选了一个干扰p63表达效率为66.8%的单克隆细胞。p63表达降低不但能抑制细胞增殖体外能力,而且还能降低细胞侵袭能力。结论 p63在胆管癌QBC939细胞中高表达。SiRNA靶向抑制p63表达后,能明显降低细胞增殖和侵袭能力。     

SiRNA抑制p63基因表达对胆管癌细胞增殖和侵袭的影响

目的构建SiRNA靶向p63载体,稳定导入胆管癌细胞QBC939后,观察细胞增殖和侵袭情况的改变。方法荧光定量PCR检测胆管癌细胞株QBC939细胞中p63表达。构建针对p63的shRNA慢病毒载体,转染胆管癌QBC939细胞中,建立稳定表达shRNA-p63胆管癌细胞株。Western blot检测干扰效率。噻唑蓝(MTT)和软琼脂集落形成实验检测细胞增殖的变化;Boyden小室检测细胞侵袭情况的改变。结果 p63基因显示在QBC939细胞中高表达。序列分析表明,重组到慢病毒载体中的shRNA序列正确。我们利用Western blot筛选了一个干扰p63表达效率为66.8%的单克隆细胞。p63表达降低不但能抑制细胞增殖体外能力,而且还能降低细胞侵袭能力。结论 p63在胆管癌QBC939细胞中高表达。SiRNA靶向抑制p63表达后,能明显降低细胞增殖和侵袭能力。     

腺病毒介导的p27mt基因转染对肝癌细胞及裸鼠移植瘤的生长抑制作用

目的:研究携带突变型p27的重组腺病毒(Ad-p27mt)基因转染对肝癌的体内、外抑制作用,并探讨其抑癌机制。方法:⑴将Ad-p27mt转染人肝癌细胞SMMC-7721,Western blotting检测P27、Bcl-2、Bax的表达;流式细胞仪(FCM)观察Ad-p27mt对肝癌细胞生长抑制作用。⑵Ad-p27mt直接注射入人肝癌裸鼠移植瘤中,绘制肿瘤生长曲线,计算肿瘤生长抑制率。结果:Ad-p27mt转染肝癌细胞后,细胞增殖明显受抑制,G0/G1期细胞比例增加,P27表达增强,Bax/Bcl-2比例增高,采用Ad-p27mt基因治疗肝癌裸鼠移植瘤生长受抑制,肿瘤生长抑制率达57.09%。结论:Ad-p27mt基因转染对肝癌具有较显著的体内、外抑制作用和诱导凋亡作用,其机制是通过增强P27表达,使细胞产生周期阻滞,诱导凋亡的机理可能是上调Bax/Bcl-2比例所引起。     

nm23-H1基因转染对人胆管癌细胞系QBC939体外浸润能力的影响

目的：探讨nm23-H1基因转染对人胆管癌细胞系QBC939体外浸润能力的影响。方法：将含有全长nm23-H1 cDNA的真核表达载体通过脂腩体法转染人胆管癌细胞系。结果：转染成功的QBC939细胞，其nm23-Hl基因的mRNA、蛋白表达明显增加，转染nm23-H1基因的胆管癌细胞体外浸润能力下降，穿越matrigel的细胞数明显低于亲本QBC939细胞，代表浸润能力的IV型胶原酶（MMP-9）分泌量下降。结论：nm23-Hl基因可以抑制胆管癌细胞的体外浸润能力。     

LPS对5-FU杀伤QBC939细胞影响的实验研究

目的 探讨LPS联合化疗药物5-FU对人胆管癌QBC939细胞生长和诱导细胞凋亡的影响。方法 四甲基唾哇蓝(MTT)试验检测LPS对5-FU抑制QBC939细胞增殖的影响, 流式细胞术观察LPS对5-FU诱导QBC939细胞凋亡的影响。结果 1MTT法检测显示5-FU对胆管癌细胞株QBC939杀伤作用明显, 但易出现耐药性, LPS可以增强5-FU后期杀伤作用, 能一定程度上防止耐药的出现;2流式细胞术结果显示化疗药物5-FU后能显著诱导QBC939细胞发生凋亡, 凋亡指数为11.50±2.15(P<0.05), 对照组为3.53±0.32, 加用LPS后, 能更明显地诱导凋亡, 凋亡指数达到26.50±3.12, 与单用加化疗药物5-FU比较, 差异有统计学意义(P<0.05)。结论 LPS能增强5-FU对胆管癌细胞株QBC939的后期杀伤作用, LPS联合化疗药物可能是胆管癌临床治疗的一种合理策略。     

腺病毒介导的p16对胆管癌细胞的生长抑制作用

目的 研究p16基因对胆管癌细胞的作用。方法 将重组体腺病毒p16转移到人胆管癌细胞QBC939,对p16基因的表达、细胞的生长抑制及机制进行分析。结果 用Ad-LacZ进行重组体腺病毒转导效率的检测,发现当MOI为100以上时,重组体朱病毒可使90%以上的培养的人胆管癌QBC939细胞被转导,用RT-PCR方法检测,在胆管癌QTBC939细胞系中p16呈低表达,重组体腺病毒能介导外源基因p16在胆管癌QBC939细胞系中高效表达,重组体朱病毒介导的p16在QBC939细胞中表达,能抑制QBC939细胞的生长和集落形成。流式细胞计数和细胞DNALadder,证实p16能诱导QBC939细胞发生凋亡并导致其发生G1期阻滞。结论 p16基因通过诱导肿瘤细胞凋亡及G1期阻滞在肿瘤的基因治疗方面发挥作用。     

TRAIL联合5-氟脲嘧啶体外杀伤胆管癌细胞作用的研究

目的:探讨肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)对人胆管癌的作用及联合化疗药物5-氟脲嘧啶(5-FU)共同作用胆管癌细胞对TRAIL抗瘤活性的影响。方法:应用四氮唑蓝快速比色(MTT)检测单独应用不同浓度TRAIL(1、10、100、1000ng/ml)及不同浓度(1、10、100、1000ng/ml)TRAIL 10mmol/ml5-FU对胆管癌细胞QBC939活性的抑制作用。结果:单独应用(1、10、100、1000ng/ml)TRAIL作用于QBC939细胞后抑制率分别为15.6%、31.2%、37.5%、40.6%(1、10、100、1000ng/ml)TRAIL 10mmol/ml5-FU作用于QBC939细胞后抑制率分别为46.9%、62.4%、68.7%、78.1%,5-FU与TRAIL联合应用对QBC939细胞抑制率明显高于单独应用TRAIL(P<0.05)。结论:TRAIL通过诱导胆管癌细胞凋亡而起到抑癌作用,化疗药物5-FU能加强TRAIL的抗癌活性。     

RhoC基因对胆管癌细胞株QBC939细胞增殖和cyclinD1基因的影响

目的研究RhoC基因对胆管癌QBC939细胞株的增殖及cyclinD1 mRNA表达的影响。方法将正、反义RhoC cDNA真核表达载体,转染人胆管癌细胞QBC939,检测细胞生长曲线,RT-PCR检测cyclinD1在QBC939细胞、转染空载体的QBC939细胞(QBC939-V)、转染正义RhoC的QBC939细胞(QBC939-S)、转染反义RhoC的QBC939细胞(QBC939-AS)的mRNA相对表达量。结果与QBC939及QBC939-V对照细胞相比,QBC939-S体外生长较快,QBC939-AS体外生长较慢,cyclinD1表达在QBC939-AS与对照组减少(P0.05),cyclinD1表达在QBC939-S与对照组增加(P0.05)。结论 RhoC可能通过调节cyclinD1来调控QBC939的增殖能力。     

p21~(waf1)-p27~(kip1)基因联合转染对乳腺癌细胞增殖和中心体复制的影响

目的 探讨外源性 p21~(waf1)-p27~(kip1)基因联合转染对人乳腺癌细胞细胞增殖及中心体复制的影响和意义.方法 应用脂质体介导法分别将构建的plRES-p27~(waf1)、p27~(kip1)、pIRES-p21~(waf1)-p27~(kip1)真核表达载体,转染入常规培养的人乳腺癌细胞系MCF-7,未转染组、转染空质粒组细胞做对照,Western免疫印迹法验证转染前后p21~(waf1)、p27~(kip1)基因蛋白表达情况;噻唑蓝(MTT)法绘制细胞生长曲线;流式细胞仪检测细胞周期DNA分布变化;免疫荧光技术检测转染前后中心体复制的变化情况.结果 Western免疫印迹法证实p27~(waf1)、p27~(kip1)、p27~(waf1)基因转染24 h后,其蛋白表达量明显增多(P<0.01),与对照组比较,各转染实验组细胞生长明显受抑制(P<0.01),细胞周期大部分停滞于G1期,各实验组G.期和S期细胞比例依次为:(69.52±3.21)%、(18.38±2.51)%,(60.83±3.02)%、(24.52±1.89)%,(78.37±2.83)%、(15.27±1.74)%,对照组则为(47.28±2.25)%、(33.52±1.97)%,中心体复制异常的乳腺癌细胞数较转染前(13.47±0.33)%明显减少:(5.07±0.38)%,(6.28±0.35)%,(3.47±23)%,两两比较差异有统计学意义(P<0.01).结论 外源性p21~(waf1)和p27~(kip1)基因转染可抑制人乳腺癌细胞的增殖及中心体的异常复制,二者联合转染时效果显著.提示,乳腺癌的发生、发展是多基因、多因素共同参与的过程,p21~(waf1)和p27~(kip1)在调控细胞增殖及中心体复制方面具有协同作用,对于p21~(waf1)、p27~(kip1)基因失活、低表达或不表达的乳腺癌,联合转染外源性p21~(waf1)、p27~(kip1)基因不失为一种有效的治疗手段.     

外源性P27kip1基因转染诱导前列腺癌细胞凋亡的实验研究

目的　探索前列腺癌基因治疗的新途径。方法　用脂质体介导 p2 7kip1基因转染前列腺癌 PC- 3 M细胞 ,SABC免疫组化法检测癌细胞外源性 p2 7kip1基因表达 ;MTT比色分析检测癌细胞体外生长活性 ;流式细胞仪 ( FCM)分析细胞周期改变 ;DNA L adder、吖啶橙 -溴化乙啶荧光染色法检测细胞凋亡。结果　发现外源性 p2 7kip1基因转移后 ,前列腺癌细胞 p2 7kip1蛋白水平显著增强 ( P<0 .0 1) ,体外生长抑制 12 .2 4%～ 3 6.5 2 % ( P<0 .0 1) ,出现 G0 / G1 期细胞周期阻滞及凋亡性“亚 G1期”峰 ,电泳可见典型的“梯状”条带 ,凋亡比率为 18.5 % ( P<0 .0 1)。结论　转染外源性p2 7kip1基因能增强对细胞周期的负性调节 ,显著诱导前列腺癌细胞凋亡 ,是前列腺癌基因治疗的潜在途径     

腺病毒介导的p53对胆管癌细胞生长的抑制作用

目的 研究Ｐ５３基因对胆癌细胞的作用。方法 将重组体腺病毒Ｐ５３转移到人胆管癌细胞ＱＢＣ９３９,用ＲＴ－ＰＣＲ、克隆形成实验、流式细胞仪、ＤＮＡ片段化分析等方法对Ｐ５３基因的表达、细胞的生长抑制及机制进行分析。结果 用Ａｄ－ＬａｃＺ进行重组体腺病毒转导致率的检测,发现当ＭＯＩ为１００以上时,重组体腺病毒可使９０％以上的培养的人胆管癌ＱＢＣ９３９,细胞被传导,用ＲＴ－ＰＣＲ方法检测,在胆管癌ＱＢＣ９     

△Np63基因沉默对膀胱癌细胞增殖和凋亡的影响及分子机制

目的探讨癌基因△Np63对膀胱癌细胞增殖和凋亡的影响,并初步探讨其可能的分子机制。方法通过将△Np63特异性短发夹RNA(△Np63-shRNA)和非特异性短发夹RNA(Control-shRNA)转染膀胱移行细胞癌(transitional cell carcinom a of bladder,TCCB)5637细胞,用半定量逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和Westernblot分别检测△Np63、p27kip1、p57kip2mRNA和蛋白的表达水平,WST-1法检测细胞增殖活性,利用流式细胞术(FCM)检测细胞周期分布,TUNEL法检测细胞凋亡情况。结果特异性的△Np63-shRNA能够有效地沉默△Np63并上调p27kip1和p57kip2的基因和蛋白水平,转染△Np63-shRNA的5637细胞的增殖能力明显受到抑制(P<0.05),且明显促进了细胞的凋亡(P<0.05)。结论靶向△Np63基因的shRNA片段可以有效的抑制人膀胱癌5637细胞的增殖并促进其凋亡,其可能的机制是通过上调p27kip1和p57kip2的表达实现的。     

外源性p27Kip1基因转染对人乳腺癌MCF-7细胞株细胞周期和增殖的影响

目的：探讨外源性p27Kip1基因对人乳腺癌MCF-7细胞株细胞周期和增殖的影响。方法：应用脂质体转染法将含人野生型p27Kip1基因质粒DNA转染乳腺癌MCF-7细胞,免疫细胞荧光化学方法验证p27Kip1基因转染MCF-7细胞后蛋白表达情况;流式细胞仪检测细胞周期的变化;细胞计数法绘制细胞生长曲线,观察外源性p27Kip1对乳腺癌细胞MCF-7生长的影响。结果：免疫细胞荧光化学方法证实p27Kip1基因转染MCF-7细胞后存在蛋白表达;流式细胞仪检测结果提示,细胞周期出现G0/G1期阻滞;细胞计数法绘制细胞生长曲线显示细胞增殖明显抑制。结论：外源性p27Kip1基因对乳腺癌MCF-7细胞生长和细胞周期有明显抑制作用。     

凋亡素基因转染对人胆管癌细胞凋亡作用的研究

目的探讨凋亡素对人胆管癌细胞凋亡的影响.方法以PCR方法获得凋亡素基因,然后运用T4连接酶将凋亡素基因和含荧光蛋白基因的质粒pAdtrack-CMV连接,通过酶切和测序证实成功构建重组质粒.再以DOTAP脂质体介导凋亡素基因转染人胆管癌细胞株QBC939.通过TUNEL染色证实凋亡素能否导致人胆管癌细胞的凋亡.结果酶切和测序均证实了成功构建含凋亡素基因和荧光蛋白基因的重组质粒.TUNEL染色显示凋亡素基因的转染引发人胆管癌细胞株QBC939的凋亡率与对照组相比具有非常显著的差异(P＜0.01).结论凋亡素能诱导培养的人胆管癌细胞的凋亡,在胆管癌的基因治疗上有深入研究的价值.     

野生型及Thr187突变型p27Kip1 蛋白对HepG2细胞周期的影响

目的p27kip1氨基端第187号位置的苏氨酸(Thr187)磷酸化位点是该蛋白分子中重要的磷酸化位点,探讨人工诱变该位点苏氨酸为丙氨酸(T187A)后对肝癌细胞株HepG2细胞周期以及细胞增殖的影响。方法应用脂质体转染法将含人野生型和突变型p27kip1基因质粒DNA转染HepG2细胞,免疫细胞荧光化学检测p27kip1蛋白的表达,并用流式细胞仪分析细胞周期的变化。结果野生型和突变p27kip1基因转染HepG2细胞后均能在细胞核表达,并且可以明显抑制细胞增殖。p27kip1基因转染的HepG2细胞发生G0期阻滞,且突变型G0期阻滞作用明显强于野生型(P<0.01)。结论转染的p27kip1能够在HepG2细胞过度表达并能抑制HepG2细胞的增殖,Thr187磷酸化位点的人工诱变可能有利于p27kip1蛋白促使细胞G0期阻滞。