多药耐药mdr-1基因体外转染兔骨髓造血细胞及其表达与功能的研究

目的：探讨浓缩病毒上清转染法在体外将多药耐药mdr—1基因转入兔骨髓造血细胞的条件及检测转染后mdr—1基因在兔骨髓造血细胞中的表达及功能。方法：用秋水仙碱(90ng／ml)筛选含人类全长mdr—1cDNA的产病毒包装细胞PA317—HaMDR1／A1后进行细胞培养并制备浓缩病毒上清。采集新西兰大白兔骨髓并分离富含造血细胞的单个核细胞。骨髓造血细胞与浓缩病毒上清及细胞因子组合共培养。采用免疫组织化学法检测转染率，PCR法检测外源性mdr—1基因的整合，柔红霉素(daunorubicin DNR)泵出试验检测导入的mdr—1基因的功能。结果：秋水仙碱筛选后，产病毒包装细胞P糖蛋白(P-g;ucp[rpteom P-gp)表达增强：外源性mdr—1基因能成功的导入兔骨髓造血细胞，转染2日、4日、6日的转染率分别为22％、37％、39％，但转染4日组细胞生长状态最好；转入的mdr—1基因能发挥药物外排泵的功能。结论：采用浓缩病毒上清转染法能成功的将外源性mdr—1基因导人兔骨髓造血细胞中并获得稳定的功能性表达，为进一步研究mdr—1基因转染骨髓造血细胞后自体回输在大剂量化疗中对骨髓保护作用的研究提供了依据。     

表达bcr-abl基因片段的可移植小鼠细胞系的生物学特性

目的建立稳定表达bcr-abl融合基因的、可移植的小鼠肿瘤细胞系,解决慢性粒细胞白血病疫苗研究的瓶颈问题。方法从重组克隆载体pGEMbcr-abl中酶切出bcr-abl融合基因片段,并将其亚克隆进反转录病毒载体pLXSN中。脂质体介导重组反转录病毒载体pLXSNbcr-abl转染包装细胞PT67,G418筛选后获得稳定产病毒的包装细胞。收集病毒感染NIH/3T3细胞,加G418筛选后进行反转录病毒滴度测定,计算病毒效价为2×107CFU/mL。收集病毒上清感染SP2/0细胞(H-2d),经G418筛选获得稳定表达bcr-abl融合基因片段的SP2/0细胞株。然后用SP2/0/bcr-abl细胞攻击同品系BALB/c小鼠,观察SP2/0/bcr-abl移植瘤生长的情况。结果经特异性PCR扩增和RT-PCR反应扩增,从基因组整合和基因表达水平证实获得了能稳定表达bcr-abl融合基因片段的鼠SP2/0细胞系。SP2/0/bcr-abl细胞能够在同品系小鼠体内形成移植肿瘤。结论该表达bcr-abl融合基因片段的小鼠肿瘤细胞系将作为研究bcr-abl基因疫苗的有效实验工具,为检验bcr-abl基因疫苗激发的小鼠CTL应答研究奠定物质基础。     

人胰岛素样生长因子-1逆转录病毒载体的构建及其在骨髓基质干细胞中的表达

目的构建人胰岛素样生长因子-1的逆转录表达载体,建立逆病毒介导的IGF-1基因转移系统。方法用逆转录-多聚酶链反应（RT-PCR）从人肝细胞克隆IGF-1的基因;经DNA测序分析证实后将目的基因插入逆转录病毒载体LXSN,制备pLXSN-IGF-1表达载体;借助阳离子脂质体转染包装细胞PA317,G418筛选阳性克隆,获取病毒上清;培养人骨髓基质干细胞,用病毒上清感染骨髓基质干细胞;采用RT-PCR及Western blot法检测目的基因在靶细胞的表达。结果经酶切电泳和DNA测序表明成功构建了IGF-1逆转录病毒表达载体,转染包装细胞后可以产生IGF-1逆转录病毒,病毒感染人骨髓基质干细胞后能够表达IGF1-1重组蛋白。结论成功建立逆转录病毒载体介导的IGF-1体外表达体系,能够快速、稳定地将IGF-1基因转入骨髓基质干细胞。     

绿色荧光蛋白和酪氨酸羟化酶在骨髓基质细胞中的表达

目的研究反转录病毒介导的绿色荧光蛋白(EGFP)基因和酪氨酸羟化酶(TH)基因在原代培养的骨髓基质细胞(bMSCs)中的表达情况。方法体外分离培养大鼠四肢骨的bMSCs,原代培养8~10 d后,同时利用含EGFP和TH基因的反转录病毒上清依次转染bMSCs并进行抗性筛选,7~10 d可得到稳定表达EGFP的bMSCs,在稳定转染EGFP后10 d进行TH病毒上清的转染,7~10 d可得到稳定表达TH和EGFP的bMSCs。结果原代培养bMSCs 3~4 d后生长至70%~80%汇合,病毒转染EGFP后第2天,细胞呈现弱荧光,经G418筛选2~3 d后出现阳性细胞,约8~10 d生长融合,阳性率60%~70%,第2~5代阳性细胞比率无明显变化。TH阳性率也达60%以上。结论利用反转录病毒载体可有效地将EGFP和TH基因转至bMSCs中,并能在体外稳定表达传代。这种表达EGFP和TH的bMSCs对于研究bMSCs的体内迁移分化及帕金森病(PD)的基因治疗具有重要意义。     

人肌细胞增强因子2A基因病毒载体构建及嗜铬细胞瘤PC12稳转细胞系的建立和鉴定

目的构建表达肌细胞增强因子2(MEF2)A基因的反转录病毒载体,并观察稳定感染嗜铬细胞瘤PC12细胞后MEF2A蛋白的表达情况。方法用EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切pcDNA3-MEF2A-flag质粒,得到MEF2-flag基因的编码序列,定向插入到pBabe-puro载体中,经扩增、筛选阳性克隆、酶切和测序验证后,转染293T细胞进行病毒包装、扩增、纯化后获取反转录病毒颗粒。将反转录病毒颗粒感染PC12细胞,经嘌呤霉素筛选后抗性克隆集落长出。采用Western印迹法检测MEF2-flag的表达情况。结果连接重组后经酶切和测序筛选出pBabe-MEF2A-flag。转染pBabe-MEF2A-flag的PC12的细胞组中MEF2A的含量为2.03±0.06,显著高于空载体对照组的1.00±0.04(P<0.01)。结论成功构建pBabe-MEF2A-flag反转录病毒载体,并建立了其稳定转染的PC12细胞系。     

提高抗人膀胱癌人-鼠嵌合抗体的表达和抗体的功能鉴定

目的 探讨人-鼠嵌合抗体ch-BD1体内和体外的表达和功能。方法 用分子生物学方法得到系列弱化表达的双氢叶酸还原酶(DHFR)基因片段,将其克隆入载体pDHL-BD1中构建得系列弱化表达DHFR基因的人-鼠嵌合抗体pWSD1-BD1,pWSD2-BD1,和pWSD3-BD1。将这些嵌合抗体以及pDHL-BD1分别转染缺陷表达DHFR基因的中国仓鼠卵巢细胞(CHO)/DHFR-细胞,以Northern印迹鉴定其DHFR基因表达水平。将不同浓度的氨甲蝶呤(MTX)加入转染细胞的培养液,测定上清中的抗体水平。用 ~(99m)标记纯化的ch-BD1,加入系列稀释的人膀胱癌EJ细胞溶液中,测定结合在细胞上的抗体放射活性,计算标记抗体的亲和常数。将人膀胱癌EJ细胞注射入3只Balb/C小鼠后肢根部,4周后对肿瘤进行放射免疫显像。将标记抗体注射入小鼠尾静脉,分别于2 h,6 h,22 h和24 h后进行放射显像。结果 构建载体的 DHFR基因表达活性由强至弱的顺序为 pDHL-BD1>pWS1-BD1>pWS3-BD1>pWS2-BD1。MTX浓度为10~(-6)mol/L时ch-BD1的表达水平与DHFR基因的基础表达水平明显相关,DHFR基础水平越高抗体的表达水平亦越高。EJ细胞与标记抗体孵育后,ch-BD1的免疫活性分数为76％,亲和常数为3.56×10~9 M~(-1);鼠单抗BD1的免疫活性分数为81％,亲和常数为1.22×10~9M~(-1)。~(99m)标记的ch-BD1经尾静脉     

真核表达载体pcDNA3.0-Cx43的构建及其在骨髓基质干细胞中的表达

目的：构建携带间隙连接蛋白connexin43(Cx43)cDNA的真核表达载体,转染骨髓基质干细胞,观察间隙连接蛋白Cx43在骨髓基质干细胞中的过量表达．方法：目的基因Cx43 cDNA在大肠杆菌中扩增后连入真核表达载体pcDNA3．0,转染大鼠骨髓基质干细胞,用G418筛选得到Cx43基因高表达的细胞;对照组为pcDNA3．0直接转染骨髓基质干细胞．结果：酶切电泳结果显示按设计构建的载体pcDNA3．0-Cx43,经G418筛选得到不同抗性的骨髓基质干细胞,免疫细胞化学显示有Cx43蛋白的表达．结论：Cx43可以在骨髓基质干细胞中表达．     

小鼠Ar18a基因逆转录病毒载体MSCV-GFP-Ar18a的构建

目的:克降小鼠Ar18a(mAr18a)cDNA,构建带有检测标签的逆转录病毒载体系统,并检测由该病毒系统介导的mAr18a基因在骨髓来源树突状细胞中的表达.方法:从培养的小鼠骨髓来源树突状细胞中提取总RNA,通过RT-PCR扩增出mAr18a基因片段,再将其克隆入pDrive克隆载体并测序.然后将mAr18a目的基因插入逆转录病毒载体MSCV-GFP中,以磷酸钙法转染294T包装细胞,收集病毒卜清感染树突状细胞后,通过流式细胞术检测mAr18a的表达.结果与结论:成功克隆了mAr18a的cDNA,并成功构建其重组逆转录病毒载体MSCV-GFP-Ar18a,该载体可有效将Ar18a基因转移到骨髓米源的树突状细胞中,转染效率达28.3%.     

2型重组腺相关病毒介导的β-地中海贫血基因治疗实验

目的探讨2型重组腺相关病毒(rAAV2)能否有效转染重型β-地中海贫血患者造血细胞,通过体外途径基因治疗地中海贫血。方法 6只BALB/c裸小鼠分为转染组(n=4)和未转染组(n=2),经X射线照射后,分别移植入经rAAV2β-珠蛋白病毒转染(MOI=50)或未转染的β41-42/β654杂合子型重型β-地中海贫血流产胎儿造血细胞,转染后第28天和第70天分别处死rAAV2转染小鼠(n=2)和未转染受体小鼠(n=1)。采用RT-PCR、等位基因特异性PCR(ASPCR)法检测rAAV2介导的人β-珠蛋白基因在小鼠骨髓中的表达,并以高压液相色谱法量化分析受体小鼠外周血中人β-珠蛋白肽链的水平。结果①RT-PCR于所有受体小鼠样本中均可检测到人β-actin和人β-珠蛋白基因的表达。②ASPCR检测中,β41-42突变基因稳定表达于所有受体小鼠,β654突变基因仅在移植后第70天受体小鼠样本中被检测到;移植后第28天,rAAV2转染及未转染小鼠体内均可检测到主要来自于β654突变基因的正常β-珠蛋白基因表达;但至移植后第70天,仅rAAV2转染小鼠骨髓样本中仍可检测到rAAV2-β-globin载体介导的正常β-...     

稳定表达Bcl-2的骨髓间充质干细胞载体的建立及对缺血性损伤保护作用的实验研究

目的 构建稳定表达Bcl-2基因的大鼠骨髓间充质干细胞(MSC)载体,观察Bcl-2基因转染对骨髓间充质干细胞生物特性的影响及体外模拟缺血性损伤的保护作用.方法 用RT-PER技术扩增小鼠Bcl-2 cDNA,慢病毒介导的基因转导骨髓间充质干细胞,转导后的细胞用Puromycin筛选,RT-PER法检测转染后Bcl-2的表达,采用血清剥夺和缺氧(SOD)处理建立MSC体外模拟缺血性损伤模型,通过流式细胞术评价转染Bcl-2基因的MSC和未转染的MSC的凋亡及存活情况.对转导Bcl-2的MSC神经诱导及检测.结果 转导Bcl-2基因的MSC经Puromycin筛选后可稳定、高效表达Bcl-2蛋白;流式细胞术检测显示:和MSC相比,转导Bcl-2基因的MSC在SOD后凋亡细胞较少,存活细胞较多.转导Bcl-2基因的MSC仍具有向神经细胞分化的潜能.结论 慢病毒介导的Bcl-2基因转导MSC有其蛋白的稳定表达,Bcl-2基因转导可对抗MSC体外模拟缺血性损伤引起的细胞凋亡,从而具有保护性作用,且不影响MSC向神经细胞分化的潜能.     

反转录病毒载体介导的人β—珠蛋白基因在小鼠体内整合和表达的？…

OBJECTIVE: To examine the in vivo properties of retroviral recombinants carrying partially deleted human beta-globin gene (delta beta) and truncated erythroid enhancer (292 bp and 341 bp of 5'HS2) at the mRNA levels following short- and long-term reconstitution in mice with infected marrow cells. METHODS: First ecotropic virus producer cell lines with higher virus titers were isolated using "ping-pong" procedures. Then the human beta-globin gene was transferred into murine hematopoietic progenitor cells and the integration and expression of transferred gene were analyzed by southern blot and RNase protection assay or RT-PCR. RESULTS: The virus titers of both recombinants increased obviously after "ping-pong" procedures. The transferred human beta-globin gene was detected in murine CFU-S12 and the expression level was about 0.5%-5% of endogenous mouse alpha-globin gene. In 3 of 14 mice surviving long-term transplanted with bone marrow cells transduced with high-titer virus, bone marrow, spleen and thymus from two mice and bone marrow and spleen from another mouse contained the intact proviral genome. Long-term expression of the transferred gene was seen in one mouse at level of 7% of endogenous murine alpha-globin gene. CONCLUSIONS: The transferred human beta-globin gene can stably integrate into murine hematopoietic stem cells mediated by retroviral vectors and express in an erythroid-specific manner.     

经转染人骨形态发生蛋白7基因后骨髓间充质干细胞mRNA的表达

目的 构建人骨形态发生蛋白（human bone morphogenetic protein7，hBMP－7）逆转录病毒载体并检测经逆转录病毒介导基因转染的兔骨髓间充质干细胞（bone marrow-derived mesenchymal stem cell,MSCs)mRNA的表达。方法 构建hBMP-7逆转录病毒载体后利用脂质介导的基因转移技术转染包装细胞PT67，制备含目的基因的重组逆转录病毒液并感染兔骨髓间充质干细胞，采用原位杂交、RT－PCR检测hBMP－7mRNA在MSCs中的表达。结果 成功构建了hBMP-7逆转录病毒载体，经hBMP－7基因转染的MSCs可表达外源性BMP－7mRNA。结论 采用逆转录病毒介导的方法可以将hBPM－7转染至MSCs中并表达外源性基因。     

小鼠造血干细胞因子基因克隆及在 C H O 细胞中的表达

目的： 克隆造血干细胞因子（ Ｓ Ｃ Ｆ）并在 Ｃ Ｈ Ｏ 细胞中表达。方法： 采用 Ｐ Ｃ Ｒ 方法从ｐ Ｒ Ｃ／ Ｃ Ｍ Ｖ（含 Ｓ Ｃ Ｆｃ Ｄ Ｎ Ａ）中钓取 Ｓ Ｃ Ｆ ｃ Ｄ Ｎ Ａ 膜外段活性区,克隆入真核表达载体ｐｃ Ｄ Ｎ Ａ３,转染入 Ｃ Ｈ Ｏ 细胞;用 Ｒ Ｔ－ Ｐ Ｃ Ｒ 方法检测 ｍ Ｒ Ｎ Ａ 水平表达及通过协同刺激骨髓细胞集落形成来检测转染细胞上清的生物活性。结果：转染 Ｓ Ｃ Ｆｃ Ｄ Ｎ Ａ 的 Ｃ Ｈ Ｏ 细胞可表达 Ｓ Ｃ Ｆｍ Ｒ Ｎ Ａ,其细胞培养上清可协同 Ｇ Ｍ － Ｃ Ｓ Ｆ刺激骨髓细胞形成集落数比 Ｇ Ｍ － Ｃ Ｓ Ｆ 单独作用高 ２ 倍,转染外源基因对细胞周期没有明显影响。结论：转染 Ｓ Ｃ Ｆｃ Ｄ Ｎ Ａ 在 Ｃ Ｈ Ｏ 细胞中表达,转染细胞上清协同 Ｇ Ｍ － Ｃ Ｓ Ｆ 刺激骨髓细胞集落的形成,而本身对集落的形成没有影响。     

HyTK基因转导联合丙氧鸟苷对鼠膀胱癌细胞的体外杀伤作用

目的　探索HyTK基因转导丙氧鸟苷 (ganciclovir,GCV)对鼠膀胱癌细胞的影响。方法　脂质体介导法将PL(HyTK)SN质粒转染PA3 17细胞 ,潮霉素B筛选 ,直到出现抗性克隆 ,扩增培养 ,NIH3T3细胞测定病毒滴度 ,用逆转录病毒上清液感染T73 9细胞 ,潮霉素B筛选 ,直到出现抗性克隆 ,扩增培养 ,命名为T73 9 TK。RT PCR对T73 9 TK细胞进行鉴定。然后观察其在体外膀胱癌细胞的杀伤作用。结果　RT PCR证实HyTK基因已插入T73 9细胞并有其mRNA的表达 ,经不同浓度GCV处理后的T73 9 TK细胞均表现出有杀伤作用 ,而T73 9细胞在各个剂量的GCV作用下生长均良好。结论　GCV对转导了HyTK基因的T73 9细胞有显著杀伤作用     

转染绿色荧光蛋白-胰岛素融合基因的小鼠骨髓间充质干细胞移植治疗糖尿病小鼠

目的:构建含增强绿色荧光蛋白(EGFP)及胰岛素融合基因的重组质粒,转染小鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs),观察转染融合基因后BMSCs移植治疗糖尿病模型小鼠的治疗效果。方法:应用重叠延伸PCR技术合成insulin-IRES-EGFP和IRES-EGFP两段序列,分别克隆至逆转录病毒载体pMSCV中,经过包装细胞PT67的包装后转染小鼠BMSCs。荧光显微镜观察转染后EGFP的表达；RT-PCR法检测转染后胰岛素基因的表达。将转染了两种质粒的BMSCs培养后分别植入两组糖尿病模型小鼠体内,观察各组受体鼠血糖及体质量等指标的变化,并以正常对照组小鼠作对照。结果:成功构建重组质粒pMSCV-insulin-IRES-EGFP、pMSCV-IRES-EGFP;倒置荧光显微镜下观察到转染后的BMSCs发出稳定的绿色荧光信号。转染了pMSCV-insulin-IRES-EGFP的BMSCs能稳定表达外源性胰岛素基因,转染后小鼠血糖明显低于转染pMSCV-IRES-EGFP组(P<0.05),但仍高于正常对照组(P<0.05)；转染后35 d体质量明显高于转染pMSCV-IRES-EGFP组(P<0.05)。结论:重构的insulin-EGFP载体能够起到良好的示踪作用,且EGFP的表达不影响胰岛素基因的表达；转染融合基因的小鼠BMSCs移植治疗糖尿病小鼠可以部分缓解小鼠糖尿病症状。     

Expression of human VEGF121 cDNA in mouse bone marrow stromal cells

目的构建人VEGF121逆转录病毒表达载体,探讨应用血管内皮细胞生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)基因治疗骨科缺血性疾患的可行性.方法采用分子克隆技术从pCDⅠ/VEGF121质粒获得hVEGF121cDNA, 并克隆到pLXSN逆转录病毒质粒.经酶切及测序鉴定正确后,包装成为pLXSN/VEGF121重组逆转录病毒, 并进行滴度测定.培养小鼠骨髓基质细胞,用重组病毒感染小鼠骨髓基质细胞.经筛选后,用PCR及RT-PCR方法测hVEGF121cDNA在基质细胞中的整合及转录;用免疫印迹及免疫组化检测VEGF121蛋白的表达;用MTT检测转基因细胞培养上清中VEGF的促人内皮细胞增殖活性.结果经酶切鉴定及基因测序证实重组逆转录病毒质粒正确,包装的病毒滴度为6×105.PCR证实基因组DNA有hVEGF121cDNA的整合;RT-PCR证实有hVEGF121mRNA的转录;Western blot及免疫组化检测有VEGF121蛋白的表达;MTT试验显示转基因细胞培养上清中VEGF121能促进人内皮细胞增殖.结论我们成功地构建了pLXSN/VEGF121重组逆转录病毒载体,该载体不仅能够有效地表达VEGF121蛋白,且表达的蛋白具有促进人内皮细胞增殖的生物学活性,这些均为进一步应用该载体研究VEGF基因治疗骨科缺血性疾患打下了基础.     

逆转录病毒载体介导的RNAi抑制Bmi-1基因表达对MCF-7细胞的影响

目的:研究RNA干扰(RNAi)抑制Bmi-1基因表达后对乳腺癌细胞株MCF-7凋亡和增殖的影响.方法:将表达Bmi-1短发夹RNA(shRNA)的重组逆转录病毒载体pSuper-retro/Bmi-1si瞬时转染MCF-7乳腺癌细胞株,携带针对绿色荧光蛋白干扰序列的载体pSuper-retro/GFPsi作为阴性对照.用RT-PCR和Western Blot分别从mRNA,蛋白水平检测Bmi-1的表达;MTT法检测细胞增殖;流式细胞术检测MCF-7细胞周期和凋亡的变化.结果:pSuper-retro/Bmi-1si明显抑制MCF-7细胞Bmi-1 mRNA及蛋白表达.与空白对照组及阴性对照组相比较凋亡细胞数无明显增加;抑制Bmi-1基因表达使MCF-7细胞G1/S周期转换及细胞增殖速率受抑制.结论:表达shRNA的重组逆转录病毒载体pSuper-retro/Bmi-1si能显著抑制乳腺癌细胞株MCF-7中Bmi-1基因表达,从而有效抑制MCF-7细胞增殖,为乳腺癌的基因治疗提供了实验依据.     

含HSVtk基因重组逆转录病毒包装细胞PA317/TK的建立

目的 :研究肿瘤的自杀基因疗法 ,建立含单纯疱疹病毒胸苷激酶 (HSVtk)基因重组逆转录病毒包装细胞PA317/TK。　方法 :应用脂质体转移方法将逆转录病毒载体GINaTK导入PA317,经G4 18筛选阳性克隆细胞后分别用PCR和扫描电镜检测HSVtk基因整合和病毒颗粒分泌情况。　结果 :逆转录病毒载体GINaTK导入PA317,G4 18后筛选得到阳性克隆细胞 ,命名为PA317/TK。PCR检测PA317/TK细胞出现一特异性 4 0 4bp阳性条带 ,而PA317细胞没有扩增出相应条带。PA317/TK细胞经扫描电镜检测见其表面有颗粒状突起 ,其周围有许多呈团状的病毒颗粒。证实含HSVtk基因重组逆转录病毒存在于包装细胞中。　结论 :成功建立含HSVtk基因重组逆转录病毒包装细胞